CN108094409A - 绵羊精液冷冻稀释液的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种绵羊精液冷冻稀释液的制备方法及其应用，本发明的绵羊精液冷冻稀释液的制备方法，包括以下步骤：首先准确称取三羟甲基氨基甲烷、二水柠檬酸三钠、果糖、肌醇类化合物、乙二醇或甘油、催产素加入到适量超纯水中溶解，然后加入新鲜卵黄离心上清液、青霉素、链霉素，混匀，调整pH值至6.8‑7.2后定容，制得羊精液冷冻稀释液。本发明采用肌醇类化合物代替抗冻蛋白避免了抗冻蛋白应用的缺陷，同时输精时添加催产素可提高精子的活力、顶体完整率，从而提高受精率。

Description

绵羊精液冷冻稀释液的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于动物繁殖技术领域，具体涉及绵羊精液冷冻稀释液的制备方法及其应用。
背景技术
家畜冷冻精液的保存技术研究已有近百年，但是羊冷冻精液解冻后的活率和受精率较低，人工授精后的不返情率显著低于新鲜精液。主要原因是精液在冷冻过程中，细胞内外形成的冰晶对羊精子造成的损伤直接影响冷冻后精子的活率，如何降低冰晶的产生、提高精液活率是低温保存精液研究领域的热点。一些研究表明，抗冻蛋白能提高哺乳动物冷冻精液活率，然而抗冻蛋白的提取技术和专利主要集中在西方国家中，价格昂贵且纯度也存在问题，从而导致抗冻蛋白的应用存在一定的局限性。
发明内容
为解决上述问题，本发明采用肌醇类化合物代替抗冻蛋白避免了抗冻蛋白应用的缺陷，同时输精时添加催产素可提高精子的活力、顶体完整率，从而提高受精率。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种绵羊精液冷冻稀释液的制备方法，包括以下步骤：首先准确称取三羟甲基氨基甲烷、二水柠檬酸三钠、果糖、肌醇类化合物、乙二醇或甘油、催产素加入到适量超纯水中溶解，然后加入新鲜卵黄离心上清液、青霉素、链霉素，混匀，调整pH值至6.8-7.2后定容，制得羊精液冷冻稀释液。
进一步地，所述三羟甲基氨基甲烷：二水柠檬酸三钠：果糖：肌醇类化合物的质量比为2.5-3.0：1.0-2.5：1.0-2.0：4.0-6.5；所述三羟甲基氨基甲烷与乙二醇或甘油的质量体积比为0.5-0.6g：1-4L；所述催产素、青霉素、链霉素的质量比为1：4000：4000。
进一步地，新鲜卵黄离心上清液的制备方法：无菌吸取新鲜卵黄液，用灭菌生理盐水1：1稀释后，4℃5000g离心10分钟，吸取上清液5-10ml，于20-30℃静置10分钟，获得新鲜卵黄离心上清液。
进一步地，在适量的超纯水中加入三羟甲基氨基甲烷2.5-3.0g、二水柠檬酸三钠1.0-2.5g、果糖1.0-2.0g、肌醇类化合物4.0-6.5g、乙二醇或甘油5-20ml、新鲜卵黄离心上清液5-15ml、青霉素10万IU、链霉素10万IU，混匀，调整pH值至6.8-7.2后在容量瓶定容至100ml，制得羊精液冷冻稀释液。
更进一步地，所述肌醇类化合物为1，3-环己二醇、1，4-环己二醇和1，3，5-环己三醇中的任意一种。
本发明所述的绵羊精液冷冻稀释液的保存方法，包括如下步骤：将羊精液和权利要求4所述的羊精液冷冻稀释液按照1:4-5的比例混合均匀，然后分装于0.25ml塑料细管内，先缓慢降温至5℃，然后迅速放到液氮气相中预冷5分钟，最后将细管投入到液氮中保存。
本发明所述的绵羊精液冷冻稀释液在羊精液冷冻保存中的应用。
有益效果：本发明采用肌醇类化合物代替抗冻蛋白避免了抗冻蛋白应用的缺陷，同时输精时添加催产素可提高精子的活力、顶体完整率，从而提高受精率。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明采用肌醇类化合物，避免了抗冻蛋白可能导致羊产生一定的免疫反应。催产素除了促进母畜排卵，还促进母畜生殖道蠕动，有利于精子运行，使精子提前到达受精部位，从而提高受胎率的作用。
(2)本发明冻精解冻后的活率在0.80左右，顶体完整率在75％左右，人工输精后不返情率达到75％以上。该羊精液保存稀释液成本低廉，制作方法简单，容易配制，稀释保存效果好。
