CN115191426A - 提高猪精液冷冻保存品质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种提高猪精液冷冻保存品质的方法，通过向猪精液稀释液中添加0.01‑40μM MitoQ，冷冻保存，其中10μM MitoQ可明显改善冷冻保存的猪精液品质；同时提高猪精子的运动能力，提高精子质膜完整性、线粒体活性。MitoQ能够通过降低线粒体氧化损伤保护线粒体，降低细胞氧化应激水平，从而提高生殖细胞冷冻后活力，延长精子体外保存时间；同时，冷冻解冻后精子活力与对照组相比能提高15％左右。本发明操作简便，应用成本低，效果显著，对猪不产生任何有害影响。可以为猪精液保存提供一定的数据支撑，在猪精液保存及相关的胚胎移植产业和胚胎工程中广泛应用，具有广阔的市场前景。

Description

提高猪精液冷冻保存品质的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种提高猪精液冷冻保存品质的方法。
背景技术
近年来，猪人工授精在家畜养殖上得到愈来愈普遍的应用，尤其是对于规模化、集约化、专业化养殖，人工授精技术发挥了重要作用。精液冷冻保存技术保证了人工授精对精液的需求不受时间和地域的限制。冷冻保存技术使得采精和受精在时间和空间上产生了分离，延长了精子的体外储存时间，便于长途运输，促进了遗传资源跨地区、跨国界的交流和共享，加快了畜群品种改良步伐，使得优秀畜种得到大范围的推广。
精子的冷冻保存是一个复杂的过程，为了获得令人满意的冻存结果，在冷冻过程中需要平衡多种因素。需要适宜的稀释剂、抗冻剂及其他添加剂，平衡温度和平衡时间、降温速率及解冻速率都是至关重要的，其每一项都有可能影响精液质量。在精液冷冻保存中，冷冻保护剂是精子超低温冻贮成功与否的关键。它主要作用是减少冷冻和解冻过程中细胞渗透性损伤和减少冰晶形成，细胞得以在超低温条件下保存。
目前，冷冻保护剂主要分为渗透性冷冻保护剂(如甘油、乙二醇等)和非渗透性冷冻保护剂(如单糖、卵黄、白蛋白等)。一般认为卵黄由于富含卵磷脂，能提高细胞外渗透压，稳定精子细胞膜，防止顶体外膜破裂作用，研究表明，在非冷冻条件下，卵黄能促进精子与卵透明带结合，从而提高顶体反应率。然而由于卵黄和尿道球腺分泌物之间存在着有害的相互作用，会使复温后精子存活率下降。
在过去的50年中冷冻精液技术迅猛发展，不同动物的精液冷冻都获得了较快的进展，牛的冷冻精液已经进入了产业化。猪的精子与其他家畜相比具有一定生理特性，冷冻后活力低、受胎率低，且不稳定，成为制约猪冷冻精子发展的桎梏。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高猪精液冷冻保存品质的方法。
为了提高猪冷冻精液解冻后活力以及存活时间，提升猪冷冻精液品质，本发明提供了添加抗氧化剂MitoQ的猪冷冻精液的制备方法。Mitoquinone(MitoQ)是一种新型线粒体靶向抗氧化剂，具有神经保护作用，包括增强神经和运动功能，以及减少氧化应激、细胞凋亡等作用。此外，MitoQ能够通过降低线粒体氧化损伤保护线粒体，从而降低细胞氧化应激水平，提高生殖细胞冷冻后活力。向稀释液内添加10μMMitoQ对猪精液进行冷冻保存，可显著提高猪精子冻后质量，包括冻后活力，运动能力显著提升，维持质膜和DNA完整，保护顶体和线粒体不受损伤。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供MitoQ在提高猪精液冷冻保存品质中的应用。
