KR101399432B1

KR101399432B1 - 미니돼지 정자의 동결보존방법

Info

Publication number: KR101399432B1
Application number: KR1020120045787A
Authority: KR
Inventors: 윤종택; 김상환; 이명섭
Original assignee: 한경대학교 산학협력단
Priority date: 2012-04-30
Filing date: 2012-04-30
Publication date: 2014-05-30
Also published as: KR20130122443A

Abstract

본 발명은 하기 단계를 포함하는 미니돼지 정자의 동결보존방법을 제공한다.
a) 미니돼지 정액을 당, 난황 단백질, TES(N-Tris[Hydrixymethyl]methyl-2-aminoethane-sulfonic acid) 및 항생제를 포함하는 동결보존액으로 희석하는 단계;
b) 상기 동결보존액으로 희석된 미니돼지 정액을 냉각하는 단계; 및
c) 상기 냉각된 미니돼지 정액을 동결하는 단계.
또한, 본 발명은 동결보존된 미니돼지 정자를 융해하는 방법을 제공한다.
본 발명의 동결보존방법을 사용하여 미니돼지 정자를 동결 융해하면 미니돼지 정자의 생존성이 향상되며 저온충격으로부터 정자의 첨체 및 유전자를 효과적으로 보호할 수 있어, 미니돼지 정자의 동결보존 기술을 향상시키고 동결 융해된 미니돼지 정자의 수정률을 증가시켜 미니돼지의 유전자원 보존 및 대량생산에 기여할 수 있다.

Description

미니돼지 정자의 동결보존방법{Method of cryopreserving miniature pig spermatozoa}

본 발명은 미니돼지 정자의 동결보존방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동결보호제로서 TES (N-Tris[Hydrixymethyl]methyl-2-aminoethane-sulfonic acid)를 포함하여 제조된 동결보존액을 사용하여 미니돼지 정자를 동결보존함으로써 미니돼지 정자의 생존성을 향상시키고 첨체 정상성을 높여 유전자 자원을 효과적으로 보존할 수 있다.

미니돼지(miniature pig)는 각종 바이오산업에 있어 그 수요가 증가되고 있어 유전자원의 보존 및 유전 형질 우수 개체의 대량 생산을 위하여 정액동결에 관한 연구가 진행 중에 있으나, 돼지의 정액은 다른 가축에 비하여 정자의 농도가 낮고 내동성과 온도 저하에 대한 내성이 약하다(Maxwell과 Johnson, 1997). 이로 인해 돼지정자의 동결과 융해 과정에서 돼지 정자는 저온 충격에 약하며, 삼투압에 의한 전해질 대사의 변화, 정자 세포내의 원형질 및 DNA 손상(Salisbury 등, 1978) 및 첨체에 심각한 손상을 받는 것으로 알려져(Potter, 1979), 동결보존에 어려움이 있다.

돼지 정액은 다른 포유류에 비해 정자의 동결 융해 후 생존율이 낮아 글루코스-난황 희석액 (Baier, 1962; Polge 등, 1970), 락토스-난황 희석액(Westendorf 등, 1975), 벨트스빌 F3(BF3; Pursel과 Johnson, 1973) 등이 많이 쓰이며, 그 중 간편하고 효율성이 높은 락토스-난황 희석액(Lactose Egg-Yolk,LEY)이 많이 이용되고 있다. 미니돼지 정자의 동결에 있어 이 등(2011)은 LEY를 이용한 정액동결이 미니돼지 정자의 생존 및 활력이 상승되고 수정률이 높다고 하였다.

정자 동결에 다양한 당류의 첨가가 정자의 원형질막 손상을 줄여 생존율을 향상시키며(Pursel 등, 1972), TES(N-Tris[Hydrixymethyl]methyl-2-aminoethane-sulfonic acid)의 첨가가 동결-융해 후 정자의 생존율을 향상시켜(Hanada, 1980; Watson, 1990), 정자의 원형질막의 보호 및 대사 작용에 영향을 주어 세포막을 보호한다(Garde 등, 2003)고 알려져 있다.

TES를 포함한 희석액을 사용하여 돼지정자를 동결보존하는 방법은 대한민국 공개특허 10-2009-0024029호에 개시되어 있다.

