KR101089740B1

KR101089740B1 - 돼지 정액의 동결보존방법

Info

Publication number: KR101089740B1
Application number: KR1020090077765A
Authority: KR
Inventors: 박춘근; 이용승; 유한준
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2009-08-21
Filing date: 2009-08-21
Publication date: 2011-12-07
Also published as: KR20110020066A

Abstract

본 발명은 돼지 정액의 동결보존방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 돼지 희석정액을 CLC(cholesterol-loaded cyclodextrin)로 처리하여 정자막내 콜레스테롤 유입시켜 동결과정 중 냉각과정에서 발생되는 막손상을 보호하는 돼지 정액의 동결보존 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, CLC를 이용하여 콜레스테롤을 돼지 정자의 막에 유입시키면 동결보존과정 중 발생되는 냉각충격으로부터 돼지 정자의 첨체 막 및 막 단백질을 더욱 효과적으로 보호할 수 있다. 따라서, 동결보존 시 돼지 정자에 콜레스테롤의 첨가는 돼지 정자의 동결보존 기술을 향상시킬 수 있다.

콜레스테롤, 돼지 정자, 동결보존, 첨체 반응, CLC

Description

돼지 정액의 동결보존방법 {A method for cryopreservation of boar semen}

본 발명은 돼지 정액의 동결보존방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 돼지 희석정액을 CLC(cholesterol-loaded cyclodextrin)로 처리하고 다시 CLC를 제거한 후 동결하는 돼지 정액의 동결보존 방법에 관한 것이다.

동결보존(cryopreservation)은 실험 및 인공수정(artificial insemination, AI)을 위한 정자 세포의 유용성을 확장시킨다. 다양한 기술적 제약에도 불구하고, 정자에의 접근가능성은 인공수정 및 시험관내 수정(in vitro fertilization, IVF)의 발전을 가능케 하였다. 그러나, 동결-융해된 정자는 신선 정자(fresh sperm)와 같은 동일한 수정능(fertilizing potential)을 가지지 못하는데, 이는 22℃에서 1℃로 냉각되는 동안 냉각 과정이 세포 막 내 지질 및 단백질 재배열을 유도하기 때문이다 (Parks J.E., et al., 1992. Theriogenology 38: 209-222). 이러한 변이는 저온에서 액상에서 겔상으로 변화하는 막에 의해 유도된다. 이는 동결보존 시 정자의 생존력 및 수정능을 감소시키는 주된 원인 중 하나이다. 특히, 돼지 정자는 다 른 가축의 정자와는 달리 동결보존 시 냉각에 의한 “저온 쇼크(cold shock)”에 극도로 취약하다. “저온 쇼크” 손상에 대한 정자의 감수성은 막에서 인지질 구성과 인지질에 대한 콜레스테롤의 비율에 의해 결정된다 (Holt W. V, 2000. Ani. Reprod. Sci. 62:3-22). 그 중에서도 정자 막의 콜레스테롤/인지질 비율은 동결보존 시 막 유동성 및 안정성에 있어서 주요 결정인자이다. 인간 및 토끼 정자와 같은, 매우 높은 콜레스테롤/인지질 비율을 가지는 종에서 얻은 정자는 냉각될 때 이러한 막 손상을 겪지 않았다 (Darin-Bennett A, et al., 1977. Cryobiology 14: 466-470). 막 손상은 세포 사멸에 대한 주요 원인 중 하나로 여겨지고 있다 (Watson P. F, 1981. Academic Press, NewYork, pp.189-218).

막의 주요 구성 요소인, 콜레스테롤은 막 기능의 조절과 같은 중요한 역할을 한다 (Yeagle P. L, 1985. Biochim. Biophys Acta. 822:267-287). 더욱이, 세포막에서 콜레스테롤은 막 유동성(Hartel S, et al., 1998. Anal. Biochem. 258:277-284) 및 투과성(McGrath J. J, 1988. ASMEPress BED-Vol 10, HTD-Vol98; 91-111)의 주요 결정인자로 알려져 있다. 또한, 콜레스테롤은 막의 전이온도를 낮추고, 낮아진 온도에서 그들을 액상으로 유지시켜 저온에서 발생하는 막손상을 감소시킨다 (Amann R. P, et al., 1987, J. Equine Vet. Sci. 7:145-173).

콜레스테롤은 사이클로덱스트린을 이용하여 어렵지 않게 세포의 막에 유입되거나 또는 막으로부터 유출될 수 있다 (Zeng W. X, et al., 2001. J Androl 22: 111-118). β(1-4) 글루코피라노즈 유닛들로 구성된 사이클릭 헤파사카라이드(cyclic heptasaccharides)인, 사이클로덱스트린은 수용성이지만 소수성 중심을 가지며, 콜레스테롤을 농도 구배를 따라 막 내로 또는 밖으로 수송할 수 있다 (Klein U, et al., 1995. Biochemistry 34:13784-13793). 콜레스테롤은 콜레스테롤-적재된 사이클로덱스트린(cholesterol-loaded cyclodextrin, CLC)으로 동결보존 시 소 정자의 막에 적재하면, 융해 후 적재되지 않은 정자와 비교하여 운동성 및 막 손상되지 않은 정자의 퍼센트는 더 높게 회복되었다 (Purdy P. H, et al., 2004. Cryobiology 48: 36-45). 반면, 이러한 과정은 돼지 정자에 대해서는 최적화되지 않았다. 또한, 특히 첨가된 콜레스테롤이 정자의 동결생존(cryosurvival)과 막 전반에 걸친 생리기능에 어떠한 영향을 미치는지를 알지 못한다.