第二方面，本发明提供一种提高猪精液冷冻保存品质的方法，将猪精液与含有0.01-40μM MitoQ的精液稀释液等体积混合后进行冷冻。
优选地，精液稀释液中MitoQ的终浓度为5μM、10μM、20μM或40μM，更优选10μM。
前述的方法，将采集的猪精液与预热至37℃的基础稀释液等体积混合进行稀释，在室温静置1-2h，然后将猪精液与I液分别放入17℃恒温箱中平衡1-2h；将平衡后的猪精液于17℃800g离心12-20min；如果上清液中精子多可适当延长时间，收集上清液并测定上清液的体积和密度，计算总精子数，如果上清液中精子数超过10亿则需再次离心。离心后弃上清，用预热至37℃的I液对精子进行重悬，重悬后使精子密度达到20亿/ml，将重悬后的猪精液从17℃缓慢降温到4℃(2.5-3h)，并将猪精液与Ⅱ液等体积混合后放入4℃冰箱中平衡0.5-1h；最后，将平衡后的猪精液与4℃的II液等体积混合置于冻精细管中，可于液氮中长期冷冻保存。
其中，所述基础稀释液为：葡萄糖3.7g，EDTA0.125g，柠檬酸钠0.6g，碳酸氢钠0.125g，氯化钾0.075g，100IU青链霉素混合液(抑菌物质)10mL，加水定容至100mL。
所述I液为：乳糖4.25g，海藻糖4.25g，20mL鸡蛋卵黄液，加水定容至100mL。
所述II液为：甘油6mL，MitoQ 5-40μM，加入I液定容至100mL。
进一步地，冷冻保存后，解冻的方法包括：将冻精细管从液氮中取出，放入50℃水浴锅内摇晃16s后取出，再将冻精细管中的猪精液与预热至37℃的基础稀释液混合，用于后续检测或实验。
第三方面，本发明提供一种含有0.01-40μM MitoQ的猪精液稀释液。
优选地，猪精液稀释液中MitoQ的终浓度为5μM、10μM、20μM或40μM，更优选10μM。
第四方面，本发明提供一种用于提高猪精液冷冻保存品质的试剂盒，所述试剂盒包含上述猪精液稀释液。
第五方面，本发明提供上述猪精液稀释液在提高猪精液低冷冻保存品质方面的应用。
通过向猪精液稀释液中添加0.01-40μM(如5μM、10μM、20μM、40μM)MitoQ，冷冻保存，其中10μM MitoQ可明显改善冷冻保存的猪精液品质；同时提高猪精子的运动能力，提高精子质膜完整性、线粒体活性。MitoQ能够通过降低线粒体氧化损伤保护线粒体，降低细胞氧化应激水平，从而提高生殖细胞冷冻后活力。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供一种可以提高猪精液冷冻保存品质的精液稀释液，即通过添加MitoQ来提高动物精液保存品质。本发明提供的精液稀释液能够显著提高精液冷冻保存活性，延长精子体外保存时间；同时，冷冻解冻后精子活力与对照组相比能提高15％左右。
(二)本发明操作简便，应用成本低，效果显著，对猪不产生任何有害影响。可以为猪精液保存提供一定的数据支撑，在猪精液保存及相关的胚胎移植产业(人工授精技术)和胚胎工程中广泛应用，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中II液A、B、C、D、E中分别添加0μM、5μM、10μM、20μM、40μMMitoQ对精子冷冻保存活率影响的柱状图。
图2为本发明较佳实施例中II液A、B、C、D、E中分别添加0μM、5μM、10μM、20μM、40μMMitoQ对精子冷冻保存活力影响的柱状图。
图3为本发明较佳实施例中II液A、B、C、D、E中分别添加0μM、5μM、10μM、20μM、40μMMitoQ对精子冷冻保存DNA完整性影响的柱状图。
