KR20180007572A - 말 정액 장기보존을 위한 희석제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 말 정액 장기보존을 위한 희석제에 관한 것이다. 본 발명의 방법으로 제조된 말 정액 희석제는 정자 운동성이나 정자 두부 침체 등이 손상되지 않으면서도 보존기간을 늘리는 효과가 있다.
따라서, 지금까지 보관이 곤란한 말 액상정액을 장기보존할 수 있어 혈통이 우수한 말의 품종을 보존할 수 있고, 말의 정액을 적절한 시기 및 정소에서 암말에 인공수정하여 수태율을 높일 수 있다.
따라서, 지금까지 보관이 곤란한 말 액상정액을 장기보존할 수 있어 혈통이 우수한 말의 품종을 보존할 수 있고, 말의 정액을 적절한 시기 및 정소에서 암말에 인공수정하여 수태율을 높일 수 있다.
Description
본 발명은 말 정액 장기보존을 위한 희석제에 관한 것이다.
근래 산업의 발달과 더불어 유전공학은 그 국가의 과학발전을 가늠할 수 있는 척도라 할 만큼 중요한 학문으로 자리 잡고 있으며, 이러한 유전공학은 우량 품종을 보존 개발하고, 나아가 인류의 생명을 보존하기 위해 필요한 학문으로서 기초 단계를 넘어 상당한 수준에 이르고 있다.
인간이 사육하고 있는 가축이나 애완동물의 번식을 위하여 종부를 시킬 때에 자연종부를 실시하게 되면 수컷 1마리와 암컷 1마리밖에 종부시킬 수 없으나, 액상 정액을 이용하여 인공수정을 시키면 한번 채취한 수컷의 원 정액을 희석액과 혼합하여 정액량을 증가시켜 여러 마리의 암컷에 수정을 시킬 수 있다. 따라서 인공수정에 의하면 우수한 유전형질을 가진 정액을 채취하여 동시에 여러 마리의 암컷에 수정이 가능하므로 혈통이 우수한 종자의 생산 및 순종의 보존이 가능해진다.
이러한 장점을 가지고 있는 인공수정 방법이 성공하기 위해서는 희석제의 개발이 중요한 관건이 되는데, 이에 대한 연구가 수십 년 전부터 시작되어 여러 동물 및 가축에 적용할 수 있는 정자의 동결 보존법은 개발되어 사용되고 있으나, 말의 경우 정자 생리학적 특성상 동결 보존된 정자로는 수태율이 너무 저조하여 액상 정액을 이용하여 인공수정을 하고 있는 실정이나, 정액을 액상형상으로 장기 보존할 수 있는 희석제에 대한 개발은 현재 미비한 시점이다.
국내의 말 사육 농장들은 최근 국내 승마산업의 발전으로 말의 인공수정에 대한 필요성이 높아지고 있으며 대부분의 말 사육 농장들이 인공수정을 실시하고 있다. 그러나 말의 인공수정 실용화와 확대보급을 위해서는 말 액상정액을 이용한 인공수정기술 확립이 급선무이지만, 말의 인공수정에 필요한 희석제는 대부분 외국산을 도입하여 이용하고 있거나 희석제 제조기술을 전수 받아서 국내에서 제조하는 복제사용에 의존하고 있는 실정이며, 국내의 연구진에 의해 실험실에서 제조된 희석제는 계란의 노른자(난황), pH 보존제, 대사성 영양소가 첨가된 정도이며 이 역시 보존기간이 3~4일 미만인 실정이다.
따라서, 수태율 및 분만율 등의 측면에서 자연 종부와 비교하여 열등하지 않으며 산업화가 가능한 말 정액의 인공수정용 희석제의 개발이 강력하게 요구되어 왔으나, 아직까지 말 정액을 오랫동안 보존할 수 있는 말 정액 희석제에 대한 연구는 미미한 실정이다.
이에 본 발명자들은 말의 인공수정에 사용되는 말 액상정액을 정자 운동성이나 정자 두부 침체 등에 손상되지 않으면서도 보존기간을 늘려 말 정액을 장기간 사용할 수 있는 방법을 찾고자 노력하던 중, 채취된 말 정액을 에너지원인 라피노오스와 비타민E가 포함된 희석제에 희석 시, 체외로 사출된 정자가 처하는 여러 유해 환경을 개선해 주어 생존성과 활력을 보존시킴으로써 정액보존 시간을 연장시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 증류수 100ml 당 라피노오스(Raffinose)를 0.1 ~ 10 g의 양으로 함유하는 것을 특징으로 하는, 말 정액 희석제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 증류수 100ml 당 라피노오스(Raffinose) 0.1 ~ 10 g, 글루코스(Glucose) 20 ~ 45g, 탈지유 1 ~ 20g 및 HEPES 1 ~ 10g을 포함하는 것을 특징으로 하는, 말 정액 희석제를 제공하는 것이다.
