CN115251046A - 一种精液冷冻稀释液及其在冷冻保存奶山羊精液中的应用 - Google Patents

一种精液冷冻稀释液及其在冷冻保存奶山羊精液中的应用 Download PDF

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CN115251046A CN202210990690.4A CN202210990690A CN115251046A CN 115251046 A CN115251046 A CN 115251046A CN 202210990690 A CN202210990690 A CN 202210990690A CN 115251046 A CN115251046 A CN 115251046A
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Abstract

本发明涉及精液冻存技术领域，特别是涉及一种精液冷冻稀释液及其在冷冻保存奶山羊精液中的应用。本发明所述精液冷冻稀释液的制备方法包括以下步骤：将A液、卵黄、青霉素、链霉素和N,N‑二甲基甲酰胺混合，得到B液；将所述B液和甘油混合，得到所述精液冷冻稀释液；所述A液包括以下浓度的组分：葡萄糖25～40g/L、乳糖30～46g/L和柠檬酸钠10～15g/L。本发明通过适宜组分复配制备的精液冷冻稀释液，显著提高了冷冻处理的精液在解冻后的精子成活率、精子活力和顶体完整率；另外，本发明通过精液冷冻稀释液结合程序控制降温冷冻方法，进一步提高了冷冻处理的精液在解冻后的精子成活率、精子活力和顶体完整率。

Description

一种精液冷冻稀释液及其在冷冻保存奶山羊精液中的应用
技术领域
本发明涉及精液冻存技术领域，特别是涉及一种精液冷冻稀释液及其在冷冻保存奶山羊精液中的应用。
背景技术
长期以来国内外许多学者在羊精液保存方面做了大量研究工作，主要集中在羊精液冷冻稀释液方面，研究发现精子在降温和冷冻保存的过程中，很容易产生各种损伤，包括物理性的、化学性的和生物性的损伤。冷冻处理的精液在解冻后与新鲜精液相比较，其精子的成活率、精子活力和顶体完整率显著下降，这对生产实践来说是极其不利的。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种精液冷冻稀释液及其在冷冻保存奶山羊精液中的应用。本发明提供的精液冷冻稀释液显著提高了冷冻处理的精液在解冻后的精子成活率、精子活力和顶体完整率。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种精液冷冻稀释液，所述精液冷冻稀释液的制备方法包括以下步骤：
将A液、卵黄、青霉素、链霉素和N,N-二甲基甲酰胺混合，得到B液；
将所述B液和甘油混合，得到所述精液冷冻稀释液；
所述A液包括以下浓度的组分：葡萄糖25～40g/L、乳糖30～46g/L和柠檬酸钠10～15g/L；
所述B液中卵黄的浓度为100～150mL/L；
所述B液中青霉素的浓度为50～150万IU/L；
所述B液中链霉素的浓度为50～150万IU/L；
所述B液中N,N-二甲基甲酰胺的浓度为0.1～1mL/L；
所述精液冷冻稀释液中甘油的浓度为30～80mL/L。
优选的，所述精液冷冻稀释液的pH值为6.5～7。
优选的，所述A液的溶剂包括无菌双蒸水。
本发明还提供了上述精液冷冻稀释液在冷冻保存动物精液中的应用。
优选的，所述动物包括羊。
优选的，所述羊包括奶山羊。
本发明还提供了一种冷冻保存动物精液的方法，包括以下步骤：
将待保存的精液和上述精液冷冻稀释液混合后平衡2h，得到稀释精液；
将所述稀释精液进行降温冷冻处理。
优选的，所述降温冷冻包括：以5～10℃/min降温速率将所述稀释精液降至-10℃；然后以40℃/min降温速率将-10℃的稀释精液降至-100℃；最后以25～30℃/min降温速率将-100℃的稀释精液降至-140℃。