图4为本发明较佳实施例中II液A、B、C、D、E中分别添加0μM、5μM、10μM、20μM、40μMMitoQ对精子冷冻保存质膜完整性影响的柱状图。
图5为本发明较佳实施例中II液A、B、C、D、E中分别添加0μM、5μM、10μM、20μM、40μMMitoQ对精子冷冻保存线粒体活性影响的柱状图。
图6为本发明较佳实施例中II液A、B、C、D、E中分别添加0μM、5μM、10μM、20μM、40μMMitoQ对精子冷冻保存顶体完整性影响的柱状图。
具体实施方式
本发明提供一种提高精液冷冻保存品质的精液稀释液，其含有5-40μM的MitoQ，优选10μM。
研究发现，MitoQ可有效提高精液的冷冻保存质量及冷冻保存并解冻后的精液品质。
进一步地，当用于冷冻保存时，所述精液稀释液包括：基础稀释液、I液、Ⅱ液；所述基础稀释液以100mL计，含有如下成分：葡萄糖3.7g，EDTA 0.125g，柠檬酸钠0.6g，碳酸氢钠0.125g，氯化钾0.075g，100IU单位青链霉素混合液(抑菌物质)10mL。用蒸馏水配制。
I液以100mL计，含有如下成分：乳糖4.25g，海藻糖4.25g，20mL鸡蛋卵黄液。用蒸馏水配制。
Ⅱ液以100mL计，含有如下成分：甘油6mL，MitoQ 5-40μM，充分混匀后加入I液并定容至100mL。
在上述配方下进行等比例扩大或缩小均属于本发明的保护范围。
进一步地，将Ⅱ液分为A、B、C、D、E，所述Ⅱ液以100mL计；
Ⅱ液E：向容量瓶中加入甘油6mL，MitoQ 40μM，充分混匀后加入I液并定容至100mL，并使用微型漩涡混合仪充分混匀。
Ⅱ液D：向容量瓶中加入甘油6mL，MitoQ 20μM，充分混匀后加入I液并定容至100mL，并使用微型漩涡混合仪充分混匀。
Ⅱ液C(作为优选)：向容量瓶中加入甘油6mL，MitoQ 10μM，充分混匀后加入I液并定容至100mL，并使用微型漩涡混合仪充分混匀。
Ⅱ液B：向容量瓶中加入甘油6mL，MitoQ 5μM，充分混匀后加入I液并定容至100mL，并使用微型漩涡混合仪充分混匀。
Ⅱ液A(对照组)：向容量瓶中加入甘油6mL，充分混匀后加入I液并定容至100mL，并使用微型漩涡混合仪充分混匀。
本发明还提供一种提高精液冷冻保存品质的方法，使用前述精液稀释液对精液进行低温保存或冷冻保存。
所述冷冻保存具体为：精液采集后，检测精液的活率、体积、密度后。将合格精液与预热好的基础稀释液按照1:1体积比加入500mL的试剂瓶内进行稀释，于室温静置1-2h，然后将精液与I液分别放入17℃恒温箱中平衡1-2h。将平衡后的精液分装到50mL离心管中，17℃800g离心12-20min。如果上清液中精子多可适当延长时间，测定上清液的体积和密度，计算总精子数，如果超过10亿则需要将上清液再次离心。离心结束后弃掉上清液，用预热好的I液对精子进行重悬，重悬后使精子密度达到20亿/ml，将I液缓缓加入到离心后的精子沉淀底部，用吸吐方式混匀。将重悬后的精液从17℃缓慢降温到4℃(2.5-3h)，并将精液与Ⅱ液分别放入4℃冰箱中平衡0.5-1h。精液平衡结束后加入4℃的II液等量等温稀释，轻轻混匀后用自动灌装机进行灌装，封口，将封好的细管摆放在托架上，随后将托架放入程序冷冻仪器，对精液进行冷冻。精液冷冻完成后，将细管装入布袋做好标记保存在液氮罐中。
进一步地，所述冷冻保存具体为：精液采集后迅速检测精子活力与密度，活率0.8以上，精子密度2×108个/mL以上方可使用，否则弃去。将预热好的Ⅱ液A、B、C、D、E对平衡后的精液进行等量等温稀释，并分别标记A、B、C、D、E。将稀释后的5种精液进行冷冻。解冻后先后取出检测各个指标。