나아가 본 발명의 다른 목적은 상기 말 정액 희석제로 말 정액을 희석시키는 것을 포함하는, 말 정액 장기 보존 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 증류수 100ml 당 라피노오스(Raffinose)를 0.1 ~ 10 g의 양으로 함유하는 것을 특징으로 하는, 말 정액 희석제를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 말 정액 희석제는 라피노오스(Raffinose) 외에 글루코스(Glucose), α-Lactose, 탈지유 및 HEPES로 구성된 기본용액을 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 기본용액은 증류수 100ml 당 글루코스(Glucose) 20 ~ 45g, α-Lactose 0.1 ~ 5g, 탈지유 1 ~ 20g 및 HEPES 1 ~ 10g으로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 증류수 100ml 당 라피노오스(Raffinose) 0.1 ~ 10 g, 글루코스(Glucose) 20 ~ 45g, α-Lactose 0.1 ~ 5g, 탈지유 1 ~ 20g 및 HEPES 1 ~ 10g을 포함하는 것을 특징으로 하는, 말 정액 희석제를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 말 정액 희석제는 겐타마이신(gentamycin), 네오마이신(neomycin) 및 아프라마이신(apramycin)으로 구성된 군중에서 선택된 항생제 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
나아가 본 발명은 상기 말 정액 희석제로 말 정액을 희석시키는 것을 포함하는, 말 정액 장기 보존 방법을 제공한다.
본 발명의 방법으로 제조된 말 정액 희석제는 정자 운동성이나 정자 두부 침체 등이 손상되지 않으면서도 보존기간을 늘리는 효과가 있다.
따라서, 지금까지 보관이 곤란한 말 액상정액을 장기보존할 수 있어 혈통이 우수한 말의 품종을 보존할 수 있고, 말의 정액을 적절한 시기 및 정소에서 암말에 인공수정하여 수태율을 높일 수 있다.
도 1은 본 발명의 말 정액 희석제로 희석한 정자의 총 운동성 및 직진운동성을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 말 정액 희석제로 희석한 정자의 정자 생존율을 확인한 결과이다.
도 3은 정자팽창의 유형을 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명의 말 정액 희석제로 희석한 정자의 정자 원형질막 온전성을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 말 정액 희석제로 희석한 정자의 미토콘드리아 막 전위변화를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 말 정액 희석제로 희석한 정자의 정자 생존율을 확인한 결과이다.
도 3은 정자팽창의 유형을 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명의 말 정액 희석제로 희석한 정자의 정자 원형질막 온전성을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 말 정액 희석제로 희석한 정자의 미토콘드리아 막 전위변화를 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<
실시예
1>
말 정액 희석제의 제조 방법
본 발명자들은 다음과 같은 조성을 갖는 혼합물을 혼합기를 이용하여 균일하게 혼합하여 말 정액 희석제를 제조하였다.
증류수 100ml 당 글루코스(Glucose) 37 g, 라피노오스(Raffinose) 3.7 g, α-Lactose 2.8 g, 탈지유(Skim Milk) 9.46 g, HEPES 4.76 g가 함유하도록 잘 섞어주었다.
상기 제조한 희석제를 이용하여 신선하게 채취된 정액을, 희석액 1ml 당 200만개의 정자로 희석시켰다. 이 때, 상기 정액의 채취 과정은 당업자에게 명백한 사항이라 자세한 내용은 생략한다.
<
실시예
2>
본 발명의 말 정액 희석제가
정자활력에
미치는 영향 테스트
본 발명의 말 정액 희석제가 정자활력에 미치는 영향을 확인하기 위하여 대조군으로써 국제적으로 가장 많이 사용되고 있는 INRA96(IMV technologies)와 CA16(본 발명 말 정액 희석제인 SM과 비타민E와 에너지 원료인 라피노오즈 원료를 제하면 동일한 성분이 들어 있는 제품)를 사용하였으며, 본 발명의 말 정액 희석제는 SM으로 표시하였다.