优选的，所述平衡的温度为5℃。
优选的，所述待保存的精液和所述精液冷冻稀释液的体积比为1：10～11。
有益效果：
本发明提供了一种精液冷冻稀释液，所述精液冷冻稀释液的制备方法包括以下步骤：将A液、卵黄、青霉素、链霉素和N,N-二甲基甲酰胺混合，得到B液；将所述B液和甘油混合，得到所述精液冷冻稀释液；所述A液包括以下浓度的组分：葡萄糖25～40g/L、乳糖30～46g/L和柠檬酸钠10～15g/L；所述B液中卵黄的浓度为100～150mL/L；所述B液中青霉素的浓度为50～150万IU/L；所述B液中链霉素的浓度为50～150万IU/L；所述B液中N,N-二甲基甲酰胺的浓度为0.1～1mL/L；所述精液冷冻稀释液中甘油的浓度为30～80mL/L。本发明通过适宜组分复配制备的精液冷冻稀释液，显著提高了冷冻处理的精液在解冻后的精子成活率、精子活力和顶体完整率；精液经冷冻-解冻处理后，精液的精子活率、精子活力、顶体完整率分别可以达到75.21±3.14％，36.54±1.86％和85.56±2.09％。
具体实施方式
本发明提供了一种精液冷冻稀释液，所述精液冷冻稀释液的制备方法包括以下步骤：
将A液、卵黄、青霉素、链霉素和N,N-二甲基甲酰胺混合，得到B液；
将所述B液和甘油混合，得到所述精液冷冻稀释液。
如无特殊说明，本发明对所述精液冷冻稀释液的各组分来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
本发明将A液、卵黄、青霉素、链霉素和N,N-二甲基甲酰胺混合，得到B液。
在本发明中，所述精液冷冻稀释液的pH值优选为6.5～7。
在本发明中，所述A液包括葡萄糖25～40g/L，优选为30～35g/L，更优选为31g/L。
在本发明中，所述A液包括乳糖30～46g/L，优选为35～46g/L，更优选为46g/L。本发明提供的葡萄糖和乳糖不仅是营养物质，为精子提供所需的能量，而且适宜浓度的葡萄糖和乳糖可以增加溶液渗透压，在冷冻时有助于细胞脱水，减少胞内冰晶的形成，起到冷冻保护作用。
在本发明中，所述A液包括柠檬酸钠10～15g/L，优选为12～15g/L，更优选为15g/L。本发明提供的柠檬酸钠具有pH缓冲作用，可以维持稀释后精子所处环境pH的稳定，避免精液pH值发生大幅变化而导致精子死亡及丧失受精能力。
在本发明中，所述A液的溶剂优选包括无菌双蒸水。
在本发明中，所述A液、卵黄、青霉素、链霉素和N,N-二甲基甲酰胺混合的方法优选包括：将卵黄、青霉素、链霉素和N,N-二甲基甲酰胺溶解在部分A液中，用剩余A液定容，得到B液；所述部分A液的体积优选为B液体积的50％～70％。
在本发明中，所述B液中卵黄的浓度为100～150mL/L，优选为130～150mL/L，更优选为150mL/L。在本发明中，所述卵黄优选包括新鲜卵黄，更优选包括新鲜鸡卵黄。本发明提供的卵黄具有冷冻保护作用，可以预防精子冷休克的发生，提高精子解冻后的活率。
在本发明中，所述B液中青霉素的浓度为50～150万IU/L，优选为70～120万IU/L，更优选为100万IU/L。
在本发明中，所述B液中链霉素的浓度为50～150万IU/L，优选为70～120万IU/L，更优选为100万IU/L。
在本发明中，所述B液中N,N-二甲基甲酰胺的浓度为0.1～1mL/L，优选为0.2～0.8mL/L，更优选为0.5mL/L。本发明通过适宜浓度的N,N-二甲基甲酰胺可以防御氧化反应产生的自由基引起精子氧化应激，提升精子解冻后品质。
得到B液后，本发明将所述B液和甘油混合，得到所述精液冷冻稀释液。
在本发明中，所述精液冷冻稀释液中甘油的浓度为30～80mL/L，优选为40～70mL/L，更优选为60mL/L。本发明提供的甘油具有冷冻保护作用，可以保护冷冻对精子造成的损伤。
本发明还提供了上述技术方案所述精液冷冻稀释液在冷冻保存动物精液中的应用。
在本发明中，所述动物优选包括羊，进一步优选包括奶山羊，更优选为关中奶山羊。