具体实施方式
以下实施例仅处于说明性目的，而不是想要限制本发明的范围。
实施例1
唐山市古冶区晨昇牧业有限公司采用假阴道法采集澳洲白绵羊精液，经精液品质鉴定，其活率大于0.80，精子密度为3.5-4.0×108/ml，精液量为1.5-2.0ml。
本发明的绵羊精液冷冻稀释液的保存方法，包括如下步骤：
(1)无菌吸取新鲜卵黄液，用灭菌生理盐水1：1稀释后，4℃ 5000g离心10分钟，吸取上清液15ml，于20-30℃静置10分钟，获得溶液A。
(2)称取三羟甲基氨基甲烷2.75g、二水柠檬酸三钠1.5g、果糖1.5g、肌醇类化合物5.0g、甘油15ml、催产素25IU加入到适量超纯水中溶解，然后加入新鲜卵黄离心上清液(溶液A)10ml、青霉素 10万IU、链霉素10万IU，混匀，调整PH值至6.8-7.2后定容至100ml，获得溶液B。
(3)将溶液B缓慢倒入绵羊精液中(按羊精液与溶液B比例为1:4)，混匀后分装至0.25ml塑料细管内，先缓慢降温至5℃，然后迅速放到液氮气相中预冷5分钟，最后将细管投入到液氮中保存。
该方法冷冻保存的羊精液解冻后，精子的活率在0.80左右，顶体完整率在75％左右，人工输精后不返情率达到75％以上。
实施例2
唐山市古冶区晨昇牧业有限公司采用假阴道法采集杜泊绵羊精液，经精液品质鉴定，其活率大于0.80，精子密度为3.5-4.0×109/ml，精液量为1.5-2.0ml。
本发明的绵羊精液冷冻稀释液的保存方法，包括如下步骤：
(1)无菌吸取新鲜卵黄液，用灭菌生理盐水1：1稀释后，4℃ 5000g离心10分钟，吸取上清液15ml，于20-30℃静置10分钟，获得溶液A。
(2)称取三羟甲基氨基甲烷2.75g、二水柠檬酸三钠1.5g、果糖1.5g、肌醇类化合物5.0g、甘油15ml、催产素25IU加入到适量超纯水中溶解，然后加入新鲜卵黄离心上清液(溶液A)10ml、青霉素 10万IU、链霉素10万IU，混匀，调整PH值至6.8-7.2后定容至100ml，获得溶液B。
(3)将溶液B缓慢倒入绵羊精液中(按羊精液与溶液B比例为 1:5)，混匀后分装至0.25ml塑料细管内，先缓慢降温至5℃，然后迅速放到液氮气相中预冷5分钟，最后将细管投入到液氮中保存。
该方法冷冻保存的羊精液解冻后，精子的活率在0.80左右，顶体完整率在75％左右，人工输精后不返情率达到75％以上。
上述实施例证明该精液冷冻稀释液使用效果良好。
实施例3
本发明的一种绵羊精液冷冻稀释液的制备方法，包括以下步骤：首先准确称取三羟甲基氨基甲烷、二水柠檬酸三钠、果糖、肌醇类化合物、乙二醇或甘油、催产素加入到适量超纯水中溶解，然后加入新鲜卵黄离心上清液、青霉素、链霉素，混匀，调整pH值至7.1后定容，制得羊精液冷冻稀释液。
所述三羟甲基氨基甲烷：二水柠檬酸三钠：果糖：肌醇类化合物的质量比为2.8：2.5：2.0：4.0；所述三羟甲基氨基甲烷与乙二醇或甘油的质量体积比为0.5g：4L。
新鲜卵黄离心上清液的制备方法：无菌吸取新鲜卵黄液，用灭菌生理盐水1：1稀释后，4℃5000g离心10分钟，吸取上清液5ml，于 25℃静置10分钟，获得新鲜卵黄离心上清液。
所述肌醇类化合物为1，4-环己二醇。
本发明所述的绵羊精液冷冻稀释液的保存方法，包括如下步骤：将羊精液和权利要求4所述的羊精液冷冻稀释液按照1:5的比例混合均匀，然后分装于0.25ml塑料细管内，先缓慢降温至5℃，然后迅速放到液氮气相中预冷5分钟，最后将细管投入到液氮中保存。
本发明所述的绵羊精液冷冻稀释液在羊精液冷冻保存中的应用。
实施例4
实施例4与实施例3的区别在于：本发明的一种绵羊精液冷冻稀释液的制备方法，包括以下步骤：首先准确称取三羟甲基氨基甲烷、二水柠檬酸三钠、果糖、肌醇类化合物、乙二醇或甘油、催产素加入到适量超纯水中溶解，然后加入新鲜卵黄离心上清液、青霉素、链霉素，混匀，调整pH值至6.8后定容，制得羊精液冷冻稀释液。
所述三羟甲基氨基甲烷：二水柠檬酸三钠：果糖：肌醇类化合物的质量比为2.5：1.0：1.5：4.5；所述三羟甲基氨基甲烷与乙二醇或甘油的质量体积比为0.6g：1L；所述催产素、青霉素、链霉素的质量比为1：4000：4000。