그러나, 상기 문헌은 돼지정자의 저온동결(5~10℃)에 적합한 방법으로 상기 방법을 사용하여 극저온(-100℃ 이하)에서 돼지 정자를 동결보존하였을 때는 오히려 정자의 생존율을 감소시켜 돼지정자의 동결보존액으로 적합하지 못한 문제점이 있다.

또한 김 등.,(2011)의 보고에 따르면 미니돼지와 돼지의 정액 동결에서 TES를 첨가한 동결보존액이 미니돼지에서는 높은 생존율을 보였지만 돼지에서는 낮은 생존율을 보였다는 연구 결과가 있다.

본 발명은 미니돼지 정자의 생존성을 향상시키고 유전자 자원 보존에 효과적인 미니돼지 정자의 동결보존방법을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 미니돼지 정자의 동결보존방법을 제공한다.

a) 미니돼지 정액을 당, 난황 단백질, TES(N-Tris[Hydrixymethyl]methyl-2-aminoethane-sulfonic acid) 및 항생제를 포함하는 동결보존액으로 희석하는 단계;

b) 상기 동결보존액으로 희석된 미니돼지 정액을 냉각하는 단계; 및

c) 상기 냉각된 미니돼지 정액을 동결하는 단계.

또한, 본 발명은 동결보존된 미니돼지 정자를 융해하는 방법을 제공한다.

본 발명의 동결보존방법을 사용하여 미니돼지 정자를 동결 융해하면 미니돼지 정자의 생존성이 향상되며 저온충격으로부터 정자의 첨체 및 유전자를 효과적으로 보호할 수 있어, 미니돼지 정자의 동결보존 기술을 향상시키고 동결 융해된 미니돼지 정자의 수정률을 증가시켜 미니돼지의 대량생산 및 유전자원 보존에 기여할 수 있다.

도 1은 전기영동법으로 분석한 미니돼지 동결 정자의 염색체 이상에 대한 정량적 분석결과를 나타낸 것이다.
도 2는 동결보존액에 따른 미니돼지 동결 정자의 첨체 정상성을 위상차 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 a) 미니돼지 정액을 당, 난황 단백질, TES(N-Tris[Hydrixymethyl]methyl-2-aminoethane-sulfonic acid) 및 항생제를 포함하는 동결보존액으로 희석하는 단계;

c) 상기 냉각된 미니돼지 정액을 동결하는 단계를 포함하는 미니돼지 정자의 동결보존방법을 제공한다.

본 발명에 사용되는 당은 단당류, 이당류, 다당류를 모두 포함하며 덱스트로스(dextrose), 말토스(maltose), 글루코스(glucose), 락토스(lactose), 수크로스(sucrose), 트레할로스(trehalose), 만노스(mannose), 라피노스(raffinose), 셀로비오스(cellobiose), 겐티오비오스(gentiobiose), 이소말토스(isomaltose), 아라비노스(arabinose), 과당(fructose)을 사용할 수 있으며 본 발명의 실시예에서는 락토스, 과당, 글루코스를 사용하였다.

본 발명의 TES(N-Tris[Hydrixymethyl]methyl-2-aminoethane-sulfonic acid)는 정자의 세포막 및 핵막을 보호하는 역할을 하고, TES의 농도는 동결보존액 전체 조성물 중 0.050 내지 0.2M 로 포함되며, 바람직하게는 0.084 내지 0.1M이다. 0.05M 미만으로 첨가하였을 때는 정자의 생존율이 감소하여 동결보존효과가 미미하였고 0.2M을 초과하여 첨가하였을 때는 삼투압의 증가 및 pH의 증가로 정자 원형질막이 손상되어 동결보존액으로 적합하지 않았다.

본 발명의 항생제는 스트렙토마이신(Streptomycin), 겐타마이신(Gentamycin), 카나마이신(kanamycin), 네오마이신(neomycin), 및 아프라마이신(apramycin)을 사용할 수 있으나 이들로 제한되지는 않으며 본 발명의 실시예에서는 스트렙토마이신(Streptomycin)과 겐타마이신(Gentamycin)을 사용하였다.