한편, 돼지 정자는 인간, 소와 같은 다른 종 보다 동결보존과 관련된 일에 더 민감하다. 동결보존은 정자에 대하여 막의 불안정화, 삼투압 스트레스, 저온쇼크, 및 세포내 결빙현상을 포함하여 많은 스트레스를 유발한다. 특히, 세포 사멸은 동결과정 동안 세포내 빙정(ice crystals)의 형성 및 막 손상에 의해 유발된다 (Mazur P, 1977. Cryobiology 14:251-272; Steponkus P. L, et al., 1983. Cryobiology 20:448-465). 막 불안정화(membrane destabilization)는 온도가 감소함에 따라, 막이 액상(fluid phase)에서 겔상(gel phase)으로 상전이(phase transition)를 일으킬 때 발생한다. 이러한 상전이 동안, 인지질이 원형질막(plasma membrane)에서 떨어져 나가 증가된 막 투과성, 막 붕괴, 및 세포 사멸을 초래한다 (Darin-Bennett A, et al., 1973. J. Biol. Sci. 26:1409-1420; Watson P. F, 1981. Academic Press, New York, pp. 189-218). 막 지질 상전이가 발생하는 온도가 낮춰질 수 있다면, 또는 막 상전이가 완전히 제거될 수 있다면, 막들은 저 온에서 액으로 남아 있게 되어 상전이를 일으키는 막에서 발생하는 손상은 감소될 수 있다.

이전 연구들은 원형질막의 콜레스테롤/인지질 비율이 동결보존 시 원형질막 유동성 및 안정성의 주요 결정인자임을 나타낸다 (Watson P. F, 1981. Academic Press, NewYork,pp.189-218; Darin-Bennett A, et al., 1977, Cryobiology 14: 466-470). 또한, 콜레스테롤은 막들의 전이온도를 낮추고, 낮아진 온도에서 그들을 용액 상태로 유지시킴으로써, 저온에서 발생하는 막 손상을 감소시킨다 (Amann R. P, et al., 1987. J. Equine Vet. Sci. 7:145-173). 콜레스테롤은 사이클로덱스트린을 이용하여 세포의 원형질막에 쉽게 유입되거나 또는 추출될 수 있다. 콜레스테롤을 사이클로덱스트린에 적재하고(CLC) CLCs를 동결보존 전 소 정자에 첨가하면, 융해 후 처리되지 않은 정자와 비교하여 운동성 및 막 손상되지 않은 정자의 퍼센트는 더 높게 회복되었다 (Purdy P. H, et al., 2004. Cryobiology 48: 36-45). 또한, CLCs로 처리된 종마 정자에 대한 유사한 결과가 보고 되어 있다 (Moore A. I, et al., 2005. Cryobiology 51:241-249). 따라서, 본 발명은 돼지 정자의 동결보존 시 CLC를 적용시켜 동결 후 생존(cryosurvival)을 개선시킨다.

콜레스테롤은 정자 막의 안정화에 중요한 역할을 한다. 특히, 정자의 수정능획득(capacitation) 시, 막은 콜레스테롤을 상실하고 (Ehrenwald E, et al., 1988. Gamete Res. 20:413-420), 더욱 불안정한 막 구조를 갖게 함으로써 첨체반응을 가능하게 한다. 정자 수정능획득은 정자 막에서 콜레스테롤 유출로 유도될 수 있다 (Choi Y. H, et al., 1998. Biol. Reprod. 59 :1328-1333). 유사하게, 정자가 냉 각 또는 동결되면, 막들은 상전이가 일어나는데, 이는 막 지질과 단백질의 재배열 (Parks J. E, et al., 1992, Theriogenology 38: 209-222), 및 막으로부터 지질의 소실을 초래하고 (Darin-Bennett A, et al., 1973. J. Biol. Sci. 26:1409-1420), 차례로, 막 내 단백질과 지질 응집 및 막-선택적 투과성의 소실을 유발함으로써 (Buhr M. M, et al., 1989. Gamete Res. 23:441-449), 정자의 조숙한 수정능획득이 일어나게 한다 (Cormier N, et al., 1997. J. Androl. 18:461-468). 이러한 조숙한 수정능획득은 정자의 수정 및 수명의 감소를 초래한다 (Cormier N, et al., 1997. Androl. 18:461-468).