本发明还提供了一种冷冻保存动物精液的方法，包括以下步骤：
将待保存的精液和上述技术方案所述精液冷冻稀释液混合后平衡2h，得到稀释精液；
将所述稀释精液进行降温冷冻处理。
本发明将待保存的精液和所述精液冷冻稀释液混合后平衡2h，得到稀释精液。在本发明中，所述待保存的精液的精子密度优选≥2×109个/mL；所述待保存的精液的精子活力优选≥0.7。
在本发明中，所述平衡优选为在温度为5℃下静置处理，更优选为混合后将装有混合液的容器用10层纱布包裹在5℃静置2h。在本发明中，所述待保存的精液和所述精液冷冻稀释液的体积比优选为1：10～11。
得到稀释精液后，本发明将所述稀释精液进行降温冷冻处理。在本发明中，所述降温冷冻优选包括：以5～10℃/min降温速率将所述稀释精液降至-10℃；然后以40℃/min降温速率将-10℃的稀释精液降至-100℃；最后以25～30℃/min降温速率将-100℃的稀释精液降至-140℃。
本发明将所述稀释精液降至-10℃的降温速率优选为5～10℃/min，进一步优选为5～8℃/min，更优选为5℃/min。
本发明将-100℃的稀释精液降至-140℃的降温速率优选为25～30℃/min，进一步优选为25～28℃/min，更优选为25℃/min。
本发明将所述稀释精液进行降温冷冻处理后，优选还包括冷冻完成后的稀释精液在液氮中长期保存。
在精液冷冻过程中，精子细胞受到损伤的温度主要是在0℃～-60℃。当温度下降到-5℃时，精子细胞内水分会向外流失，精子内部溶液浓度就会升高，使得细胞内外渗透压不一致。本发明提供的精液稀释液是高渗溶液，在冷冻时有效的平衡细胞内外渗透压。在-5℃时，细胞和细胞外液仍然未结晶，在-5℃～-10℃时，细胞外液才形成冰晶，但是细胞内水相仍然未结晶，这时如果快速降温，细胞内的水不能渗出，使细胞质内水相形成冰晶，导致精子细胞受到损伤或死亡；如果降温速率很低，细胞中大部分水分渗出，细胞内溶质高度浓缩，虽然细胞质水相不会冻结，但是细胞持续处于高渗状态，细胞持续收缩，使细胞器和细胞膜收缩受损。-10℃～-60℃，此时为极低温，仍可以形成冰晶而对细胞产生致死作用，为危险温度区，若降温缓慢，冰晶越大数量越多，对精子的伤害越大。-60℃～-250℃为玻璃化温度区，细胞内外水分形成一种冰冻状态，精子不会脱水，而且减少了冰晶对精子膜结构的破坏，保持精子细胞结构的完整。然而解冻精子时，也要快速溶解，促使细胞外冰晶迅速融化，防止水分渗入胞内再次形成冰晶而造成精子细胞的二次伤害。因此，精子冷冻的关键因素在于探究其最佳冷却时间和解冻速率，精子快速通过危险温度区可以免受冰晶的损害。本发明通过适宜的降温冷冻处理，不仅能有效提高解冻后精液的精子活率、精子活力、顶体完整率，降低精子畸形率，提高奶山羊冻精生产效率及冻精品质。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种精液冷冻稀释液及其在冷冻保存奶山羊精液中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种精液冷冻稀释液，由以下制备方法得到：
(1)配置A液：将葡萄糖2.5g，乳糖3.0g，柠檬酸钠1.0g，加50mL无菌双蒸水溶解，定容至100mL，得到A液；
(2)配置B液：将新鲜鸡卵黄10mL，10万IU青霉素，10万IU链霉素，N,N-二甲基甲酰胺0.01mL，加50mLA液溶解，用A液定容至100mL，得到B液；
(3)配置C液：将甘油8mL，加B液80mL混匀，用B液定容至100mL，得到所述精液冷冻稀释液。
实施例2
一种精液冷冻稀释液，由以下制备方法得到：
(1)配置A液：将葡萄糖2.5g，乳糖3.0g，柠檬酸钠1.0g，加50mL无菌双蒸水溶解，定容至100mL，得到A液；
(2)配置B液：将新鲜鸡卵黄15mL，10万IU青霉素，10万IU链霉素，N,N-二甲基甲酰胺0.01mL，加50mLA液溶解，用A液定容至100mL，得到B液；