또한, 본 발명의 동결보존액은 안정화제, 산화방지제, 부형제 등을 포함할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 동결보존액으로 희석된 미니돼지 정액은 미니돼지 정액과 동량의 동결보존액으로 희석될 수 있으며 바람직하게는 ml당 4×10⁷정자의 농도를 가지도록 희석될 수 있다. (a) 단계)

본 발명에 있어서, 동결보존액으로 희석된 미니돼지 정액을 냉각하는 단계(b) 단계)는 37℃에서 4℃까지 2시간 동안 냉각되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 동결보존액으로 희석된 미니돼지 정액은 냉각 후 도데실황산나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)과 글리세롤(glycerol)을 첨가한 2차 동결보존액으로 재희석될 수 있다.

본 발명의 미니돼지 정액을 동결하는 단계(c) 단계)는 액체질소 표면위로부터 5 cm 위 -180℃에서 10분간 정치하여 예비 동결한 후 액체 질소에 침지하여 동결하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 동결보존된 미니돼지 정자를 융해하는 방법을 제공한다. 보다 상세하게는 미니돼지의 동결보존된 정자를 항온 수조를 이용하여 각각 37℃에서 20초, 45초 및 75℃에서 5초 동안 융해하였다.

이하, 제조예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 정액 수집

본 발명에 사용된 정액은 경기도 평택시에 위치한 메디키네틱스(주)의 Midget 미니돼지에서 의빈대를 이용한 음경 수압법으로 정액을 채취하여 전체 정자의 70% 이상의 정상 움직임과 80% 이상의 생존율을 현미경하에서 확인한 후 사용하였다.

실시예 2 : 동결보존액 제조

본 발명에 사용된 동결보존액 중 LEY 보존액 (락토오스-난황 희석액; 9% α-락토오스에 난황 20%를 첨가)은 Westendorf 등(1975)의 방법을 보완하여 제조하였고(대조군), TLE 보존액의 제조는 9% α-락토오스에 TES (N-Tris[Hydrixymethyl]methyl-2-aminoethane-sulfonic acid) 100 mM과 Tris 50mM 및 스트렙토마이신과 겐타마이신 25 ug/ml를 첨가한 후 난황 20%를 혼합하여 전체 용량을 1000ml로 제조하였으며, TFGE 보존액은 3% D-프룩토스와 5% D+글루코스에 TLE 보존액과 같은 방법으로 TES와 Tris를 첨가한 후 난황 20%를 혼합하여 전체 용량을 1000ml로 제조하였고, 제조된 동결보존액 각각을 원심분리(4,000 rpm, 30분, 4℃)하여 상층액만을 사용하였다.

2차 동결보존액은 상기 동결보존액에 도데실황산나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)과 글리세롤(glycerol)의 최종농도를 0.5%와 각 1%, 1.5%, 3%로 첨가하여 제조하였다.

실시예 3 : 정액 동결 및 동결 정액 융해

미니돼지 정액은 상기 동결보존액(TLE, LEY, TFGE)으로 4×10⁷정자/ml의 농도가 되도록 희석한 후 37℃로 가온한 보온병에 담아 2시간 이내로 실험실로 운반하였고 37℃에서 4℃까지 2시간 동안 냉각하였다. 그 후 2차 동결보존액을 총 용량의 1/2로 첨가하여 0.5 ml 스트로에 넣어, 액체 질소가 담겨 있는 용기에서 액체질소 표면위로부터 5 cm 위 -180℃에서 10분간 정치하여 예비 동결한 후 액체 질소에 침지하여 동결 보관하였다.

동결 융해는 항온 수조를 이용하여 각각 37℃에서 20초, 45초 및 75℃에서 5초 동안 융해하였다.

실험예 1 : 정자의 생존성 및 첨체 정상성 확인

정자의 생존율은 computer assisted sperm analysis system (Sperm Class Analyzer, Microptic, 바르셀로나, 스페인)을 이용하여 평가하였고, 정자의 첨체 정상성은 라르손(Larson)과 밀러(Miller) (1999)의 방법을 보완하여 수행하였다.