본 발명에서는 돼지의 정자 막에서 냉각 쇼크 손상의 분석을 위한 웨스턴 블로팅에 의해 정자에서 HSP90의 발현을 관찰하였다. Hsp90(heat shock protein 90)은 분자 샤페론(molecular chaperone)이며 세포에서 발현되는 가장 풍부한 단백질 중 하나이다 (Csermely P, et al., 1998. Pharmacol. Ther. 79 (2): 129-168). 열 쇼크 단백질의 한 종류로 스트레스에 반응하여 상향조절된다. Garcia-Gardena 등 은 HSP90이 산화질소합성효소(nitric oxide synthase, NOS)를 활성화시킬 수 있으며 (Garcia-Gardena G, et al., 1998. Nature. 392:821-824), NOS는 정자 운동성에 유익하다고 보고하였다 (Lewis S. E, et al., 1996. Mol. Hum. Reprod. 2:873-878). HSP90이 정자 운동성의 증가를 포함하여, 프로게스테론(progesterone) 기능을 조절하는 역할을 하는 것으로 여겨진다 (Andersen C. Y, et al., 1995. Hum. Reprod. 10:3183-3185).

냉각 과정 및 동결 과정 시, 활성산소종(reactive oxygen species)은 인간 정자 세포에서 현저하게 증가한다 (Mazzilli F, et al., Acta. Eur. Fertil. 26:145-148). 활성산소종의 생성은 융해-후 정자 운동성 및 생명력의 회복의 감소 원인으로 여겨진다. HSP90은 산화적 스트레스로부터 세포들을 보호하는 것으로 보고되어 있다 (Conconi M, et al., 1996. Arch. Biochem. Biophys. 331:232-240). 동결된 돼지 정액의 제조 시 산화적 스트레스에 대한 HSP90의 보호 역할을 확인하는 것이 남아있다. 또한 최근 연구는 HSP90이 ATP 대사작용에 관련이 있음을 증명하였다 (Prodromou C, et al., 1997. Cell 90: 65-75). Watson은 냉각 쇼크 후 ATP 수준이 감소하고 재합성되지 않는다고 보고하였다 (Watson P. F, 1981. Academic Press, NewYork, pp. 189-218). ATP 수준의 감소는 정자 운동성의 감소를 초래한다. 따라서, 냉각 과정 시 HSP90의 감소는 ATP 소모메커니즘에 의한 정자 운동성의 쇠퇴를 유발할 수 있다.

GPI(glucose phosphate isomerase), LDH(lactate dehydrogenase) 및 GOT(glutamate-oxalacetate transaminase)와 같은 몇몇 해당효소들(glycolytic enzymes)은 저온 쇼크 후 돼지 정자로부터 세포외부 배지로 누출되는 것이 밝혀졌다 (Harrison R. A. P, et al., 1972. J. Reprod. Fertil. 30:105-115; Pursel V. G, et al., 1970. Cryobiology 7: 141-144). 또한 막 단백질들은 동결-융해 과정 시 소실되는 것으로 관찰되었다 (Ollero M, et al., 1998. Theriogenology 49:547-555). Huang은 HSP90의 감소가 동결 정액의 특성에 대한 지시자로 사용됨을 제안하였다 (Huang S. Y, et al., 1999. Theriogenology. 51:1007-1016).

따라서, 본 발명은 동결-융해된 돼지 정자의 확장된 유용성을 가능케 하는 사이클로덱스트린을 이용하여 정자 능력에 대한 콜레스테롤의 효과 및 동결보존 전 동결손상으로부터 돼지 정자 보호의 효과를 확인하기 위한 것이다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 동결보존 시 동결손상으로부터 돼지 정자의 첨체 막 및 막 단백질을 효과적으로 보호할 수 있는 돼지 정액의 동결보존방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 돼지 정액의 동결보존 방법을 제공한다:

a) 돼지 정액을 희석제로 희석하는 단계;

b) 상기 돼지 희석정액을 CLC(cholesterol-loaded cyclodextrin)로 처리하는 단계;

c) 상기 CLC 처리된 희석정액에서 CLC를 제거하는 단계; 및

d) 상기 CLC가 제거된 희석정액을 동결하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 a) 단계의 희석제는 정자의 생육능력을 보존하기 위해 정액 희석제로 알려져 있는 화합물들(예컨대, BTS, MODENA, ANDROPE, KIEV, MR-A, ZORPVA, Mullbery)을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 돼지 정액 희석제인 모데나(Modena)를 사용하는 것이 적당하다. 본 발명의 실시예에서는 상기 모데나의 조성을 약간 변형하여 m-Modena B(Lee S. H, et al., 2005. Reprod Dev Biol 29:247- 252 참조)를 사용하였다.