(3)配置C液：将甘油6mL，加B液80mL混匀，用B液定容至100mL，得到所述精液冷冻稀释液。
实施例3
一种精液冷冻稀释液，由以下制备方法得到：
(1)配置A液：将葡萄糖4g，乳糖3.5g，柠檬酸钠1.5g，加50mL无菌双蒸水溶解，定容至100mL，得到A液；
(2)配置B液：将新鲜鸡卵黄15mL，10万IU青霉素，10万IU链霉素，N,N-二甲基甲酰胺0.05mL，加50mLA液溶解，用A液定容至100mL，得到B液；
(3)配置C液：将甘油6mL，加B液80mL混匀，用B液定容至100mL，得到所述精液冷冻稀释液。
实施例4
一种精液冷冻稀释液，由以下制备方法得到：
(1)配置A液：将葡萄糖4g，乳糖3.5g，柠檬酸钠1.5g，加50mL无菌双蒸水溶解，定容至100mL，得到A液；
(2)配置B液：将新鲜鸡卵黄15mL，10万IU青霉素，10万IU链霉素，N,N-二甲基甲酰胺0.1mL，加50mLA液溶解，用A液定容至100mL，得到B液；
(3)配置C液：将甘油3mL，加B液80mL混匀，用B液定容至100mL，得到所述精液冷冻稀释液。
实施例5
一种精液冷冻稀释液，由以下制备方法得到：
(1)配置A液：将葡萄糖3.0g，乳糖4.6g，柠檬酸钠1.5g，加50mL无菌双蒸水溶解，定容至100mL，得到A液；
(2)配置B液：将新鲜鸡卵黄15mL，10万IU青霉素，10万IU链霉素，N,N-二甲基甲酰胺0.05mL，加50mLA液溶解，用A液定容至100mL，得到B液；
(3)配置C液：将甘油6mL，加B液80mL混匀，用B液定容至100mL，得到所述精液冷冻稀释液。
应用例1
一种冷冻保存关中奶山羊精液的方法，由以下步骤组成：
将新采集的关中奶山羊精液在37℃下检测精液的精子密度、精子活力，将密度≥2×109个/mL，且活力≥0.7的精液定为合格精液进行后续冷冻保存处理；
取合格精液2mL，加入实施例1制备的精液冷冻稀释液20mL，充分混匀，再将其用10层纱布包裹在5℃平衡2h，使精子密度为2.0×108个/mL左右，得到稀释精液；
将稀释精液在5℃下用细管自动分装打印机分装在0.25mL的细管中，先置于熏蒸架上，再将其置入距离液氮面上方3～5cm，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中装袋长期保存。
应用例2
一种冷冻保存关中奶山羊精液的方法，由以下步骤组成：
将新采集的关中奶山羊精液在37℃下检测精液的精子密度、精子活力，将密度≥2×109个/mL，且活力≥0.7的精液定为合格精液进行后续冷冻保存处理；
取合格精液2mL，加入实施例2制备的精液冷冻稀释液20mL，充分混匀，再将其用10层纱布包裹在5℃平衡2h，使精子密度为2.0×108个/mL左右，得到稀释精液；
将稀释精液在5℃下用细管自动分装打印机分装在0.25mL的细管中，放置于已达到启动温度5℃的冷冻槽中，以5℃/min速率从5℃缓慢降至-10℃，40℃/min速率从-10℃快速降至-100℃，30℃/min速率从-100℃降至-140℃，冷冻完成后将细管装袋投入到液氮中长期保存。
应用例3
一种冷冻保存关中奶山羊精液的方法，由以下步骤组成：
将新采集的关中奶山羊精液在37℃下检测精液的精子密度、精子活力，将密度≥2×109个/mL，且活力≥0.7的精液定为合格精液进行后续冷冻保存处理；
取合格精液2mL，加入实施例3制备的精液冷冻稀释液20mL，充分混匀，再将其用10层纱布包裹在5℃平衡2h，使精子密度为2.0×108个/mL左右，得到稀释精液；
将稀释精液在5℃下用细管自动分装打印机分装在0.25mL的细管中，放置于已达到启动温度5℃的冷冻槽中，以5℃/min速率从5℃缓慢降至-10℃，40℃/min速率从-10℃快速降至-100℃，30℃/min速率从-100℃降至-140℃，冷冻完成后将细管装袋投入到液氮中长期保存。
应用例4
一种冷冻保存关中奶山羊精液的方法，由以下步骤组成：
