KR20090024029A

KR20090024029A - 아마이드를 포함하는 정자의 동결보존제 및 정자의동결방법

Info

Publication number: KR20090024029A
Application number: KR1020070089209A
Authority: KR
Inventors: 김대영; 황유진; 이은주; 추승화; 김유정; 이영; 최동욱; 한대근; 조태경; 김효현; 노다은; 변진우; 이정화; 김윤섭
Original assignee: 가천의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2007-09-03
Filing date: 2007-09-03
Publication date: 2009-03-06
Also published as: KR100944145B1

Abstract

본 발명은 아마이드 (Amide)를 포함하는 정자의 동결보존제 및 동결방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 아마이드(Amide) 물질인 Methylformamide와 Dimethylformamide, Urea를 포함하는 동결보존제 및 동결보존효과를 이용한 정자동결 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 동결보존제로서 한계가 있는 글리세롤을 대신하여 살아있는 세포에 독성을 지니고 있고 특히,다른 포유류 동물의 정자보다 감수성이 큰 돼지에 있어서 정자의 질에 부정적인 영향을 주는 글리세롤보다 분자량이 작아 안정적으로 정자에 작용하면서도 그 동결 효율이 글리세롤보다 우수한 아마이드 물질 (Methylformamide, Dimethylformamide, Urea)을 동결보존제로서 적용해본 결과 동결정자의 향상된 운동성과 생존율을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명의 아마이드 물질을 포함하는 동결보존제 및 이를 이용한 정자의 동결방법은 생명공학분야에 있어 그 이용가치가 높으며 특히, 돼지의 품종보존, 번식, 유지를 통한 축산업의 발전에 이바지할 수 있을 것이다.

정자 동결, 동결보존제, 정자동결용 희석액, 아마이드

Description

아마이드를 포함하는 정자의 동결보존제 및 정자의 동결방법 {cryopreservation compound of sperm having amide and freezing method of sperm}

본 발명은 동결 정자의 활용에 유용한 물질로서 아마이드를 포함하는 동결보존제 및 정자 동결방법에 관한 것이다.

정자의 동결과 저온 보관은 가축 등의 품종의 보존과 번식에 유용하며 생명공학 분야에서 활발히 연구되고 있는 분야이다. 특히, 동결 과정 중에 정자는 세포 내 빙정 형성, 삼투압의 차이 그리고 저온 스트레스에 의해 손상을 받게 되는데, 이러한 손상을 감소시키는 물질이 동결보존제이며 대표적인 물질로는 글리세롤(Glycerol)이 있다. 동결과정에 쓰이는 원 정액은 농도가 높기 때문에 희석액을 사용하여 묽히게 되는데, 희석 과정 중에 동결보존제가 희석액과 함께 투여된다. 글리세롤은 세포에 독성이 있는 물질이고 특히, 돼지의 정자는 다른 가축 동물의 정자보다 외부 자극에 대한 감수성이 높기 때문에 글리세롤에 의해 쉽게 손상을 받을 수 있다.

정자를 동결하는 방법은 사용하는 희석액에 따라 다른 부류로 나눠진다. 본 실험에서 사용한 방법은 희석액으로서 Beltsvile F5 (BF5; Pursel and Johnson, 1975)를 사용하는 것이다. BF5에는 egg yolk-Tes-tris-glucose-OEP 성분이 함유되어 있고 정자의 일차희석에 사용된다. 이 동결방법에 따른 기존의 실험에서는 BF5 희석액에 Glycerol을 첨가하여 이차희석액으로 사용한 바 있으며, 기존의 연구 결과에서 Glycerol이 동결 정자의 융해 후 운동성이나 생존율이 여타 동결보존제보다 우수한 것으로 알려졌지만 글리세롤은 세포에 부정적인 영향을 주는 독성을 가지고 있고 고(高) 농도로 사용했을 경우 오히려 정자의 질을 떨어뜨리는 결과를 초래한다. 이 밖에 사용되는 시약으로는 Hulsen 용액(Dtseh Tierarztl Wsher 82:155-162, 1975)으로서 glucose-lactose-citrate-EDTA-potassium 성분이 함유되어있고, 원 정액의 정장분리에 쓰인다.