본 발명에 있어서, 상기 b) 단계의 희석정액은 준비된 신선정액과 동량의 희석제로 희석할 수 있으며, 바람직하게는 ml 당 1.2×10⁸ sperm의 농도를 가지도록 희석될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 b)단계에서 CLC 처리는 CLC 0.5-2.0 mg/ml로 20-30℃에서 10-20분간 수행될 수 있으며, 바람직하게는 CLC 1.5 mg/ml로 25℃에서 15분간 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 c)단계에서 CLC 제거는 300×g 내지 500×g에서 5-20분간 원심분리 함으로써 수행될 수 있으며, 바람직하게는 400×g에서 10분간 원심분리 함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 핵심기술은, 돼지 정자의 동결보존 시 콜레스테롤을 정자막 내로 안전하게 유입시켜 돼지 정자의 냉각충격을 완화시키는 것이다. 돼지 이외의 다른 종(소, 인간 등의 정자)에서는 동결보존액에 콜레스테롤을 포함시켜 정액에 처리하여 동결하는 방법이 알려져 있긴 하지만 돼지의 경우에서는 동결보존액에 남아있는 콜레스테롤이 정자의 생존력, 특히 수정능에 악영향을 미쳐 이를 동일하게 적용시킬 수 없었다. 그러나 본 발명의 방법을 이용하면, 동결보존 전 CLC를 이용하여 콜레스테롤을 정자 막내로 일정 농도만을 유입시킨 후 더 이상의 콜레스테롤이 정자 세포에 영향을 미치지 못하도록 CLC를 제거한 후 동결보존을 수행하였다. 이렇게 하면 돼지 정액의 동결보존에 최적화된 콜레스테롤을 유지시킬 수 있다.

본 발명에서, 상기 CLC는 동결보존 전 정액에 처리되는데 CLC 처리에 의해 정자막 내로 콜레스테롤이 용이하게 유입될 수 있다. 유입된 콜레스테롤은 특이하게 일정 농도, 1.2×10⁸ sperm 당 1.5 mg에서 생존력이 매우 잘 보존되며, 그 이상의 농도가 정자막 내로 유입되면 정자 생존력이 더 낮아지게 된다.

구체적으로 본 발명의 실시예 5에서는, CLC로 처리된 돼지 정자의 생존력 및 첨체 상태는 MBCD로 처리되거나 또는 처리되지 않은 정자보다 높은 비율로 나타났다. 또한 돼지 정자의 동결보존을 위한 CLC의 최적 농도는 1.2×10⁸ sperm 당 CLC 1.5 mg이었는데, CLC 농도 1.2×10⁸ sperm 당 1.5 mg 이상으로 처리되는 경우, CLC는 정자 세포 생존에 해가 되었다 (도 5 참조). 이는 아마도, 정상적인 막 기능이 CLC를 최적 농도보다 높은 농도로 추가로 인해 동결 동안 정자를 사멸에 이르게 하는데 영향을 미친다는 점에서 막 유동성 및 막 기능에 악영향을 미치는 것으로 보인다.

또한 첨체에 대한 콜레스테롤의 효과에 있어서, 형광 표지된 콜레스테롤로 처리된 정자 세포의 현미경사진(도 2)은 첨체 막 구획에서 높은 콜레스테롤 유입을 보이며, 그로 인해 동결손상(cryodamage)에 의한 조숙한 수정능획득을 감소시키게 된다 (도 5 참조). 첨가된 콜레스테롤이 세포에 어떻게 영향을 끼치는지를 이해하기 위해, 이러한 콜레스테롤이 세포내 어디에 위치하는지를 아는 것이 중요하다. 형광으로 표지된 콜레스테롤로 처리된 정자세포의 현미경사진은 첨가된 콜레스테롤 이, 오로지 하나의 막 구획(membrane compartment)이 아닌, 정자 원형질막 전체를 통해 유입된다는 것을 보여준다. 이러한 데이터는 중요하며, 첨가된 콜레스테롤이 원형질막 구획들 전체에 유입되고, 따라서 각각의 막 구획 (첨체, 첨체 뒤 헤드 영역(postacrosomal head region), 중편(midpiece) 및 주편(principal piece))은 첨가된 콜레스테롤에 의해 영향을 받게 됨을 나타낸다. 그러나, 서로 다른 양의 콜레스테롤이 다양한 막 구획들에 유입된다는 것은 분명하다. 각각의 막 구획에 얼마나 많은 콜레스테롤이 유입되었는지를 결정하는 것은 이러한 연구의 범위밖에 있었다. CLC 처리 시 첨체의 막 구획들에서 더 높은 콜레스테롤 유입이 나타난다. 그 결과, 정자는 첨체 막을 동결손상으로부터 효과적으로 보호할 수 있다. 따라서, 본 발명의 결과는 동결보존 시 돼지 정자의 HSP90가 감소됨을 나타낸다 (도 6 참조). 그러나 콜레스테롤이 첨가된 정자는 처리되지 않은 정자보다 더 많은 양의 HSP90를 나타내었다. 또한, 콜레스테롤이 돼지 정자의 냉각 과정 시 MBCD에 의해 세포막으로부터 유출되는 경우 더욱 감소되었다. 따라서, 콜레스테롤은 동결보존 시 저온 쇼크 손상에 의한 스트레스로부터 정자 막을 보호할 수 있다.