将新采集的关中奶山羊精液在37℃下检测精液的精子密度、精子活力，将密度≥2×109个/mL，且活力≥0.7的精液定为合格精液进行后续冷冻保存处理；
取合格精液2mL，加入实施例4制备的精液冷冻稀释液20mL，充分混匀，再将其用10层纱布包裹在5℃平衡2h，使精子密度为2.0×108个/mL左右，得到稀释精液；
将稀释精液在5℃下用细管自动分装打印机分装在0.25mL的细管中，放置于已达到启动温度5℃的冷冻槽中，以10℃/min速率从5℃缓慢降至-10℃，40℃/min速率从-10℃快速降至-100℃，25℃/min速率从-100℃降至-140℃，冷冻完成后将细管装袋投入到液氮中长期保存。
应用例5
一种冷冻保存关中奶山羊精液的方法，由以下步骤组成：
将新采集的关中奶山羊精液在37℃下检测精液的精子密度、精子活力，将密度≥2×109个/mL，且活力≥0.7的精液定为合格精液进行后续冷冻保存处理；
取合格精液2mL，加入实施例5制备的精液冷冻稀释液20mL，充分混匀，再将其用10层纱布包裹在5℃平衡2h，使精子密度为2.0×108个/mL左右，得到稀释精液；
将稀释精液在5℃下用细管自动分装打印机分装在0.25mL的细管中，放置于已达到启动温度5℃的冷冻槽中，以5℃/min速率从5℃缓慢降至-10℃，40℃/min速率从-10℃快速降至-100℃，25℃/min速率从-100℃降至-140℃，冷冻完成后将细管装袋投入到液氮中长期保存。
对比例1
一种和应用例1相似的方法，唯一区别在于，将实施例1制备的精液冷冻稀释液替换为对比稀释液1；所述对比稀释液1和实施例1制备的精液冷冻稀释液唯一区别在于，对比稀释液1不含有N,N-二甲基甲酰胺。
对比例2
一种和对比例1相似的方法，唯一区别在于，将对比稀释液1替换为对比稀释液2；所述对比稀释液2和实施例2制备的精液冷冻稀释液唯一区别在于，对比稀释液2不含有N,N-二甲基甲酰胺。
对比例3
一种和对比例1相似的方法，唯一区别在于，将对比稀释液1替换为对比稀释液3；所述对比稀释液3和实施例3制备的精液冷冻稀释液唯一区别在于，对比稀释液3不含有N,N-二甲基甲酰胺。
对比例4
一种和对比例1相似的方法，唯一区别在于，将对比稀释液1替换为对比稀释液4；所述对比稀释液4和实施例4制备的精液冷冻稀释液唯一区别在于，对比稀释液4不含有N,N-二甲基甲酰胺。
对比例5
一种和对比例1相似的方法，唯一区别在于，将对比稀释液1替换为对比稀释液5；所述对比稀释液5和实施例5制备的精液冷冻稀释液唯一区别在于，对比稀释液5不含有N,N-二甲基甲酰胺。
对比例6
一种和应用例2相似的方法，区别在于，取合格精液2mL，加入实施例2制备的B液10mL，充分混匀，再将其用10层纱布包裹在5℃平衡1h，在5℃条件下，缓慢加入实施例2制备的C液10ml，混匀，使精子密度为2.0×108个/mL左右，再5℃平衡2h，得到稀释精液。
对比例7
一种和应用例2相似的方法，区别在于，将稀释精液在5℃下用细管自动分装打印机分装在0.25mL的细管中，放置于已达到启动温度5℃的冷冻槽中，以1℃/min速率从5℃缓慢降至-10℃，40℃/min速率从-10℃快速降至-100℃，30℃/min速率从-100℃降至-140℃，冷冻完成后将细管装袋投入到液氮中长期保存。
对比例8
一种和应用例2相似的方法，区别在于，将稀释精液在5℃下用细管自动分装打印机分装在0.25mL的细管中，放置于已达到启动温度5℃的冷冻槽中，以40℃/min速率从5℃缓慢降至-10℃，40℃/min速率从-10℃快速降至-100℃，30℃/min速率从-100℃降至-140℃，冷冻完成后将细管装袋投入到液氮中长期保存。
应用例1～5以及对比例1～8的效果对比：
随机抽取10支细管冻精，38℃水浴20s解冻。用卡苏精子分析系统和姬姆萨染色法进行观测分析，观测精子的活率、活力、顶体完整率，并与对比例进行比较。