본 발명에서 그 효과를 입증하고자 하는 아마이드는 기존의 실험에서 말(Stallion)의 정자에 적용되었고, 본 발명에서 사용한 희석액과는 다른 skim milk-egg yolk(SEMY) 희석액에 글리세롤과 5가지의 아마이드 물질(Methylformamide, Dimethylformamide, Formamide, Acetamide, Methylacetamide)을 동결보존제로 첨가하였다. 동일한 농도의 총 6가지의 물질을 동결보존제로 적용한 후 동결정자의 융해 후 운동성을 측정한 결과, Methylformamide와 Dimethylformamide를 사용한 동결 정자 그룹의 운동성(%)이 글리세롤을 사용한 그룹과 비교하였을 때 유사한 수치를 나타내었다. 이를 통해 위의 두 가지 아마이드 물질이 말의 정자 동결에 있어서의 손상을 효과적으로 감소시킨다는 것을 알 수 있다 (E.L. Squires, 2003).

이로써, 본 발명자는 돼지의 정자가 다른 가축 동물보다 외부 스트레스에 대한 감수성이 큰 특징을 고려하여 상기 두 가지 아마이드 물질과 또 다른 아마이드 물질인 Urea를 돼지 정자의 동결과정에 동결보존제로 적용시켜 보고 글리세롤의 효과와 비교해 본 결과 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명의 목적은 살아있는 세포에 독성을 지니고 있고 다른 포유류 동물의 정자보다 감수성이 큰 돼지의 정자의 질에 부정적인 영향을 주는 글리세롤보다 분자량이 작아 안정적으로 정자에 작용하며 정자에 있어서의 동결 효율이 글리세롤보다 우수한 아마이드 (Amide)물질을 포함하는 정자의 동결보존제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 아마이드 물질을 포함하는 정자의 동결보존에 사용되는 정자동결용 희석액을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기에서 입증된 아마이드(Amide)의 효과를 이용하여 정자의 동결방법을 제공하는 데 있다.

이로써 정자의 동결기술을 이용한 생명공학 기술의 발전과 특히, 돼지의 품종보존, 번식, 유지를 통한 축산업의 발전에 이바지하고자 하는데 있다.

정자의 동결 보존제로 흔히 쓰이지만 정자의 질(quality)에 부정적인 영향을 끼치는 글리세롤을 대체할 물질로 3가지 종류의 아마이드(Amide)를 설정하고, 돼지 정자 동결 과정에 쓰이는 희석액에 글리세롤 대신 각각의 아마이드(Amide)를 넣어 주었다. 이 물질의 동결 보존 효과를 증명하기 위하여 돼지 동결 정자의 융해 후 운동성, 생존율, NAR을 측정하여 기존 글리세롤의 효과와 비교하였다.

본 발명에서 사용되는 3가지 아마이드 물질의 분자식과 분자 구조는 다음과 같다.

1. Methylformamide(C₂H₅NO)

2. Dimethylformamide(C₃H₇NO)

3. Urea(CO(NH₂)₂₎

본 발명은 아마이드 (Amide)를 유효성분으로 포함하는 정자의 동결보존제에 관한 것으로, 상기 아마이드는 메틸포름아마이드 (methylformamide), 디메틸포름아 마이드 (dimethylformamide) 또는 우레아 (urea) 중 어느 하나인 동결보존제를 더 포함한다. 바람직하게는 상기 메틸포름아마이드, 디메틸포름아마이드 또는 우레아는 2~4%의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하고, 또한 상기 정자가 돼지의 정자인 것을 특징으로 하는 동결보존제에 관한 것을 더 포함한다.

본 발명은 또한 정자 동결용 1차 희석액에 동결보존제가 첨가된 정자 동결용 희석액에 관한 것으로, 상기 1차 희석액은 TES 12g/1000mL, Tris 2g/1000mL, glucose 32g/1000mL, OEP 5g/1000mL, Gentamycin sulfate 0.02g/1000mL 및 난황(egg yolk) 200g/1000mL를 정제수에 혼합된 것으로 구성됨을 특징으로 하는 정자 동결용 희석액인 것을 더 포함한다. 바람직하게는 정자동결용 희석액에는 아마이드를 포함하는 상기의 동결보존제가 포함된다.