결론적으로, 돼지 정자의 막에서 콜레스테롤의 역할은 동결보존 전 동결손상으로부터 돼지 정자의 첨체 막 및 막 단백질을 더욱 효과적으로 보호하는 것이다. 따라서, 동결보존 시 돼지 정자에 콜레스테롤의 첨가는 돼지 정자의 동결 기술을 향상시킬 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, “첨체”는 정자 머리의 앞쪽 반을 덮고 있고 난자 침투에 필요한 효소를 함유하는 부분으로 간주한다. 또한 용어 “수정능획득” 은 정자의 난자 침투를 용이하게 하는 첨체 효소의 방출을 야기하는 첨체 표면에서의 효소적 변화와 같은, 난자를 수정시키는 능력을 발달시키기 위해 정자가 겪는 특이적 변화로 간주한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. CLC의 제조

CLC(Cholesterol-Loaded-Cyclodextrins)는 퍼디 등의 방법(Purdy P. H, et al., 2004. Cryobiology 48: 36-45)에 따라 제조되었다. 튜브(glass round tube)에서 메틸-베타-클로로덱스트린 용액(methyl-β-cyclodextrin, MBCD, Sigma) 1 g를 메탄올 2 ml에 녹였다. 두 번째 튜브에서, 콜레스테롤(Sigma, water soluble) 200 mg을 클로로포름 1 ml에 녹인 후, 이러한 콜레스테롤 용액(200 mg/ml 클로로포름) 0.45 ml을 상기 메틸-베타-클로로덱스트린 용액(500 mg/ml 메탄올)에 첨가하여, 혼합물을 깨끗해 질 때까지 섞었다. 상기 혼합물을 디쉬(glass petri dish)에 넣고 질소가스(N₂)로 유기용매들(클로로포름 및 메탄올)을 제거한 후, 디쉬에 남은 결정체(제조된 CLC)를 긁어서 새로운 용기(glass container)에 보관(22℃)하였다 (도 7 의 개략도 참조). 제조된 CLC 50 mg을 정액 희석제 (m-Modena B; Glucose 30 g/L, EDTA 2.25 g/L, Sodium citrate 6.9 g/L, Sodium bicarbonate 1 g/L, Tris 5g/L, Citric acid 2.5 g/L, L-Cysteine 0.05 g/L, BSA 4 g/L, Gentamicin sulfate 0.3 g/L, pH 7.0) 1 ml에 넣고 37℃에서 녹여 스톡(stock)을 만들었다.

실시예 2. 정액 수집 및 CLC와 MBCD의 처리

정액은 미니 피그(PWG miniature pigs)에서 수집하였으며 면 거즈(cotton gauze)로 걸러 겔 입자들(gel particles; 돼지에서 사정 시 나오는 겔 덩어리로 오염물질로 작용할 수 있어 제거하는 것이 좋다)을 제거하였다. 상기 정액을 25℃에서 1시간 내로 실험실로 옮겼다. 정액은 동량의 희석제(m-Modena B)로 희석하였다. 상온에서 10분간 유지한 후, 상기 정액은 m-Modena B 1 ml에 1.2×10⁸ sperm으로 희석하여, CLC와 MBCD(0, 0.5, 1.5, 3, 4.5 및 6 mg/ml)를 각각 25℃에서 15분간 처리하였다. 상기 처리된 정액 샘플은 동결보존을 위해 원심분리(400×g, 10분)하여 동결보존 전 전 정자로부터 CLC와 MBCD를 제거하였다.

여기서, MBCD는 막내 콜레스테롤을 제거시키는 역할을 하는 시약으로, CLC가 정자 막내로 콜레스테롤을 유입시킴으로써 정자 막 보호에 효과적인 작용을 한다는 것을 증명하기 위해 사용한 음성 대조군이다. 즉, MBCD는 정자막내 콜레스테롤이 부족하게 될 경우 손상을 입는 다는 것을 증명해 준다.

실시예 3. 정액 동결(freezing) 및 융해(thawing)

CLC와 MBCD로 처리된 정액은 김 등에 의해 개시된 스트로(straw) 동결과정(Kim S. K, et al., 2006. Reprod. Dev. Biol. 30: 59-64)을 조금 변형하여 처리하였다. 희석된 정액은 m-Modena B 1 ml에서 1.2×10⁸ sperm으로 혼합되었으며, CLC 또는 MBCD (0, 0.5, 1.5, 3, 4.5 및 6 mg/ml)로 25℃에서 15분간 인큐베이션 후 원심분리(400×g, 10분)하여 CLC나 MBCD를 제거하였다. CLC나 MBCD가 제거된 정액은 락토오스-난황 희석액(lactose-egg yolk extender, LEY; 11% 락토오스 80 ml 및 난황 20 ml)으로 재현탁(re-suspend)시켜 정자 농도를 5×10⁸ sperm/ml로 제공하고, 상기 정액을 5℃까지 3시간 동안 서서히 냉각시켰다. 냉각 후 상기 정액은 2차 LEY 희석액(1.5% OEP(Orvus Es Paste) 및 9% 글리세롤(glycerol)이 포함된 LEY extender)으로 2:1(v:v)로 희석하였다. 상기 정액은 저장을 위해 액체 질소에 잠기게 하기 전에 0.5 ml 스트로(straw)에 담고 액체질소 위쪽 5 cm에서 10분간 예비동결(pre-frozen)하였다 (도 8의 동결과정 참조). 동결된 정액의 융해(thawing)는 액체 질소에 저장 후 수행되었다. 상기 0.5 ml 스트로는 50℃의 워터배스(water bath)에서 10초간 융해되었다.