第三方面，本发明还提供前述精液稀释液在提高精液低冷冻保存品质方面的应用。
作为优选，本发明所提供的精液稀释液对猪精液的冷冻保存尤为适用，因此，所述精液优选来自猪。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1提高猪精液冷冻保存品质的方法
本实施例提供一种提高猪精液冷冻保存品质的方法，包括以下步骤：
(1)提取猪的新鲜精液，并将提取的新鲜精液放入精液收集袋中。
(2)将步骤(1)中盛有精液的收集袋放在恒温箱中，并将提取的精液运送至实验室，运送过程中防止恒温箱剧烈震荡。
(3)准备制作稀释液的原材料，葡萄糖、EDTA、柠檬酸钠、碳酸氢钠、氯化钾、青霉素、链霉素、乳糖、海藻糖、卵黄、甘油、抗冻剂、MitoQ。
(4)采用步骤(3)中的原材料配制稀释液，其中基础稀释液以100mL计，称取葡萄糖3.7g，EDTA 0.125g，柠檬酸钠0.6g，碳酸氢钠0.125g，氯化钾0.075g；加入50mL双蒸水，用磁力搅拌器搅拌均匀，充分溶解后加入容量瓶中，加入100IU单位青链霉素混合液10mL，定容到100mL，摇匀后分装，4℃保存；
I液以100mL计，称取乳糖4.25g，海藻糖4.25g；加入50mL双蒸水，充分溶解后加入容量瓶中，加入20mL鸡蛋卵黄液，定容至100mL，并使用微型漩涡混合仪充分混匀，现配现用；
Ⅱ液以100mL计，向容量瓶中加入甘油6mL，MitoQ 0.01-40μM，充分混匀后加入I液并定容至100mL，并使用微型漩涡混合仪充分混匀，现配现用。
(5)将步骤(4)制作的所述Ⅱ液以100mL计。
Ⅱ液E：向容量瓶中加入甘油6mL，MitoQ 40μM，充分混匀后加入I液并定容至100mL，并使用微型漩涡混合仪充分混匀。
Ⅱ液D：向容量瓶中加入甘油6mL，MitoQ 20μM，充分混匀后加入I液并定容至100mL，并使用微型漩涡混合仪充分混匀。
Ⅱ液C：向容量瓶中加入甘油6mL，MitoQ 10μM，充分混匀后加入I液并定容至100mL，并使用微型漩涡混合仪充分混匀。
Ⅱ液B：向容量瓶中加入甘油6mL，MitoQ 5μM，充分混匀后加入I液并定容至100mL，并使用微型漩涡混合仪充分混匀。
Ⅱ液A(对照组)：向容量瓶中加入甘油6mL，充分混匀后加入I液并定容至100mL，并使用微型漩涡混合仪充分混匀。
(6)对步骤(2)中的鲜精进行稀释：采精前将基础稀释液置于37℃水浴锅内进行预热，将合格精液与预热好的基础稀释液按照1:1体积比加入500mL的试剂瓶内进行稀释，在室温静置1-2h，然后将精液与I液分别放入17℃恒温箱中平衡1-2h。将平衡后的精液分装到50mL离心管中(离心前电子天平称量空离心管重量并编号)，17℃800g离心12-20min。如果上清液中精子多可适当延长时间，测定上清液的体积和密度，计算总精子数，如果超过10亿则需要将上清液再次离心。离心结束后弃掉上清液，用预热好的I液对精子进行重悬，重悬后使精子密度达到20亿/ml，将I液缓缓加入到离心后的精子沉淀底部，用吸吐方式混匀。将重悬后的精液从17℃缓慢降温到4℃(2.5-3h)，并将精液与不同浓度的Ⅱ液分别放入4℃冰箱中平衡0.5-1h。
(7)对步骤(6)中稀释的精液冷冻保存：精液平衡结束后在低温操作柜中加入4℃的不同浓度II液等量等温稀释，轻轻混匀后用自动灌装机进行灌装，封口，将封好的细管摆放在托架上，随后将托架放入程序冷冻仪器，对精液进行冷冻。精液冷冻完成后，将细管装入布袋做好标记保存在液氮罐中。
