CN112889808A

CN112889808A - 一种绵羊细管精液的冷冻保存方法

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Publication number: CN112889808A
Application number: CN202110081363.2A
Authority: CN
Inventors: 肖广庆; 许丹娜; 刘欣伟; 杨利峰; 李成山; 杨瑞瑞; 谢希玲
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-01-21
Filing date: 2021-01-21
Publication date: 2021-06-04

Abstract

本发明涉及一种绵羊细管精液的冷冻保存方法，包括以下步骤：步骤A，将采好的镜检活力在0.7以上的绵羊精液用羊冻精稀释液等温稀释，用细管灌装机灌装后，放入4℃环境中平衡待用；步骤B：将平衡好的绵羊精液细管放入液氮冷冻装置中，所述细管位于液氮面上方、距离液氮面3.5～5cm或8～9cm范围内；步骤C：当绵羊精液细管到达﹣10℃时，盖上液氮冷冻装置的箱盖；步骤D：当绵羊精液细管达﹣100℃后,快速降温至‑140℃，结束冷冻，将细管取出迅速放入液氮中保存。本发明能够获得绵羊精液较高的复苏效果，为小规模绵羊冻精生产提供技术支持，为大规模生产提供依据。

Description

一种绵羊细管精液的冷冻保存方法

技术领域

本发明涉及绵羊精液冷冻领域，具体涉及一种绵羊细管精液的冷冻保存方法。

背景技术

绵羊的冻精制作和牛的冻精制作工艺类似，要经过采精——稀释液稀释——4℃低温平衡——冷冻这一个过程，而后便可放在液氮环境中储存。稀释液的好坏，在精液稀释、平衡时就可以看出。而冷冻需掌握稀释后精液温度在下降过程中几个危险区域及在精液通过几个危险区域的冷冻速率，冷冻速率与精液所处环境温度有关，温差越大，降温速度越快, 精子冷冻危险温度为4℃～-60℃，有两个节点：一是4℃～-10℃的冷冻速率；二是-10℃～ -60℃冷冻速率。由于生产中要装袋保存，为避免回温应将细管精液冷冻至-120℃分装保存到液氮中。

在以往绵羊精液冷冻过程中，主要参考牛冷冻精液的冷冻过程及降温速率，使用冷冻仪对绵羊精液进行冷冻，但是绵羊精子冷冻效果不稳定，在解冻后镜检活力低，有效精子少，不能进行批量生产。

发明内容

本发明为解决绵羊细管精液冷冻效果不好、解冻后精子活力低的问题，提供一种绵羊细管精液的冷冻保存方法，能够获得绵羊精液较高的复苏效果，为小规模绵羊冻精生产提供技术支持，为大规模生产提供依据。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

一种绵羊细管精液的冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A：将采好的镜检活力在0.7以上的绵羊精液用羊冻精稀释液等温稀释，用细管灌装机灌装后，放入4℃环境中平衡待用；

步骤B：将平衡好的绵羊精液细管放入液氮冷冻装置中，所述细管位于液氮面上方、距离液氮面3.5～5cm或8～9cm范围内；

步骤C：当绵羊精液细管到达﹣10℃时，盖上液氮冷冻装置的箱盖；

步骤D：当绵羊精液细管达﹣100℃后，快速降温至-140℃，将细管取出迅速放入液氮中保存。

进一步地，所述步骤A中羊冻精稀释液是将三羟甲基-氨基甲烷、柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、果糖、EDTA、维生素B、维生素C、氯化钠与双蒸水混合均匀后，使用0.2μm滤膜过滤，各组分的浓度范围为：三羟甲基-氨基甲烷35～38g/L；柠檬酸18～19g/L；柠檬酸钠5～6g/L；葡萄糖35～45g/L；果糖5～8g/L；EDTA 1～2g/L；维生素C 4～6g/L；维生素B 2～5g/L；氯化钠3～4g/L；向过滤后的溶液中加入3000-5000单位青链霉素，配成羊冻精稀释液基础液，取基础液80毫升，加入甘油5毫升、卵黄15毫升，搅拌均匀即为羊冻精稀释液。

进一步地，所述步骤A中平衡时间为4h。

进一步地，所述步骤B中细管位置距离液氮面高度为4cm。

进一步地，在步骤C中，所述绵羊细管精液温度由4℃降温至-10℃所用时间在1.08～ 1.48min范围内；在步骤D中，所述绵羊细管精液温度由-10℃降温至-100℃所用时间在6.36～12.84min范围内。