또 한편 본 발명은 ⑴ 원 정액과 정자 동결용 1차 희석액을 각각 1차 냉각하는 단계; ⑵ 상기 냉각된 원 정액을 정장분리용액과 혼합하여 원심분리한 후 상층액(정장)을 정자를 보존하면서 제거하는 단계; ⑶ 상기 정장이 제거된 정액을 상기 냉각된 정자 동결용 1차 희석액과 혼합하여 정자가 동결가능한 농도로 1차 희석하는 단계; ⑷ 상기 1차 희석된 정자 및 동결보존제가 포함된 정자 동결용 2차 희석액을 각각 2차 냉각하는 단계; ⑸ 상기 2차 냉각된 정자를 2차 희석액에 1:1∼2배 희석하고 혼합하여 동결할때까지 얼음에 정치하여 두는 단계;를 포함하여 이루어지는 정자 동결방법에 관한 것이다.

상기 정자 동결방법에 있어서, 상기 1차 희석액은 TES 12g/1000mL, Tris 2g/1000mL, glucose 32g/1000mL, OEP 5g/1000mL, Gentamycin sulfate 0.02g/1000mL 및 난황(egg yolk) 200g/1000mL를 정제수에 혼합한 것으로 구성됨을 특징으로 하는 방법인 것을 더 포함하고, 상기 정장분리용액은 글루코스 (glucose) 28.75 g/500mL, α-락토스 (α-lactose) 1.25 g/500mL, C₆H₅Na₃O₇·2H₂O (Sodium citrate·2H₂O) 2.25 g/500mL, Na₂-EDTA (disodium Ethylenediaminetetraacetic acid) 1.75 g/500mL, NaHCO₃ 0.60 g/500mL, KCl 0.20 g/500mL 및 Gentamycin sulfate 0.01 g/500mL 를 정제수에 혼합한 것으로 구성됨을 특징으로 하는 방법인 것을 더 포함한다.

바람직하게는 상기 정자동결방법에 있어서, 상기 1차 냉각은 15℃까지 냉각하는 것을 포함하며, 또한 상기 ⑵단계는 원 정액과 정장 분리 용액을 1:2로 혼합하여 17℃에서 3분간 원심분리하는 것을 더 포함하며, 또한 2차 냉각은 5℃까지로 냉각하는 것을 더 포함한다.

또한 상기 정자동결방법에 있어서, 상기 동결이 가능한 정자의 농도는 바람직하게는 10⁹ 개/mL 인 것을 포함하고, 상기 2차 희석액은 상기 1차 희석액에 동결보존제가 첨가된 것임을 더 포함하며, 또한 상기 2차 희석액에 포함되는 동결보존제는 아마이드를 포함하는 상기의 동결보존제인 것을 더 포함한다.

더 바람직하게는 상기 정자동결방법이 돼지의 정자에 관한 것임을 포함한다.

본 발명에서는 동결보존제로서 한계가 있는 글리세롤을 대신하여 글리세롤보다 분자량과 분자의 크기가 작아 정자의 세포막을 통해 침투가 용이하고 살아있는 세포에 독성이 덜한 아마이드는 정자의 동결에 있어 글리세롤보다 우수한 동결보존제로 유용하게 쓰일 수 있다. 뿐만 아니라, 이를 이용하여 정자를 보다 효율적으로 동결시킬 수 있다. 이 물질로 인한 동결 정자의 향상된 운동성과 생존율은 이용가치가 매우 높으며, 특히 이를 이용한 돼지 정자의 동결과 그 응용이 기존보다 수월해질 것이라 기대된다.

이하, 본 발명의 실시예를 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시 예 1>

1. 돼지 정자 동결을 위한 희석액의 제조

(1) 1차 희석액의 제조

본 발명에서 사용된 희석액은 Beltsvile F5(BF5; Pursel and Johnson, 1975)이며, 이 용액으로 원 정액을 일차 희석하였다. BF5 희석액의 성분과 비율을 간단 한 표로 나타내었다. 실험에서 사용된 용액의 제조는 용액의 신선도를 유지하기 위해 동결 정액 제조 전날에 만들어 두었다.

BF5 용액(제 1차 희석액, J Anim Sci 40:99-102, 1975)
Component	g/1,000mL	Manufacture
TES Trizma Base(Tris) D(+)-Glucose OEP Gentamycin sulfate Egg yolk	12.00 2.00 32.00 5.00(5mL) 0.02 200mL	Sigma T-1375 Sigma T-1503 Ishizu 012-3333 Sigma G 1264

#1. TES, Tris, glucose 및 Gentamycin sulfate를 800mL의 정제수에 용해시키고, 플라스틱 실린지를 이용하여 OEP를 넣은 후 각반혼합해 둔다.