<2-1>
정자 운동성 테스트
정자 활력 검사를 위해 정자의 에너지원인 정자 내 미토콘드리아 활성을 조사하였다. 구체적으로, 200x 현미경하에서 기본적인 활력을 관찰한 후 보다 정확하고 객관적인 활력 검사를 위해 미토콘드리아 막을 특정하게 염색할 수 있는 Rhodamine-123(미토콘드리아 기능이 정상인 세포는 블루 레이저 광원(488 ㎚) 에 의해 녹색형광을 발광하고 575/26 ㎚ 파장영역에서 형광 시그널이 집광됨) 형광 염료와 아울러 사멸한 정자를 선별하기 위하여 propidium iodide 형광염료를 각각 실온에서 10분간 염색하여 정자 내 미토콘드리아 기능을 평균 20,000개의 정자를 유세포 분석기를 이용하여 보존 시간경과별로 비교 검사하였다.
그 결과, 본 발명의 말 정액 희석제의 경우 SM 군과 비교하였을 때 월등히 높은 운동성을 보였을 뿐 아니라, 양성 대조군인 INRA96과 비교하여 비슷한 수준의 정자 운동성을 보임을 확인할 수 있었다(도 1 참조).
<2-2>
정자 생존율 테스트
정자세포의 생존율 검사는 200 x 현미경상에서 기본적인 관찰을 실시한 후, 보다 객관적이고 정확한 분석을 위하여 생사염색을 실시하여 유세포 분석기 (flowcytometer)로 분석하였다. 구체적으로, 희석된 정자세포의 각 군을 보존시간 경과별로 SYBR-14 형광염료 {살아있는 세포는 블루 레이저 광원(488 ㎚)에 의해 녹색의 형광을 발광하며 530/30 ㎚ 밴드필터에 의하여 형광 시그널이 집광됨 }와 프로피디움 요오드화물(propidium iodide) 형광염료 {사멸된 세포는 블루 레이저 광원(488 ㎚) 에 의해 빨강색의 형광을 발광하며 610/20 ㎚ 밴드필터에 의하여 형광 시그널이 집광됨 }을 5분간 실온에서 염색하여. 유세포 분석기에 옮겨 평균 20,000만개의 정자에서 녹색 및 빨강색 형광 비율을 분석하여 보존 시간 경과별 정자의 생존비율을 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 말 정액 희석제의 경우 SM 군과 비교하였을 때 월등히 높은 정자 생존율을 보였을 뿐 아니라, 양성 대조군인 INRA96과 비교하여 비슷한 수준의 정자 생존율을 보임을 확인할 수 있었다(도 2 참조).
<2-3>
정자 원형질막
온전성
확인
정자 원형질막 온전성 확인을 위하여 Hypo-Osmotic Swelling Test를 실시하였으며, 그 방법은 하기와 같다.
액상정액을 1.5ml eppendroup tube에 담아 500×g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 버리고 아래 남은 정자괴에 150mOsm/kg의 저삼투압액 [5차 증류수 1000ml 내에 fructose(Sigma, USA) 13.51mg, sodium citrate 7.35mg] 1ml 넣고 37℃에서 30분간 배양하였다. 배양 후 슬라이드 위에 10㎕ 정도를 취하여 위상차현미경하에서 슬라이드당 200개 이상의 정자를 조사하였다.
정자팽창의 유형은 도 3과 같이 분류하였다. 미부가 전혀 팽창되지 않은 경우는 a, 미부 말단만 팽창된 경우로 미부의 굴곡이 없으면 b, 굴곡이 있으면 c로 판독하였으며, 미부 중간 부위와 말단이 동시에 팽창된 경우는 d, 미부 중간 부위만 팽창된 경우는 e, 미부가 전반적으로 팽창된 막대모양은 f, 미부가 전반적으로 팽창된 눈사람 형태는 g로 구분하였다. HOST 후 정자 미부가 변화된 정자의 비율은 판독한 정자의 총수에서 미부가 변화된 b~g 유형의 비율로 계산하였다.
그 결과, 본 발명의 말 정액 희석제의 경우 SM 군과 비교하였을 때 월등히 높은 정자 원형질막의 온전성을 보였을 뿐 아니라, 양성 대조군인 INRA96과 비교하여 비슷한 수준의 정자 원형질막의 온전성을 보임을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
<2-4>
미토콘드리아 막 전위변화 조사
본 발명의 말 정액 희석제에 의한 미토콘드리아의 막전위 변화를 조사하기 위하여 JC-1 염색 및 Rhodamine123 염색을 시행하였다.