精子活率和活力检测方法：取解冻后精液置于载玻片上加盖玻片，立即在载物台温度保持38℃的情况下用显微镜观察，用卡苏精子分析系统捕捉精子活动轨迹，统计出视野内总精子数、活精子数以及呈直线运动的精子数。每个样片观察3个视野，取3个数平均值。活率＝活精子数/总精子数*100％，活力＝呈直线运动精子数/总精子数*100％。
顶体完整率检测方法：取一滴解冻后的精液，滴在载玻片一端，均匀抹片，风干后用中性福尔马林固定液固定，用姬姆萨染色法染色，晾干后在显微镜下镜检。每个抹片观察200个以上的精子(分左右两个区)，统计出观察到总精子数和顶体异常(如顶体脱落、半脱落、揭翻、破损、脱开露胞腔等)的精子。顶体完整率＝1-顶体异常精子数/观察总精子数*100％。
实验结果见表1～表4。
表1不同方法保存的精液中精子活率、活力和顶体完整率的结果
应用例1 对比例1 1提高 应用例2 对比例2 2提高
精子活率 50.64±3.56％ 42.83±2.81％ 18.24±1.01％ 56.58±3.46％ 43.17±2.45％ 31.07±1.75％
精子活力 34.26±1.19％ 31.07±0.79％ 10.25±0.57％ 34.84±1.22％ 31.25±0.86％ 11.50±0.75％
顶体完整率 60.18±4.33％ 49.90±3.57％ 20.61±2.15％ 63.84±2.09％ 48.26±1.37％ 32.29±1.08％
表2不同方法保存的精液中精子活率、活力和顶体完整率的结果
应用例3 对比例3 3提高 应用例4 对比例4 4提高
精子活率 67.62±3.28％ 49.58±1.84％ 36.38±2.64％ 52.12±3.28％ 41.09±2.05％ 26.85±1.22％
精子活力 35.01±1.81％ 31.16±1.31％ 12.37±0.81％ 33.35±1.27％ 30.88±1.02％ 8.01±0.73％
顶体完整率 80.70±3.41％ 61.79±2.38％ 30.61±1.05％ 57.21±2.54％ 45.90±2.39％ 24.65±1.66％
表3不同方法保存的精液中精子活率、活力和顶体完整率的结果
应用例5 对比例5 5提高 应用例2 对比例6 6提高
精子活率 75.21±3.14％ 52.88±2.19％ 42.22±2.40％ 56.58±3.46％ 57.35±2.67％ 1.36±0.34％
精子活力 36.50±1.86％ 30.29±0.81％ 20.51±1.07％ 34.84±1.22％ 35.61±1.54％ 2.21±0.51％
顶体完整率 85.56±2.09％ 65.58±2.59％ 30.46±1.93％ 63.84±2.09％ 64.29±1.98％ 0.7±0.21％
表4不同方法保存的精液中精子活率、活力和顶体完整率的结果
应用例2 对比例7 7提高 应用例2 对比例8 8提高
精子活率 50.64±3.56％ 20.34±1.09％ -59.83±2.38％ 56.58±3.46％ 15.62±1.33％ -72.39±2.89％
精子活力 34.26±1.19％ 9.38±0.56％ -72.62±3.64％ 34.84±1.22％ 11.94±1.08％ -65.73±1.95％
顶体完整率 60.18±4.33％ 29.63±1.34％ -50.76±2.46％ 63.84±2.09％ 35.16±1.37％ -44.92±2.09％
注：上表中的1提高为应用例1相对于对比例1在不同检测项目结果的提高，2提高为应用例2相对于对比例2在不同检测项目结果的提高，3提高为应用例3相对于对比例3在不同检测项目结果的提高，4提高为应用例4相对于对比例4在不同检测项目结果的提高，5提高为应用例5相对于对比例5在不同检测项目结果的提高，6提高为应用例2相对于对比例6在不同检测项目结果的提高，7提高为应用例2相对于对比例7在不同检测项目结果的提高，8提高为应用例2相对于对比例8在不同检测项目结果的提高。