(8)对步骤(7)中的精液进行解冻：将布袋从液氮罐里取出置于装有液氮的泡沫盒内，用长柄镊子夹出细管迅速放入50℃水浴锅内轻轻摇晃16s后取出，用无菌纱布将细管上的水分擦干，随后用专用剪刀剪去封口端，将剪开的一端迅速放入37℃内预热好的离心管中，使其缓缓流入离心管。将预热的基础稀释液加入离心管中，轻轻摇晃混匀，稀释后的精液可用于后续检测。
(9)对步骤(8)中5组冷冻保存的稀释精液中的活力、活率进行测定。将解冻后的精液放入预热离心管中，向离心管中加入三倍基础稀释液，轻轻摇晃混匀，在37℃水浴锅中孵育3min。用移液枪吸取8μL精液滴于预热好的载玻片上，轻轻覆盖盖玻片，将载玻片置于400倍显微镜下。通过精子辅助分析仪(CASA)分析，每次至少随机检测5个视野。
运动的精子占精子总数的比例即为精子活力，精子中呈直线运动的精子数占精子总数的百分比即为精子活率，然后依次对Ⅱ液A、B、C、D、E的精子活率、活力进行测定。
(10)对步骤(8)中5组冷冻保存的稀释精液中的DNA完整性进行测定。使用吖啶橙与碘化乙啶(EB)双标荧光染色法，向提前预热好的离心管中加入95μL稀释后的精液，迅速加入3μL吖啶橙及4μL EB，快速混匀，37℃避光孵育15min，然后加入8μL的Hancock’s溶液吹打混匀终止反应，使用移液枪吸取4μL的混合液于载玻片上，轻轻覆盖盖玻片，压片时尽量避免气泡的产生，使精子不再流动。将载玻片置于400倍荧光显微镜下观察，随机选取视野，快速拍照，计数至少400个精子。
吖啶橙/EB双标荧光染色的结果为：精子头部呈绿色为DNA双链精子，红色为DNA单链精子，橙黄色为DNA双链不稳定精子。精子DNA完整性为DNA双链精子数占精子总数的百分比，然后依次对Ⅱ液A、B、C、D、E的精子DNA完整性进行测定。
(11)对步骤(8)中5组冷冻保存的稀释精液中的质膜完整性进行测定。使用低渗膨胀法(HOST)向提前预热好的离心管中加入20μL精液，随后向离心管中加入180μL预热好的低渗溶液(逐步加入)，轻轻摇晃混匀，在37℃条件下孵育60min。使用移液枪吸取8μL混合液于载玻片上，涂片，自然风干后置于400×视野下拍照，随机选取视野，计数至少400个精子。弯尾参照世界卫生组织(WHO)制定的精子尾部肿胀标准。
精子质膜完整率为质膜完整的精子占总精子数的百分比，然后依次对Ⅱ液A、B、C、D、E的精子质膜完整性进行测定。
(12)对步骤(8)中5组冷冻保存的稀释精液中的线粒体活性进行测定。使用JC-1与碘化丙啶(PI)双标荧光染色法，向提前预热好的离心管中加入55μL稀释后的精液，迅速加入2μL JC-1及8μL PI，快速混匀，37℃避光孵育15min，然后加入8μL的Hancock’s溶液吹打混匀终止反应。使用移液枪吸取4μL的混合液于载玻片上，轻轻覆盖盖玻片，手指轻轻按压盖玻片挤出气泡及多余的液体，使精子不再流动。将载玻片置于400倍荧光显微镜下观察，随机选取视野，快速拍照，计数至少400个精子。
JC-1/PI双荧光染色的结果为：尾部呈橙色荧光的精子为高线粒体膜电位精子；尾部呈绿色荧光的精子为低线粒体膜电位精子。精子线粒体活性为高线粒体活性的精子占精子总数的百分比，然后依次对Ⅱ液A、B、C、D、E的精子线粒体活性进行测定。
(13)对步骤(8)中5组冷冻保存的稀释精液中的顶体完整性进行测定。使用金霉素荧光染色法(CTC)：向提前预热好的离心管中加入30μL稀释后的精液，然后加入等量CTC染色液，快速混匀，37℃避光孵育1min，然后加入8μL的Hancock’s溶液吹打混匀终止反应，使用移液枪吸取4μL的混合液于载玻片上，轻轻覆盖盖玻片，压片时尽量避免气泡的产生，使精子不再流动。将载玻片置于400倍荧光显微镜下观察，随机选取视野，快速拍照，计数至少400个精子。