进一步地，在步骤C中，所述绵羊细管精液温度由4℃降温至-10℃所用时间为1.28min；在步骤D中，所述绵羊细管精液温度由-10℃降温至-100℃所用时间为9.6min。

进一步地，所述步骤B中液氮冷冻装置包括液氮罐、温度计和冷冻箱，所述液氮罐用于为冷冻箱制造低温环境，所述温度计用于检测冷冻箱内的温度，所述冷冻箱内放置有若干个的托盘架和支撑架，所述托盘架为中空的框架结构，所述支撑架为矩形的架体结构，支撑架的两侧对应设置有固定齿，所述固定齿用于固定细管，托盘架内部与支撑架可拆卸连接。

进一步地，所述托盘架外侧壁的上端设置有上卷边，托盘架外侧壁的下端设置有弧形的卡片，所述卡片与上卷边相匹配。

进一步地，所述托盘架的下方设置有多个支脚，所述支脚朝托盘架中心的方向倾斜。

进一步地，所述托盘架的两端均设置有把手，所述把手的上端朝远离托盘架中心的方向倾斜。

进一步地，所述固定齿为直角三角形。

通过上述技术方案，本发明的有益效果为：

本发明的通过液氮熏蒸法生产冷冻精液，通过液氮面高度及通过危险区域的冷冻时间推算出较为理想的冷冻速度。将绵阳细管精液放置在距离液氮面3.5～4.5cm或8～9cm范围内，在该范围内的降温速率下，使精液安全度过在温度下降时的危险区域。在进一步的优选方案中，当距离液氮面4cm时，经解冻后镜检的精液活力较高，有效精液子多，为绵羊冷冻精液制作提供科学方法，为小规模绵羊冻精生产提供技术支持，为大规模生产提供依据。

本发明中所使用的冷冻装置的冷冻箱内可堆叠放置多个托盘架，托盘架上设置矩形的支撑架，通过支撑架两侧的固定齿固定放置细管，一个支撑架上可放置若干个细管，放置操作简便，节省时间；也能够适应于熏蒸法寻找合适降温速率的实验，细管放置过程简单，能够适应实验所需的不同高度数据的对比实验，提高了实验效率及可靠性。本发明的冷冻装置结构简单，造价低，细管放置过程简单，提高了作业效率。

附图说明

图1是本发明的液氮冷冻装置的实验过程示意图；

图2是本发明托盘架的结构示意图；

图3是本发明托盘架的剖视结构示意图；

图4是本发明的液氮冷冻装置的结构示意图之一；

图5是本发明的多个托盘架的堆叠结构示意图；

图6是本发明的液氮冷冻装置的的结构意图之二；

图7液氮面高5～10cm、14～40cm的绵羊细管精液冻精冷冻曲线；

图8绵羊细管精液冻精冷冻曲线。

附图中标号为：1为冷冻箱，2为托盘架，201为支脚，202为把手，203为上卷边， 204为卡片，4为支撑架，401为固定齿，5为细管。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明：

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”、“下”、“横向”“竖向”等指示的方位或位置关系为基于附图1所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

实施例一

本实施例提供一种用于绵羊细管精液的冷冻保存方法的液氮冷冻装置，如图1～图6 所示，液氮冷冻装置包括液氮罐、温度计和冷冻箱1，所述液氮罐用于为冷冻箱1制造低温环境，在使用时直接使用液氮罐倾倒使液氮倒入冷冻箱1内，降低冷冻箱1内部环境的温度，液氮越多，液氮面的温度越稳定；所述温度计用于检测冷冻箱1内的温度，具体的，温度计为超低温温度计，包括超低温探头和温度数据显示部分；所述冷冻箱1包括箱体和盖在箱体上的箱盖，冷冻箱1内放置有若干个的托盘架2和支撑架4，所述托盘架2为中空的框架结构，所述支撑架4为矩形的架体结构，本实施例中，所述支撑架4的两短边侧通过螺栓与托盘架2可拆卸连接，所述支撑架4的两长边侧对应设置有固定齿401，所述固定齿401用于固定细管，具体的，固定齿401的形状为直角三角形，通过支撑架4可放置多个细管，且可直接将细管的两端水平放置支撑架4上，以提高细管放置的便捷性，降低放置细管步骤的操作时间，提高了作业效率。

所述托盘架2外侧壁的上端设置有上卷边203，托盘架2外侧壁的下端设置有弧形的卡片204，所述卡片204与上卷边203相匹配，如图5所示，在多个托盘架2上下堆叠放置时，上方托盘架2的卡片203与下方托盘架2的上卷边相接触，托盘架2的四边均设置上卷边203和卡片204，所以四边均形成对托盘架2的约束，防止托盘架2上下堆叠放置时发生歪斜，使多个托盘架2上下堆叠的更加稳固。