각 동결보존액(TFGE, TLE, LEY)으로 동결된 정액을 융해한 후 3×10⁶정자/ml의 최종 농도의 정자를 800×g로 원심분리 후 상층액을 제거하고, 1 ml의 1×PBS를 섞어 2회 500×g에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 제거한 후 3.7% 포르말린 2 ml를 첨가하여 40분간 고정하고, 500×g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 상층액이 제거된 정자 펠릿(pellet)에 1 ml의 1×PBS를 첨가하여 희석한 다음 그 중 100 ul를 슬라이드 글래스에 도말하여 실온에서 건조시킨 후 0.25% CBB (Coomassie Brilliant Blue) 용액으로 5분간 염색시켜 위상차 현미경으로 400배하에서 정자의 첨체 정상성을 판단하였다. 판단 기준은 두부전체에 푸르게 염색된 정자는 첨체정상 정자로 판단하였고, 두부의 주변 및 염색되지 않은 정자는 이상정자로 판단하였다. 400마리의 정자를 세어 백분율로 환산하여 분석하였다. 실험 결과는 SAS pakage(버전 9.1)를 이용하여 ANOVA와 GLM(Generalized linear model)를 적용하여 던컨(Duncan)의 다중검정(mul-tiple range test)에 의하여 통계적 유의성(p<0.05)을 분석하였다.

동결보존액의 종류 및 융해방법에 따른 정자의 생존성 및 첨체 정상성은 표 1과 같으며, TLE 동결보존액이 다른 동결보존액에 비하여 동결 융해 후 생존성이나 정자의 첨체 정상성이 유의적으로(p<0.05) 높은 결과를 나타내었다.

정자 생존력
융해방법	37℃에서 20초		37℃에서 45초		75℃에서 5초
동결보존액의 종류	생존율(%)	첨체정상성(%)	생존율(%)	첨체정상성(%)	생존율(%)	첨체정상성(%)
TFGE	42.4±1.8	50.5±1.6^*	43.2±2.1^*	48.3±1.4^*	60.3±2.4^*	58.6±2.2^*
TLE	57.4±1.8^*	58.5±1.8^**	58.3±2.1^**	57.3±1.4^**	61.3±2.4^**a	62.2±2.2^**a
LEY	38.6±1.8	44.2±2.6	38.4±2.1	41.5±1.4	50.2±2.4	54.5±2.2

동결보존액의 종류 및 동결보존액 중 글리세롤 농도에 따른 정자 생존성 및 첨체 정상성을 분석하기 위해 각 보존액으로 처리된 미니돼지 동결정자는 75℃에서 5초간 융해한 후 분석하였고 결과는 표 2 및 도2에 나타내었다.

표 2에 의하면, TLE 동결보존액이 다른 동결보존액보다 정자의 생존성과 정자의 첨체 정상성이 유의적으로(p<0.05) 높았으며, 글리세롤 첨가 농도에서는 모든 결과가 유의적인 차이를 보이지는 않았으나, 1.5%첨가 농도가 1% 와 3% 첨가 농도에 비하여 높은 정자 생존성을 나타내었다.

도 2는 1.5% 글리세롤이 첨가된 각 동결보존액의 처리하여 미니돼지 정자의 동결-융해 후 첨체정상성을 분석한 결과이다. 도 2에서 검정색 화살표는 첨체가 정상인 정자를 나타내며, 정자의 첨체부분(정자의 두부 끝부분)이 진파랑으로 염색된 것이 첨체 정상 정자(Acrosome intect) 연하게 염색되어 있는 정자는 첨체반응을 시작한 정자, 염색이 흐리거나 두부부분이 염색되지 않은 정자는 첨체 반응이 일어난 비정상상 정자(Acrosome reaction)를 나타낸다.

도 2 및 표2에 의하면, TLE 보존액이 유의적(p<0.05)으로 가장 높은 첨체 정상성을 보였고, LEY 보존액이 가장 낮은 첨체정상성을 보였다.

동결보존액의 종류	글리세롤 농도	생존율(%)	첨체정상성(%)
TFGE	3%	58±4.5	57.5±1.8
	1.5%	63.2±3.2^*	61.2±1.0^*
	1%	43.2±2.1	47.1±2.1
TLE	3%	61.3±4.5^*	61.3±1.8^*
	1.5%	66.1±3.2^**b	66.2±1.0^**a
	1%	53.3±2.1	54.2±2.1
LEY	3%	56.2±4.5	52.2±1.8
	1.5%	60±3.2^*	58.6±1.0^*
	1%	51.2±2.1	50.1±2.1

실험예 2 : 정자 DNA 손상도 분석

동결보존액에 따른 정자 염색체 DNA의 손상도 분석은 McConkey 등(1989)의 방법을 수정·보완하여 검사하였다.