金霉素荧光染色结果为：精子头部发出强烈黄绿色荧光为顶体完整精子，精子头部无荧光为顶体损伤精子。精子顶体完整性为顶体完整精子数占精子总数的百分比，然后依次对Ⅱ液A、B、C、D、E的精子顶体完整性进行测定。
(14)对步骤(8)中5组冷冻保存的稀释精液中的抗氧化相关指标进行测定。抗氧化酶的提取与保存：取120μL解冻后精液样品25℃1600×g离心10min，弃去上清，向沉淀中加入400μL 1％TritonX-100，冰上裂解20min，裂解完成后将样品以25℃10000×g离心15min，保留上清液，分装后-80℃冷冻保存备用。
MDA使用南京建成MDA试剂盒(货号A003-1，TBA法)进行测定，照着说明书依次加入待测样品和相应试剂后，95℃水浴80min，取出后流水冷却4000转/分，离心10min。吸取上清200μL，使用酶标仪在532nm处，1cm光径，测定各管吸光度以计算MDA含量，结果以nmoL/mL为单位。
T-AOC使用南京建成T-AOC试剂盒(货号A015-2-1，ABTS法)进行测定，制作标准曲线，使用作图工具制得曲线公式。按照操作步骤添加待测样品及试剂，室温反应6min，波长405nm处读取OD值，将测得OD值代入曲线公式求得结果，结果以mM为单位。
SOD、CAT、GSH-Px均用试剂盒提供的方法测定，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，根据试剂盒的使用方法分别检测解冻后各试验组的酶活性，结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003659347470000081
注：不同肩标字母表示差异显著。
向II液A、B、C、D、E中分别添加0μM、5μM、10μM、20μM、40μM MitoQ对精子冷冻保存活率影响的柱状图见图1。
向II液A、B、C、D、E中分别添加0μM、5μM、10μM、20μM、40μM MitoQ对精子冷冻保存活力影响的柱状图见图2。
向II液A、B、C、D、E中分别添加0μM、5μM、10μM、20μM、40μM MitoQ对精子冷冻保存DNA完整性影响的柱状图见图3。
向II液A、B、C、D、E中分别添加0μM、5μM、10μM、20μM、40μM MitoQ对精子冷冻保存质膜完整性影响的柱状图见图4。
向II液A、B、C、D、E中分别添加0μM、5μM、10μM、20μM、40μM MitoQ对精子冷冻保存线粒体活性影响的柱状图见图5。
向II液A、B、C、D、E中分别添加0μM、5μM、10μM、20μM、40μM MitoQ对精子冷冻保存顶体完整性影响的柱状图见图6。
进一步地，步骤(1)中提取精液的对象为猪，新鲜精液中的精子存活率在0.8以上，防止提取的猪精液中的精子存活率较低而影响后期实验的结果。
进一步地，步骤(2)中恒温箱的温度为37℃，由于猪正常体温在37℃左右，可使提取后精子的温度与猪正常体温保持一致，增加猪精子的存活率,从而防止恒温箱温度过高或者过低造成猪精子大量死亡。
进一步地，步骤(2)中运输时间不能超过30min，提取后的猪鲜精液中的精子，由于运输过程中恒温箱的温度为37C，正常温度下猪鲜精液中的精子存活时间较短，会影响后期的实验结果。
进一步地，步骤(6)中加稀释液时沿着离心管的管壁将稀释液加入精液，边加边混匀，避免分步稀释和快速稀释，防止稀释对精子造成的不可逆恢复。