应用例1及对比例1效果：
精子的活率、活力、顶体完整率的观测结果如下：应用例组的精子的活率、活力、顶体完整率分别是50.64±3.56％，34.26±1.19％和60.18±4.33％，统计分析结果表明，应用例组与对比例组相比，精子的活率、活力、顶体完整率差异显著(p<0.05)，其中应用例组的精子活率比对比例组提高了18.24±1.01％，精子活力提高了10.25±0.57％，顶体完整率提高了20.61±2.15％。由此表明，本发明提供的稀释液对于关中奶山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
应用例2及对比例2效果：
精子的活率、活力、顶体完整率的观测结果如下：应用例组的精子的活率、活力、顶体完整率分别是56.58±3.46％，34.84±1.22％，63.84±2.09％，统计分析结果表明，应用例组与对比例组相比，精子的活率、活力、顶体完整率差异显著(p<0.05)，其中应用例组的精子活率比对比例组提高了31.07±1.75％，精子活力提高了11.50±0.75％，顶体完整率提高了32.29±1.08％。由此表明，本发明提供的稀释液对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
应用例3及对比例3效果：
精子的活率、活力、顶体完整率的观测结果如下：应用例组的精子的活率、活力、顶体完整率分别是67.62±3.28％，35.01±1.81％和80.70±3.41％，统计分析结果表明，应用例组与对比例组相比，精子的活率、活力、顶体完整率差异显著(p<0.05)，其中应用例组的精子活率比对比例组提高了36.38±2.64％，精子活力提高了12.37±0.81％，顶体完整率提高了30.61±1.05％。由此表明，本发明提供的稀释液及降温程序对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
应用例4及对比例4效果：
精子的活率、活力、顶体完整率的观测结果如下：应用例组的精子的活率、顶体完整率分别是52.12±3.28％，33.35±1.27％和57.21±2.54％，统计分析结果表明，应用例组与对比例组相比，精子的活率、活力、顶体完整率差异显著(p<0.05)，其中应用例组的精子活率比对比例组提高了26.85±1.22％，精子活力提高了8.01±0.73％顶体完整率提高了24.65±1.66％。由此表明，本发明提供的稀释液及降温程序对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
应用例5及对比例5效果：
精子的活率、活力、顶体完整率的观测结果如下：应用例组的精子的活率、顶体完整率分别是75.21±3.14％，36.50±1.86％和85.56±2.09％，统计分析结果表明，应用例组与对比例组相比，精子的活率、活力、顶体完整率差异显著(p<0.05)，其中应用例组的精子活率比对比例组提高了42.22±2.40％，精子活力提高了20.51±1.07％顶体完整率提高了30.46±1.93％。由此表明，本发明提供的稀释液及降温程序对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
应用例2及对比例6效果：
精子的活率、活力、顶体完整率的观测结果如下：应用例组的精子的活率、活力、顶体完整率分别是56.58±3.46％，34.84±1.22％，63.84±2.09％，统计分析结果表明，应用例组与对比例组相比，精子的活率、活力、顶体完整率差异不显著(p>0.05)，其中应用例组的精子活率比对比例组提高了1.36±0.34％，精子活力提高了2.21±0.51％，顶体完整率提高了0.7±0.21％。由此表明，应用本发明提供的稀释液分步稀释和一步稀释对于山羊精子的冷冻保存，都具有良好的效果。
应用例2及对比例7效果：