실시예 4. 정자 막 내 콜레스테롤 유입

정액은 m-Modena B에 1.2×10⁸ sperm/ml로 섞고 1.2×10⁸ sperm 당 CLC를 0.5 및 2 mg으로 인큐베이션 하였다. CLC는 사이클로덱스트린이 22-(N-(7- nitrobenz-2- oxa-1,3-diazol-4-yl) amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3β-ol로 표지된 콜레스테롤(NBD cholesterol, Invitrogen)로 프리로드(pre-loaded)되어 있었다. 상기 인큐베이션된 정액 샘플들을 원심분리(400×g, 10분)하여 정자로부터 CLC와 MBCD를 제거하고 PBS로 재현탁하였다. NBD-표지된 콜레스테롤의 양은 유세포분석기(flow cytometer)를 이용하여 측정하였다. 488 nm로 조정된 아르곤 레이저를 이용하여 여기(勵起)되었다. 샘플 당 총 10,000 세포가 분석되었다. 정자의 막 내로 콜레스테롤 유입(incorporation)의 형광 이미지는 공초점 레이저 현미경(confocal laser sacnning microscope: CLSM)으로 모니터하였다. 정액의 현탁 후, 소정의 샘플 5 μl을 예열(37℃)된 글라스 슬라이드에 떨어뜨리고 488 nm로 조정된 아르곤 레이저, 505 nm 파장선택미러(dichroic mirror) 및 520 nm 롱패스필터(long-pass filter)를 갖는 CLSM(OLYMPUS LX70; from JAPAN; FLUOVIEW - FV300)을 사용하여 측정하여, 정자 막이 NBD 형광을 포함하는지를 확인하였다.

도 1은 NBD-표지된 CLC 0.5 및 2 mg으로 처리된 정자의 유세포 분석을 나타낸다. 정자가 NBD-표지된 CLC로 처리되면, NBD의 형광은 콜레스테롤 수준까지 증가되었다. 구체적으로 도 1은, 유세포 분석(Flow cytometry)으로 콜레스테롤에 붙인 NBD 형광을 히스토그램(histogram)으로 분석한 것이다. NBD를 붙인 콜레스테롤을 사이클로덱스트린과 반응시켜 만든 CLC를 정자와 배양시켜 정자표면에 CLC에 의해 유입된 콜레스테롤 양을 유세포 분석기로 형광세기를 분석한 결과로, 사이클로덱스트린에 의해 효과적으로 정자막내로 콜레스테롤을 유입시킬 수 있다는 것을 알 수 있다.

도 2는 형광 표지된 콜레스테롤 0.5 및 2 mg으로 처리된 정자 세포들의 현미경 사진으로, 콜레스테롤이 막 구획(membrane compartment)에 유입되었음을 보여준다. NBD 표지된 CLC 0.5 mg으로 처리된 정자 세포들은 첨체의 구획(acrosomal compartment)이 더 심하게 표지된 것으로 관찰되었으며, NBD 표지된 CLC 2 mg으로 처리된 경우는 첨체 및 미토콘드리아 구획에 형광이 나타났다.

구체적으로 도 2는, CLC에 의해 유입된 NBD가 붙은 콜레스테롤의 모습을 공초점 레이저 현미경(Confocal Laser Sacnning Microscope)으로 관찰한 것이다. 1번은 CLC가 처리되지 않은 동결 정자이고 2번과 3번은 CLC를 각각 0.5와 2 mg 씩 처리한 동결 정자로, 콜레스테롤에 붙인 NBD의 형광으로 정자 표면에 CLC에 의해 유입된 콜레스테롤의 분포를 확인할 수 있으며, 특히 정자 두부의 첨체 주변이 우선적으로 유입되고, 점차 정자 중편부(미토콘드리아초)와 미부(꼬리) 쪽으로 콜레스테롤이 유입되는 것을 확인할 수 있다.

따라서, 도 1과 2는 사이클로덱스트린에 의해 정자막내로 콜레스테롤이 효과적으로 유입된다를 것을 증명하기 위한 실험 결과물로, 정자 표면에 사이클로덱스트린에 의해 유입된 콜레스테롤을 NBD의 형광을 통해 분석하고, 눈으로 확인할 수 있었으며, 특히 콜레스테롤의 분포가 수정 능력과 밀접한 연관이 있는 첨체부분 주변으로 우선적으로 유입되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 동결-융해된 정자의 생존력 및 첨체에 대한 콜레스테롤의 효과

유세포 측정 생존력 분석를 위해, 동결-융해된 정자는 5 μl SYBR-14 (20 μM solution in DMSO), 및 5 μl PI(propidium iodide; 2.4 mM solution in water, Molecular Probes, Eugene, OR)로 염색하였다. 상기 샘플은 488 nm로 조정된 아르곤 레이저가 구비된 유세포 분석기를 이용하여 분석 (샘플 당 10,000 세포) 하기 전에 37℃에서 10분간 인큐베이션 하였다.