각 동결보존액(TFGE, TLE, LEY)으로 동결된 정액을 융해한 후 70% percoll에서 원심분리(2,000 rpm 10 min, RT)하여 가온 된 BTS 희석액으로 1×10⁶정자/ml로 희석하여 4 ml의 DNA 절편 용해 버퍼(50 mM Tris (pH 8.0), 10 mM EDTA(pH 8.0), 1% SDS, 500 mg/ml 단백분해효소 K)를 첨가하여 37℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 반응시킨 DNA는 PCI 용액(페놀 : 클로로포름 : 이소아밀알코올 (25:24:1)) 추출 방법을 이용하여 추출하고 100% 에탄올로 침전시켜 DNA 완충액인 TE 버퍼(10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)로 녹인 후 1.5% 아가로스 겔에서 100V로 전기영동 하였다. 전기영동 후 아가로스 겔을 Etbr 염색액(1 mg/mL의 ethidium bromide)에 넣어 발색하여 UV transilluminator에서 확인하였고, DNA 밴드의 분절화 현상(fragmentation)를 alpha ease FC(버전 4.0)으로 분석하였다. 실험결과 분석은 DNA 분절화된 밴드의 수를 세어 백분율로 표시하였으며, 4반복하여 평균±S.D로 분석하였다. 실험 결과는 SAS pakage(버전 9.1)를 이용하여 ANOVA와 GLM(Generalized linear model)를 적용하여 던컨(Duncan)의 다중검정(mul-tiple range test)에 의하여 통계적 유의성(p<0.05)을 분석하였다.

동결보존액이 정자 두부에 미치는 영향을 알아보기 위하여 DNA 분절화 현상을 분석한 결과는 도 1과 같다. 동결보존액에 따라 미니돼지 정자의 염색체 DNA상의 손상을 분석한 결과 TLE 보존액의 경우 43.3±0.5%의 유의적(p<0.05)으로 가장 낮은 손상을 보였고, LEY 보존액에서 약 63.5±2.3%의 높은 손상을 보였다. TFGE 보존액의 경우 약 51.5±1.3%의 손상을 보이고 있어, LEY 보존액보단 적은 손상을 나타냈다.

Claims

a) 미니돼지 정액을 당, 난황 단백질, TES(N-Tris[Hydrixymethyl]methyl-2-aminoethane-sulfonic acid) 및 항생제를 포함하는 1차 동결보존액으로 희석한 후 37℃에서 4℃까지 낮추며 2시간 동안 천천히 1차 냉각하는 단계;
b) 상기 1차 냉각 단계를 거친 미니돼지 정액에 도데실황산나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)과 글리세롤(glycerol)이 첨가된 2차 동결보존액을 상기 1차 냉각된 미니돼지 정액 총량의 1/2로 첨가 후, 동결보존 스트로우에 넣어 액체질소가 담긴 용기 안에서 액체질소 표면 위에 정치시켜 -180℃에서 10분간 2차 예비 동결하는 단계; 및
c) 상기 액체질소 표면 위에 정치시켜 예비 동결한 스트로우를 액체질소에 침지하여 3차 동결하는 단계;를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 미니돼지 정자의 동결보존방법.
제1항에 있어서,
상기 a) 단계의 당은 덱스트로스(dextrose), 말토스(maltose), 글루코스(glucose), 락토스(lactose), 수크로스(sucrose), 트레할로스(trehalose), 만노스(mannose), 라피노스(raffinose), 셀로비오스(cellobiose), 겐티오비오스(gentiobiose), 이소말토스(isomaltose), 아라비노스(arabinose) 및 과당(fructose)에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 미니돼지 정자의 동결보존방법.
제1항에 있어서,
상기 a) 단계의 TES(N-Tris[Hydrixymethyl]methyl-2-aminoethane-sulfonic acid)는 1차 동결보존액 중 0.05 내지 0.2의 몰농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 미니돼지 정자의 동결보존방법.
제1항에 있어서,
상기 a) 단계의 항생제는 스트렙토마이신(Streptomycin), 겐타마이신(Gentamycin), 카나마이신(kanamycin), 네오마이신(neomycin) 및 아프라마이신(apramycin)에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 미니돼지 정자의 동결보존방법.
삭제
삭제
삭제