精子的活率、活力、顶体完整率的观测结果如下：应用例组的精子的活率、活力、顶体完整率分别是56.58±3.46％，34.84±1.22％，63.84±2.09％，统计分析结果表明，应用例组与对比例组相比，精子的活率、活力、顶体完整率差异极显著(p<0.01)，其中对比例组的精子活率比应用例组降低了59.83±2.38％，精子活力降低了72.62±3.64％，顶体完整率降低了50.76±2.46％。由此表明，降温冷冻初期极缓慢降温速率对精子的活率、活率及体完整率都有明显的损害作用，冷冻初期的降温速率不能太慢。
应用例2及对比例8效果：
精子的活率、活力、顶体完整率的观测结果如下：应用例组的精子的活率、活力、顶体完整率分别是56.58±3.46％，34.84±1.22％，63.84±2.09％，统计分析结果表明，应用例组与对比例组相比，精子的活率、活力、顶体完整率差异极显著(p<0.01)，其中对比例组的精子活率比应用例组降低了72.39±2.89％，精子活力降低了65.73±1.95％，顶体完整率降低了44.92±2.09％。由此表明，降温初期快速的降温对精子的活率、活率及体完整率都有显著的损害作用，冷冻初期的降温速率不能太快。
综上所述，本发明提供的精液冷冻稀释液和保存方法对于奶山羊精液的冷冻保存，具有良好的效果(应用例5的效果最优)，能有效提高解冻后精液的精子活率、精子活力、顶体完整率，降低精子畸形率，提高奶山羊冻精生产效率及冻精品质。同时制作该稀释液工艺操作简单、生产成本低，便于大规模推广应用。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种精液冷冻稀释液，其特征在于，所述精液冷冻稀释液的制备方法包括以下步骤：
将A液、卵黄、青霉素、链霉素和N,N-二甲基甲酰胺混合，得到B液；
将所述B液和甘油混合，得到所述精液冷冻稀释液；
所述A液包括以下浓度的组分：葡萄糖25～40g/L、乳糖30～46g/L和柠檬酸钠10～15g/L；
所述B液中卵黄的浓度为100～150mL/L；
所述B液中青霉素的浓度为50～150万IU/L；
所述B液中链霉素的浓度为50～150万IU/L；
所述B液中N,N-二甲基甲酰胺的浓度为0.1～1mL/L；
所述精液冷冻稀释液中甘油的浓度为30～80mL/L。
2.根据权利要求1所述的精液冷冻稀释液，其特征在于，所述精液冷冻稀释液的pH值为6.5～7。
3.根据权利要求1或2所述的精液冷冻稀释液，其特征在于，所述A液的溶剂包括无菌双蒸水。
4.权利要求1～3任一项所述精液冷冻稀释液在冷冻保存动物精液中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述动物包括羊。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述羊包括奶山羊。
7.一种冷冻保存动物精液的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待保存的精液和权利要求1～3任一项所述精液冷冻稀释液混合后平衡2h，得到稀释精液；
将所述稀释精液进行降温冷冻处理。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述降温冷冻包括：以5～10℃/min降温速率将所述稀释精液降至-10℃；然后以40℃/min降温速率将-10℃的稀释精液降至-100℃；最后以25～30℃/min降温速率将-100℃的稀释精液降至-140℃。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述平衡的温度为5℃。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述待保存的精液和所述精液冷冻稀释液的体积比为1：10～11。
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