정자의 첨체(acrosome) 상태는 CTC 형광 분석법 (Abeydeera et al., 1997)을 이용하여 평가하였다. 각 세포는 자외선 조명(420 nm에서 방사) 하에서 관찰하였다. 3개의 형광 염색 패턴이 분석되었다: 정자전체가 염색된 것은 정자 원형질막이 손상되지 않은 상태 (F 패턴), 정자 머리 쪽 부분 중 꼬리 쪽 부분의 절반이 염색되지 않은 것을 원형질막이 손상되어 첨체외막이 드러나 수정능획득이 일어난 상태 (B 패턴), 및 머리 부분 전체가 염색되지 않은 것을 첨체막이 손상되거나 첨체반응이 일어나 수정 능력이 상실된 상태 (AR 패턴).

도 3에서, 동결-융해된 정자의 생존력 분석을 위한 유세포 분석 도트 플롯 데이터(flow cytometric dot plots data)는, 처리하지 않거나 MBCD 1.5 mg으로 처리한 정자와 비교하여 CLC 1.5 mg으로 처리된 살아있는 세포 영역에서 더 높은 정자 생존력을 나타내었다.

구체적으로 도 3은, SYBR-14(살아있는 세포에 염색-그린형광)와 PI(죽은 세포에 염색-붉은색 형광)로 염색된 정자를 유세포 분석기로 분석하여 정자 생존율의 분포상태를 도트 플롯으로 나타낸 것이다. 콜레스테롤을 정자막내로 유입시킨 정자 와 그렇지 않은 정자, 및 MBCD로 정자막에서 콜레스테롤을 빼 준 정자의 동결-융해 후 정자의 생존율을 비교한 것으로, 붉은색 점의 분포량이 곧 세포의 분포를 나타내며, 콜레스테롤을 유입시켜 동결한 정자가 살아있는 부분에 점의 분포가 가장 높게 나타난 것을 확인할 수 있다.

도 4는 돼지 정자(boar sperm)의 생존력을 나타낸다. 동결 전 정자에 CLC 1.5 mg이 첨가된 경우, 처리되지 않은 정자(63.4±0.91%) 및 MBCD 1.5 mg으로 처리된 정자(60.3±0.31%)와 비교하여 더 높은 퍼센트의 정자 생존력(71.5±0.23%)이 융해 후 유지되었다 (P<0.05).

구체적으로 도 4는, 정액 동결전 각각 CLC와 MBCD를 농도별로 처리하여 동결융해 후 정자의 생존율을 비교한 그래프로서, CLC를 1.5mg/1.2×10⁸ sperm의 농도로 처리한 정자의 생존율이 가장 높게 나타났다. 그리고 MBCD로 콜레스테롤을 제거한 정자의 경우 MBCD의 농도가 높을수록 점차 생존율이 감소하는 경향을 나타냈다.

도 5는 돼지 정자의 첨체 상태에 대한 콜레스테롤의 효과를 나타낸다. 콜레스테롤이 첨가된 정자는 처리되지 않은 정자(대조군) 및 동결 전 MBCD에 의해 콜레스테롤이 제거된 정자보다, 수정능획득 정자(capacitated sperm, B 패턴)는 더 높은 퍼센트를, 첨체-반응성 정자(acrosome-reacted sperm, AR 패턴)는 더 낮은 퍼센트를 나타내었다 (P<0.05). 특히, CLC 1.5 mg으로 처리된 정자의 AR 패턴 비율은 별다른 차이를 나타내지 않았다 (P<0.05).

구체적으로 도 5는, 신선 정액과 CLC 및 MBCD 처리한 또는 무처리한 동결정액을 CTC(chlortetracycline)으로 염색하여 첨체를 분석한 그래프로서, CTC 염색을 통한 정자 첨체 분석방법은 정자 전체가 염색된 것은 정자 원형질막이 손상되지 않은 상태 (F 패턴), 정자 머리쪽 부분 중 꼬리 쪽 부분의 절반이 염색되지 않은 것을 원형질막이 손상되어 첨체외막이 드러나 수정능획득이 일어난 상태 (B 패턴), 마지막으로 머리 부분 전체가 염색되지 않은 것을 첨체막이 손상되거나 첨체반응이 일어나 수정 능력이 상실된 상태 (AR 패턴)로 염색정도에 따라 정자의 첨체상태를 3가지 패턴으로 나눠 분석하는 방법이다. 신선 정액의 경우 F 패턴이 가장 높았으며, CLC를 처리하여 동결한 정자의 경우 B 패턴이 가장 높게 나타났다. 특히 수정 능력의 상실된 정자를 나타내는 AR 패턴의 비율이 신선 정액과 CLC 처리된 동결정액이 비슷한 수치를 나타냈다. 따라서 도 5의 결과는 CLC에 의해 막내로 콜레스테롤을 첨가시킨 정자의 상품으로써 가치를 증명하는 자료라고 할 수 있다.