#2. OEP가 글리스처럼 점도가 높을 경우는 온탕에 넣어준다.

#3. 계란을 깨어 난황(egg yolk)만을 여과지 위에서 굴리면서 여분의 난백을 제거한다.

(2) 2차 희석액의 제조

사용하는 원 정액의 농도가 매 실험마다 다른 점에 유의하여 1L정도 희석액을 제조하였다. 제조한 BF5에 효과를 입증하려고 하는 3가지 Amide 물질과 대조 그룹 물질(無 첨가/글리세롤)을 첨가하여 이차 희석을 위한 용액을 만들었다. 이 때 BF5에 첨가하는 Amide 물질들의 농도는 동결보존제로서 글리세롤의 최적 농도인 2%와 동일하게 하였다..

이차 희석액의 성분과 비율을 간단한 표로 나타내었다.

제 2차 희석액 (J Anim Sci 40:99-102, 1975)
Component	Volume
group 1. BF5	500mL
group 2. BF5+Glycerol(2%)	490mL+10mL
group 3. BF5+Methylformamide(2%)	490mL+10mL
group 4. BF5+Dimethylformamide(2%)	490mL+10mL
group 5. BF5+Urea(2%)	490mL+10mL

2. 정장 분리 용액의 제조

원 정액의 정장 (精漿, Seminal fluid )은 정자의 동결능을 저하시키기 때문에 제거시켜야 한다. 이를 위해 Hulsen 용액을 제조하였다. Hulsen 용액의 성분과 비율을 [표3]으로 나타내었다.

Hulsen 용액 (Dtseh Tierarztl Wsher 82:155-162, 1975)
Component	g/500mL	Manufacturer
D(+)-Glucose	28.75	Ishizu 012-3333
α-Lactose	1.25	Sigma L2643
Sodium citrate · 2H₂O (C₆H₅Na₃O₇ · 2H₂O)	2.25	Ishizu 014-4123
Na₂-EDTA	1.75	Sigma ED₂SS
NaHCO₃	0.60	Ishizu
KCl	0.20	Ishizu
Gentamycin sulfate	0.01	Sigma G1264

3. 돼지 정자의 동결 방법

(1) 사용된 정액의 조건

본격적인 돼지 정자의 동결에 앞서 수퇘지로부터 채취한 원 정액의 정자농도와 정자활력을 검사하였다. 정자농도는 원 정액을 정제수로 400배 희석한 다음 Hematocytometer로 3회 count한 뒤에 그 평균치로 산정했고 정자활력은 80%이상을 기준으로 사용여부를 결정하였고, 조건이 이에 미치지 못하는 원 정액은 실험에 이용되지 않았다.

(2) 돼지 정자의 동결 방법

Water-bath의 수온을 채취한 정액의 온도와 동일하게 맞추고 1시간에 거쳐 15℃까지 일차 냉각하였다. 이 BF5 희석액도 정액과 동시에 bath에 넣어서 정액과 동일한 온도로 냉각하였다.

정장을 분리하기 위해 일차 냉각시킨 원 정액을 5개 Tube(None, Glycerol, Methylformamide, Dimethylformamide, Urea)에 각각 10mL씩 분주하고, 제조해 놓은 Hulsen 용액을 각각 20mL를 넣어서 합계 30mL로 하였다. Hulsen 용액과 혼합한 정액를 2400g로 3분간 17℃에서 원심분리 하였다.

원심분리 후, 상층액(정장)을 파스퇴르 피펫을 이용하여 정자 pellet을 보존하면서 제거하였다.

정장이 제거된 5개의 튜브 각각을 BF5 희석액으로 일차 희석하였다. 일차 희석단계가 동결에 적당한 정자 농도(10⁹/mL)를 맞춰야 하는 단계이다. 예를 들어, count한 원 정액의 농도가 2×10⁹/mL일 경우 정장 분리과정에서 각 tube에 넣은 정액량이 10mL였다면 tube 1개의 정자수는 2×10^10/원심관이 된다. 이 원심관에 BF5 희석액을 20mL 넣으면 정자농도는 10⁹/mL이 되지만 이차 희석에서 다시 1:1로 희석하게 되므로 BF5를 10mL씩만 넣어 정자농도를 2×10⁹/mL로 해둔다. BF5 희석액을 각 tube에 넣은 후 파스퇴르 피펫으로 정자와 잘 혼합한다.