新鲜卵黄离心上清液的制备方法：无菌吸取新鲜卵黄液，用灭菌生理盐水1：1稀释后，4℃5000g离心10分钟，吸取上清液8ml，于 30℃静置10分钟，获得新鲜卵黄离心上清液。
所述肌醇类化合物为1，3-环己二醇。
本发明所述的绵羊精液冷冻稀释液的保存方法，包括如下步骤：将羊精液和所述的羊精液冷冻稀释液按照1:4的比例混合均匀，然后分装于0.25ml塑料细管内，先缓慢降温至5℃，然后迅速放到液氮气相中预冷5分钟，最后将细管投入到液氮中保存。
实施例5
实施例5与实施例3的区别在于：本发明的一种绵羊精液冷冻稀释液的制备方法，包括以下步骤：首先准确称取三羟甲基氨基甲烷、二水柠檬酸三钠、果糖、肌醇类化合物、乙二醇或甘油、催产素加入到适量超纯水中溶解，然后加入新鲜卵黄离心上清液、青霉素、链霉素，混匀，调整pH值至7.2后定容，制得羊精液冷冻稀释液。
所述三羟甲基氨基甲烷：二水柠檬酸三钠：果糖：肌醇类化合物的质量比为3.0：1.5：1.0：6.5；所述三羟甲基氨基甲烷与乙二醇或甘油的质量体积比为0.56g：2L；所述催产素、青霉素、链霉素的质量比为1：4000：4000。
新鲜卵黄离心上清液的制备方法：无菌吸取新鲜卵黄液，用灭菌生理盐水1：1稀释后，4℃5000g离心10分钟，吸取上清液10ml，于20℃静置10分钟，获得新鲜卵黄离心上清液。
所述肌醇类化合物为1，3，5-环己三醇。
本发明所述的绵羊精液冷冻稀释液的保存方法，包括如下步骤：将羊精液和权利要求4所述的羊精液冷冻稀释液按照1:4.5的比例混合均匀，然后分装于0.25ml塑料细管内，先缓慢降温至5℃，然后迅速放到液氮气相中预冷5分钟，最后将细管投入到液氮中保存。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种绵羊精液冷冻稀释液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：首先准确称取三羟甲基氨基甲烷、二水柠檬酸三钠、果糖、肌醇类化合物、乙二醇或甘油、催产素加入到适量超纯水中溶解，然后加入新鲜卵黄离心上清液、青霉素、链霉素，混匀，调整pH值至6.8-7.2后定容，制得羊精液冷冻稀释液。
2.根据权利要求1所述的绵羊精液冷冻稀释液的制备方法，其特征在于：所述三羟甲基氨基甲烷：二水柠檬酸三钠：果糖：肌醇类化合物的质量比为2.5-3.0：1.0-2.5：1.0-2.0：4.0-6.5；所述三羟甲基氨基甲烷与乙二醇或甘油的质量体积比为0.5-0.6g：1-4L；所述催产素、青霉素、链霉素的质量比为1：4000：4000。
3.根据权利要求1所述的绵羊精液冷冻稀释液的制备方法，其特征在于：新鲜卵黄离心上清液的制备方法：无菌吸取新鲜卵黄液，用灭菌生理盐水1：1稀释后，4℃5000g离心10分钟，吸取上清液5-10ml，于20-30℃静置10分钟，获得新鲜卵黄离心上清液。
4.根据权利要求3所述的绵羊精液冷冻稀释液的制备方法，其特征在于：在适量的超纯水中加入三羟甲基氨基甲烷2.5-3.0g、二水柠檬酸三钠1.0-2.5g、果糖1.0-2.0g、肌醇类化合物4.0-6.5g、乙二醇或甘油5-20ml、新鲜卵黄离心上清液5-15ml、青霉素10万IU、链霉素10万IU，混匀，调整pH值至6.8-7.2后在容量瓶定容至100ml，制得羊精液冷冻稀释液。
5.根据权利要求1所述的绵羊精液冷冻稀释液的制备方法，其特征在于：所述肌醇类化合物为1，3-环己二醇、1，4-环己二醇和1，3，5-环己三醇中的任意一种。
6.权利要求1至5任一项所述的绵羊精液冷冻稀释液的保存方法，其特征在于包括如下步骤：将羊精液和权利要求4所述的羊精液冷冻稀释液按照1:4-5的比例混合均匀，然后分装于0.25ml塑料细管内，先缓慢降温至5℃，然后迅速放到液氮气相中预冷5分钟，最后将细管投入到液氮中保存。
7.权利要求1至5任一项所述的绵羊精液冷冻稀释液在羊精液冷冻保存中的应用。
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