실시예 6. 정자의 HSP 90 변화에 대한 콜레스테롤의 효과

5×10⁸ sperm로부터 얻은 단백질들은 8% SDS-PAGE로 분리하였다. 전기영동 후, 겔 상의 상기 단백질들은 니트로셀룰로오스 막에 옮기고 TTBS(Tween 20 Tris-Buffered Saline)에서 5% 스킴 밀크(skim milk)로 블로킹하였다. 상기 막을 모노-항 마우스 HSP90(TTBS로 1:2000으로 희석)으로 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 상 기 막을 항-마우스 IgG(goat anti-mouse IgG)로 헹구어 내고 1시간 동안 반응시켰다. 이어서, 상기 막을 검출 시약(루미놀 인핸서 용액 500 : 페록사이드 용액 1)으로 발색시켰다. 면역복합체의 색은 적정강도에서 나타내었다. 막에 있는 HSP90의 광학밀도(optical densities)는 농도계(FUJI FILM; software was Multi Gauge V3.0)를 이용하여 측정하였다.

도 6에서, 웨스턴 블롯 방법에 의한 정자의 면역블롯팅 분석은 돼지 정자의 HSP90의 정량적 분석결과를 나타낸다. HSP90은 냉각 충격 시 세포에서 분비되는 샤페론(chaperone) 단백질로 알려진 바 있으며, 정자의 경우 일반세포와 달리 대부분의 세포소기관이 없는 비정상적인 세포로 이미 분비되었던 단백질이 기능하여 감소되는 형태를 보인다. 도 6에서, HSP90은 돼지 정자의 냉각 과정 동안 저온쇼크(cold shock)에 의해 감소되었다. 처리되지 않은 정자보다 콜레스테롤로 처리된 정자에서 더 많은 양의 HSP90가 측정되었다. 또한 HSP90은 돼지 정자의 냉각 과정 동안 MBCD에 의한 세포막으로부터 콜레스테롤 유출에 의해 감소되었다.

통계학적 분석

데이터는 평균±표준오차로 나타내었다. 통계학적 분석은 윈도우용 SAS 버전 8.01을 이용하여 수행하였다. 통계학적 유의성은 p<0.05로 하였다. 실험군들은 Ducan's modified multiple range test의 사용을 통해 차이를 비교하였다.

이상 설명한 바와 같이, 동결보존 전 CLC를 이용하여 콜레스테롤을 정자 막내로 일정 농도만을 유입시킨 후 더 이상의 콜레스테롤이 정자 세포에 영향을 미치지 못하도록 CLC를 제거한 후 동결보존을 수행하였다. 이러한 본 발명의 방법에 따르면, CLC를 이용하여 콜레스테롤을 돼지 정자의 막에 유입시키면 동결과정 중 냉각과정에서 발생되는 냉각충격으로부터 돼지 정자의 첨체 막 및 막 단백질을 더욱 효과적으로 보호할 수 있다. 따라서, 동결보존 시 돼지 정자에 콜레스테롤의 첨가는 돼지 정자의 동결 기술을 향상시킬 수 있다.

도 1은 NBD-표지된 CLC 0.5 및 2 mg으로 처리된 정자의 유세포 분석을 나타낸다.

도 2는 형광 표지된 콜레스테롤 0.5 및 2 mg으로 처리된 정자 세포들의 현미경 사진이다.

도 3은 SYBR-14(살아있는 세포에 염색-그린형광)와 PI(죽은 세포에 염색-붉은색 형광)로 염색된 정자를 유세포 분석기로 분석하여 정자 생존율의 분포상태를 도트 플롯으로 나타낸 것이다.

도 4는 정액 동결전 각각 CLC와 MBCD를 농도별로 처리하여 동결융해 후 정자의 생존율을 비교한 그래프이다.

도 5는 신선 정액과 CLC 및 MBCD 처리한 또는 무처리한 동결정액을 CTC(chlortetracycline)으로 염색하여 첨체를 분석한 그래프이다.

도 6은 웨스턴 블롯 방법에 의한 돼지 정자의 HSP90의 정량적 분석결과를 나타낸다.

도 7은 본 발명에 따른 CLC 합성과정을 나타내는 개략도이다.

도 8은 본 발명에 따른 돼지 정액의 동결과정을 나타내는 순서도이다.

Claims

하기 단계들을 포함하는 돼지 정액의 동결보존 방법:

a) 돼지 정액을 희석제로 희석하는 단계;

b) 상기 돼지 희석정액을 CLC(cholesterol-loaded cyclodextrin) 0.5-2.0 mg/ml로 20-30℃에서 10-20분간 처리하는 단계;

c) 상기 CLC 처리된 희석정액에서 CLC를 제거하는 단계; 및

d) 상기 CLC가 제거된 희석정액을 동결하는 단계.
제 1항에 있어서, 상기 a) 단계의 희석제는 모데나(Modena)인 것을 특징으로 하는 돼지 정액의 동결보존 방법.
제 1항에 있어서, 상기 b) 단계의 희석정액은 ml 당 1.2×10⁸ sperm인 것을 특징으로 하는 돼지 정액의 동결보존 방법.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 c)단계에서 CLC 제거는 400×g에서 10분간 원심분리 함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 돼지 정액의 동결보존 방법.