일차 희석된 정자(15℃)를 냉장고 내에서 1시간 동안 5℃까지 이차 냉각시켰다. 이 때 이차 희석액도 동일한 온도로 같이 냉각시킨다. 5℃까지 냉각한 정자를 동결보존제를 첨가한 이차 희석액으로 1:1∼2배 희석하고 혼합하여 동결할 때까지 얼음에 정치해 두었다.

4. 2차 희석액에 첨가한 동결보존제에 포함된 아마이드의 효과

(1) 희석을 한 다섯 그룹의 정자를 실린지와 0.5mL straw를 이용해 sample을 만들었다. (각 tube 당 15개). 실린지에 straw를 꽂아 1cm 가량만 남기고 최종 희석액을 빨아들이고 straw안에 공기가 들어가지 않도록 주의하면 sealing해준 다음, 얼음물에 정치해 두었다.

액체 질소를 사용한 극저온 동결 과정에 들어가기 전에, 액체 질소 증기를 쐬어 예비 동결을 시킨 뒤 색깔이 변한 straw들을 액체 질소에 빠뜨려 담갔다.

작업이 끝나면 canister에 straw를 담아 액체 질소 탱크에 보관한다.

(2) 정자의 운동성 측정

액체 질소 탱크에 투입하고 시간이 경과한 후 straw sample을 꺼내 50℃에서 정확히 15초 융해하였다. 5개 그룹의 각 straw를 융해 한 후, 위상차 현미경을 이용해 운동성을 관찰하고 동결 정자 100마리당 움직이는 정자 수로 %수치를 산정하여 [표4]에 나타내었다.

이차 희석액에 첨가한 동결보존제	운동성(Motility, %)
None	3%
Glycerol	35%
Methylformamide	32%
Dimethylformamide	45%
Urea	40%

융해 후 운동성은 Dimethylformamide(2%)가 가장 우수하였고 글리세롤보다 우수한 동결 보존효과를 보여주었다. 또한 Urea(2%)를 사용한 그룹도 글리세롤 보다 높은 운동성을 나타내었고 Methylformamide(2%)도 글리세롤보다는 떨어지지만 유사한 수치의 운동성을 나타내었다. 한편 어떤 동결보존제도 첨가하지 않은 그룹은 3% 미만의 낮은 운동성을 보였다.

(3) 정자의 생존률 측정

1993년 Molecular Probes에 의해 입증된 막 투과성 핵 염색약인 SYBR-14와 PI(대조염색)로 염색한 동결 정자의 융해 후 생존율을 측정하기 위해서 Flow cytometry를 사용하였다. 상기 염색의 결과는 <그림1>에서 나타나고 있는 바와 같이 SYBR-14는 융해 후 생존해 있는 정자의 DNA에 녹색으로 염색시키고, PI는 SYBR-14의 대조 염색으로서 사멸된 정자의 DNA에 붉게 염색시킨다.

<그림1. 동결 정자의 융해 후 생존률 측정>

Flow cytometry를 통해서 융해 후 생존한 동결정자(녹색으로 염색)의 수를 측정하여 %수치로 산정하여 [표5]에 나타내었다. 융해한 동결 정자 100마리당 생존 정자의 비율로 나타낸다.

이차 희석액에 첨가한 동결보존제	생존율(Viability, %)
None	6%
Glycerol	45%
Methylformamide	43%
Dimethylformamide	47%
Urea	45%

세 가지 아마이드(Amide) 물질 중, 글리세롤을 동결 보존제로 사용한 그룹과 비교했을 때 Dimethylformamide 그룹의 생존율(47%)이 가장 높았으며 Urea(45%), Methylformamide(43%)그룹의 생존율은 글리세롤(45%)과 비슷한 수치를 보였다. 어떤 동결보존제도 첨가하지 않은 그룹(6%)은 극히 낮은 생존율을 보였다.

이 결과를 통해 동결보존제가 동결 과정 중에 정자가 받는 손상을 감소시킨다는 것을 확인할 수 있다.