상기 JC-1 염색은 미토콘드리아의 막전위 변화 연구에 주로 이용되는 실험 방법으로서, 정상 세포내에서는 JC-1 dye가 미토콘드리아에 레드 형광을 띠며 축적되나, 아톱토시스(apotosis)가 일어난 세포에서는 세포질에 그린(green) 형광으로 남게 되는 특징이 있다.
또한, Rhodamine 123 염색 방법은 하기와 같다.
1 μM Rhodamin123과 2.4 μM PI stock solution을 준비한 후, 정액 100 μl에 Rhodamine123을 1 μl를 넣고 10분간 배양 후 PI를 1 μl를 넣고 다시 10분간 배양하였다. 그 후 1500rpm에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거한 뒤 1 ml의PBS 첨가 후 Flow cytometry(BD, FACS Calibur)를 이용하여 분석하였다.
JC-1 염색과 Rhodamine 123 염색을 시행 후 형광현미경 관찰 결과를 분석한 결과, 본 발명의 말 정액 희석제의 경우 SM 군과 비교하였을 때 월등히 높은 수준으로 미토콘드리아 막 전위변화가 잘 유지되었을 뿐 아니라, 양성 대조군인 INRA96과 비교하여 비슷한 수준으로 미토콘드리아 막 전위변화 정도를 보임을 확인할 수 있었다(도 5 참조).
기존 수태율을 높이기 위하여 비싼 수입산 말 정액 희석제를 사용하였는데 본 발명의 방법으로 제조된 말 정액 희석제의 경우 보존 시간경과에 따른 정자 세포막 지질의 산패로 인한 정자의 생존율 및 운동성, 정자 DNA 손상에 있어 종래에 개시된 국내 말 정액 희석제에 비하여 월등히 좋을 뿐 아니라, 비싼 수입산 말 정액 희석제와 유사한 효과를 보여 수입한 말 정액 희석제를 대체할 수 있는 효과가 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (6)
- 증류수 100ml 당 라피노오스(Raffinose)를 0.1 ~ 10 g의 양으로 함유하는 것을 특징으로 하는, 말 정액 희석제.
- 제1항에 있어서,
상기 말 정액 희석제는 라피노오스(Raffinose) 외에 글루코스(Glucose), α-Lactose, 탈지유 및 HEPES로 구성된 기본용액을 포함하는 것을 특징으로 하는, 말 정액 희석제. - 제2항에 있어서,
상기 기본용액은 증류수 100ml 당 글루코스(Glucose) 20 ~ 45g, α-Lactose 0.1 ~ 5g, 탈지유 1 ~ 20g 및 HEPES 1 ~ 10g으로 포함되는 것을 특징으로 하는, 말 정액 희석제. - 증류수 100ml 당 라피노오스(Raffinose) 0.1 ~ 10 g, 글루코스(Glucose) 20 ~ 45g, α-Lactose 0.1 ~ 5g, 탈지유 1 ~ 20g 및 HEPES 1 ~ 10g을 포함하는 것을 특징으로 하는, 말 정액 희석제.
- 제4항에 있어서,
상기 말 정액 희석제는 겐타마이신(gentamycin), 네오마이신(neomycin) 및 아프라마이신(apramycin)으로 구성된 군중에서 선택된 항생제 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 말 정액 희석제. - 제1항의 말 정액 희석제로 말 정액을 희석시키는 것을 포함하는, 말 정액 장기 보존 방법.
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| CN110393183A (zh) * | 2018-04-24 | 2019-11-01 | 天津农学院 | 稀释剂及其制备方法和在猪精液常温保存中的应用 |
| CN110583630A (zh) * | 2019-10-22 | 2019-12-20 | 山东畜牧兽医职业学院 | 一种驴的精液稀释液及其制备方法 |
| KR20220032222A (ko) | 2020-09-07 | 2022-03-15 | 이태화 | 한국 노리개 모양을 활용한 빛굴절 인테리어용품, 썬캐쳐 |
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| KR101089740B1 (ko) | 2009-08-21 | 2011-12-07 | 강원대학교산학협력단 | 돼지 정액의 동결보존방법 |
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-
2016
- 2016-07-13 KR KR1020160088776A patent/KR101979981B1/ko active Active
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