从图1～图6可知，对照试验即添加II液A的试验在猪冷冻保存稀释液中未加入MitoQ，而II液B、II液C、II液D、II液E中加入MitoQ，且MitoQ在II液B、II液C、II液D、II液E中添加的量分别为5μM、10μM、20μM、40μM，II液C的添加可显著提高猪精子冻后质量，包括冻后活力、运动能力显著提升，维持质膜和DNA完整，保护顶体和线粒体不受损伤；有效的降低了MDA浓度和ROS水平，显著提高了解冻后猪精子T-AOC、GSH-Px及CAT活性。
由以上实验结果可得，MitoQ作为一种线粒体靶向抗氧化剂能提高猪精子质量，推测MitoQ可以穿过线粒体双层膜，达到线粒体内部发挥清除ROS的作用，从而减弱脂质过氧化反应，降低精子在冷冻过程中因氧化应激而受到的损伤，因此，MitoQ对精子的保护作用可能是通过降低线粒体氧化损伤保护线粒体，从而降低细胞氧化应激水平，提高生殖细胞冷冻后活力。
本发明相较于传统精液冷冻保存的方法，具有成本低、操作简易等优点。通过向猪冷冻保存稀释液中添加MitoQ可迅速作用于精子，有着极强的抗氧化能力，能保护精子避免氧化应激损伤，进而提高精液冷冻保存效果。线粒体靶向抗氧化剂Mito Q是一种线粒体靶向抗氧化剂，并已证明其在抗氧化等方面有积极作用，研究表明在羊精液体外保存试验中，添加适量浓度的MitoQ对精液的冷冻保存具有积极作用，可降低解冻后精液中ROS、MDA含量，提高冷冻-解冻后精液质量。本发明在冷冻稀释液中添加不同浓度的MitoQ(5、10、20、40μM)进行冷冻并检测解冻后猪精液的相关指标，并筛选出最适于猪精子冷冻保存的浓度。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.MitoQ在提高猪精液冷冻保存品质中的应用。
2.提高猪精液冷冻保存品质的方法，其特征在于，将猪精液与含有0.01-40μMMitoQ的精液稀释液混合后进行冷冻。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，精液稀释液中MitoQ的终浓度为5μM、10μM、20μM或40μM，优选10μM。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将采集的猪精液与预热至37℃的基础稀释液等体积混合进行稀释，在室温静置1-2h，然后将猪精液与I液分别放入17℃恒温箱中平衡1-2h；将平衡后的猪精液于17℃800g离心12-20min；收集上清液并测定上清液的体积和密度，计算总精子数，如果上清液中精子数超过10亿则需再次离心；离心后弃上清，用预热至37℃的I液对精子进行重悬，重悬后使精子密度达到20亿/ml，将重悬后的猪精液从17℃降温到4℃，并将猪精液与Ⅱ液等体积混合后放入4℃冰箱中平衡0.5-1h；最后，将平衡后的猪精液与4℃的II液等体积混合置于冻精细管中，于液氮中冷冻保存；
其中，所述基础稀释液为：葡萄糖3.7g，EDTA 0.125g，柠檬酸钠0.6g，碳酸氢钠0.125g，氯化钾0.075g，100IU青链霉素混合液10mL，加水定容至100mL；
所述I液为：乳糖4.25g，海藻糖4.25g，20mL鸡蛋卵黄液，加水定容至100mL；
所述II液为：甘油6mL，MitoQ 5-40μM，加入I液定容至100mL。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，冷冻保存后，解冻的方法包括：将冻精细管从液氮中取出，放入50℃水浴锅内摇晃16s后取出，再将冻精细管中的猪精液与预热至37℃的基础稀释液混合，用于后续检测或实验。
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