(4) 정자의 정상 첨체 비율 측정

NAR(Normal Acrosome Ridge)은 동결 정자의 융해 후 정상 첨체 비율로서, 이를 측정하여 정자 형태의 손상정도를 파악할 수 있다. NAR을 측정하기 위해서 Spermac stain을 이용하였다. 염색방법은 Spermac kit manufaturer's guidelines (Stain Enterprises, Onderstepoort, South Africa)에 따라 수행하였다. 융해한 동결 정자를 슬라이드에 도말하여 공기 중에서 건주 후 formalin이 함유된 Fixative Ι으로 고정하고 stain solution A 5분, stain solution B로 1분, stain solution C로 1분 3단계로 염색하였다. 염색 후 광학 현미경 하에서 총 100개의 정자를 관찰하였다.

정상 첨체는 정자 두부(頭部)가 전체적으로 녹색으로 염색되고 두부의 끝부분에 얇게 진한 녹색 띠가 나타나며 적도대는 붉은색으로 염색된 모습을 보인다. 하지만 첨체가 손상된 경우는 두부 끝부분의 녹색 띠가 끊어져 있다.

<그림2. NAR 측정을 위한 Spermac stain 의 결과>

이를 통해 정상 첨체와 손상된 첨체를 가진 정자를 구분하고 100개의 정자 중 정상 첨체를 가진 정자의 비율을 %수치로 산정하여 [표6]에 나타내었다.

이차 희석액에 첨가한 동결보존제	NAR(%)
None	17%
Glycerol	30%
Methylformamide	37%
Dimethylformamide	38%
Urea	33%

NAR 수치가 높다는 것은 동결로 인한 첨체의 손상이 적다는 것을 의미한다. 본 발명에서는 글리세롤을 동결 보존제로서 사용한 그룹의 NAR 수치보다 3가지 아마이드(Amide)를 사용한 그룹의 수치가 다소 높다는 결과를 얻었다.

어떤 동결보존제도 첨가하지 않은 그룹은 낮은 NAR 수치를 나타내었는데, 이 결과를 통해서도 동결보존제가 정자가 받는 손상을 감소시킨다는 것을 알 수 있다.

<실시 예 2>

본 실시 예는 동결보존제로 사용한 3가지 아마이드(Amide) 물질 중 Urea에 대한 적정 농도의 측정에 관한 것이다.

Urea의 농도를 2%, 4%, 6%, 8%로 하여 각기 다른 이차 희석액을 제조하였고, 대조 그룹은 동결보존제를 첨가하지 않은 이차 희석액을 사용하였으며, 실험 과정은 실시 예 1과 동일하고 총 5개(0%, 2%, 4%, 6%, 8%)의 그룹으로 나누었다.

동결보존제 내의 Urea 농도에 따른 효과 확인

(1) 정자의 운동성 측정

각 그룹의 융해 한 동결 정자의 운동성은 위상차 현미경으로 관찰하였고, 정자 100마리당 운동성을 지니고 있는 정자의 비율로 운동성을 측정하였다. 각 5개의 그룹에 대한 동결 정자의 융해 후 운동성을 [표7]에 나타내었다.

Urea의 농도	운동성(Motility, %)
None	2%
2%	40%
4%	25%
6%	2%
8%	2%

표를 보면 2% Urea를 동결보존제로 사용한 그룹이 가장 우수한 동결 정자 운동성을 나타냄을 볼 수 있다. 운동성의 정도도 동결 전의 정자와 눈에 띄는 차이가 없다. Urea를 첨가하지 않은 그룹은 가장 낮은 운동성을 나타내었으며, 첨가한 Urea의 농도가 증가할수록 정자의 운동성이 감소함을 볼 수 있다.

(2) 정자의 생존률 측정

동결 정자의 융해 후 생존율을 측정하기 위해 SYBR-14와 PI 염색을 이용한 Flow cytometry를 시행한다. 방법은 실시 예 1과 같으며 각 그룹의 생존율을 [표8]에 나타내었다.

Urea의 농도	생존율(Viability, %)
None	6%
2%	40%
4%	28%
6%	10%
8%	9%

Urea의 농도 차에 따른 동결 정자의 융해 후 운동성 결과와 마찬가지로 2% Urea를 사용한 그룹에서 가장 높은 생존율을 나타내었고, 농도가 높아질수록 생존율이 떨어지는 경향을 보였다. 어떤 동결보존제도 첨가하지 않은 그룹은 극히 낮은 생존율을 나타내었다.

(3) 정자의 정상 첨체 비율 측정

이어서, 다섯 그룹의 동결 정자의 융해 후 NAR 측정결과를 [표9]에 나타내었다. 방법은 실시 예 1과 동일하다.

Urea의 농도	NAR(%)
None	13%
2%	28%
4%	14%
6%	10%
8%	10%

실시 예 1에서도 설명하였듯이, NAR 수치가 높다는 것은 정자가 동결 과정에서 손상을 그만큼 적게 받았다는 것을 의미한다. 2%의 Urea가 다섯 그룹 중에서 가장 높은 운동성을 나타낸 것과 마찬가지로 NAR 수치도 가장 높았다. 나머지 그룹의 결과는 확연한 수치 차이는 없었지만, Urea의 농도가 증가할수록 NAR 수치가 낮아지는 경향을 보였다.

Claims

아마이드 (Amide)를 유효성분으로 포함하는 정자의 동결보존제.
제1항에 있어서,

상기 아마이드는 메틸포름아마이드 (methylformamide), 디메틸포름아마이드 (dimethylformamide) 또는 우레아 (urea) 에서 선택되는 것을 특징으로 하는 동결보존제.
제2항에 있어서,

상기 메틸포름아마이드, 디메틸포름아마이드 또는 우레아는 2~4%의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 동결보존제.
제1항에 있어서,

상기 정자는 돼지의 정자인 것을 특징으로 하는 동결보존제.
정자 동결용 1차 희석액에 동결보존제가 첨가된 정자 동결용 희석액.
제5항에 있어서,

상기 1차 희석액은 TES 12g/1000mL, Tris 2g/1000mL, glucose 32g/1000mL, OEP 5g/1000mL, Gentamycin sulfate 0.02g/1000mL 및 난황(egg yolk) 200g/1000mL를 정제수에 혼합한 것으로 구성됨을 특징으로 하는 정자 동결용 희석액.
제5항에 있어서,

상기 동결보존제는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 의한 동결보존제인 것을 특징으로 하는 정자 동결용 희석액.
⑴ 원 정액과 정자 동결용 1차 희석액을 각각 1차 냉각하는 단계;

⑵ 상기 냉각된 원 정액을 정장분리용액과 혼합하여 원심분리한 후 상층액(정장)을 정자를 보존하면서 제거하는 단계;

⑶ 상기 정장이 제거된 정액을 상기 냉각된 정자 동결용 1차 희석액과 혼합하여 정자가 동결가능한 농도로 1차 희석하는 단계;

⑷ 상기 1차 희석된 정자 및 동결보존제가 포함된 정자 동결용 2차 희석액을 각각 2차 냉각하는 단계;

⑸ 상기 2차 냉각된 정자를 2차 희석액에 1:1∼2배 희석하고 혼합하여 동결할때까지 얼음에 정치하여 두는 단계;를 포함하여 이루어지는 정자 동결방법.
제8항에 있어서,

상기 1차 희석액은 TES 12g/1000mL, Tris 2g/1000mL, glucose 32g/1000mL, OEP 5g/1000mL, Gentamycin sulfate 0.02g/1000mL 및 난황(egg yolk) 200g/1000mL를 정제수에 혼합한 것으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서,

상기 정장분리용액은 글루코스 (glucose) 28.75 g/500mL, α-락토스 (α-lactose) 1.25 g/500mL, C₆H₅Na₃O₇·2H₂O (Sodium citrate·2H₂O) 2.25 g/500mL, Na₂-EDTA (disodium Ethylenediaminetetraacetic acid) 1.75 g/500mL, NaHCO₃ 0.60 g/500mL, KCl 0.20 g/500mL 및 Gentamycin sulfate 0.01 g/500mL 를 정제수에 혼합한 것으로 구성됨을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서,

상기 1차 냉각은 15℃까지 냉각함을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서,

상기 ⑵단계는 원 정액과 정장 분리 용액을 1:2로 혼합하여 17℃에서 3분간 원심분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서,

2차 냉각은 5℃까지로 냉각함을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서,

동결이 가능한 정자의 농도는 바람직하게는 10⁹ 개/mL 인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서,

상기 2차 희석액은 상기 1차 희석액에 동결보존제가 첨가된 것임을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서,

상기 2차 희석액에 포함되는 상기 동결보존제는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 동결보존제인 것을 특징으로 하는 방법.
제8항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 정자는 돼지의 정자인 것을 특징으로 하는 방법.