进一步地，托盘架2的下方设置有多个支脚201，本实施例中，托盘架2为矩形，托盘架2的四角处设置支脚201，通过设置的支脚201支撑托盘架2，所述支脚201朝托盘架 2中心的方向倾斜，在多个托盘架2上下堆叠时，上方托盘架201的支脚201插入下方托盘架2的内部空间，不影响托盘架2的使用及堆叠，使多个托盘架2上下堆叠的更加稳固。

进一步地，为了便于托盘架2的取用，所述托盘架2的两端均设置有把手202，所述把手202的上端朝远离托盘架2中心的方向倾斜。

本实施例中为实现采用液氮熏蒸法寻找最佳降温速率实验，采用的冷冻箱1尺寸为 625×280×300cm，可并排放置两列托盘架2，托盘架2的高度为4cm，支脚201的竖直高度为0.5cm，液氮罐的容量为50升液氮，温度计采用检测范围为-200～200℃的超低温温度计，超低温温度计包括超低温探头和温度数据显示部分。

使用本液氮冷冻装置，采用液氮熏蒸法对绵羊细管精液冷冻保存的方法进行实验，实验操作步骤如下：

实验准备阶段：如图1所示，将两个托盘架2堆叠放置在冷冻箱1内部，两个托盘架2的高度为8.5cm，由下至上的第二层托盘架2上已固定有支撑架A，另单独取一个支撑架 B，使支撑架B一端位于支撑架A的固定齿401上，该接触位置做标记记为位置C，另一端依靠冷冻箱1的侧壁倾斜放置，该接触位置高度做标记记为高度D，同时，使支撑架B的固定齿401朝上、且固定齿401直角边朝上，使支撑架B处于稳定的倾斜状态，使用测量尺沿支撑架B进行测量，并从第三层托盘架2的高度为起始高度，从下至上、竖直间隔0.5cm 的高度距离进行位置标记，标记范围为10cm，即是本实验所需的不同的高度位置E1、E2、 E3、……、E20，而后取出支撑架B；向冷冻箱1内倒入液氮至液氮面高度达到第二层托盘架的位置，也即是液氮面高度为8.5cm。

实验阶段：

第一步：将采好镜检活力在0.7以上的绵羊精液用羊冻精稀释液等温稀释，用细管灌装机灌装后，放冰箱4℃平衡4h待用；

第二步：在4℃温度下，将羊细管精液分别放置在支撑架B的位置E1、E2、E3、……、E20处，超低温温度计的探头处于也处于4℃温度下；

第三步：将第二步所得支撑架B倾斜放入冷冻箱内，使各细管的竖直高度差为0.5cm，同时放入超低温温度计的超低温探头，使探头紧贴最上层细管冻精位置；

第四步：当超低温温度计显示到达﹣10℃时，盖上冷冻箱的箱盖；

第五步：当超低温温度计温度达﹣100℃后，用2min时间降温至-140℃，结束冷冻，将细管取出迅速放入液氮保存。

第六步：解冻，镜检细管内精液活力。

第一步中的羊冻精稀释液是将三羟甲基-氨基甲烷、柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、果糖、 EDTA、维生素B、维生素C、氯化钠与双蒸水混合均匀后，使用0.2μm滤膜过滤，各组分的浓度范围为：三羟甲基-氨基甲烷35～38g/L；柠檬酸18～19g/L；柠檬酸钠5～6g/L；葡萄糖35～45g/L；果糖5～8g/L；EDTA 1～2g/L；维生素C 4～6g/L；维生素B 2～ 5g/L；氯化钠3～4g/L；向过滤后的溶液中加入3000-5000单位青链霉素，配成羊冻精稀释液基础液，取基础液80毫升，加入甘油5毫升、卵黄15毫升，搅拌均匀即为羊冻精稀释液。

实验结果：实验数据如表1所示。

表1距液氮面高度对精液活力影响表Ⅰ

通过上表数据可以看出，在液氮面以上、距离液氮面的两个范围内出现较好的精液冻后活力，为距液氮面3.5～4.5cm和8～9cm的范围内。在这两个范围内做重复液氮熏蒸法制作绵羊冻精过程的实验，得到实验数据如表2所示。

表2液氮熏蒸法制作绵羊冻精距液氮面高度对精液活力影响表Ⅱ

由实验数据可得到，在液氮面以上、距离液氮面4cm的高度下冷冻之后的精液复苏效果最好。

在考虑大量生产时细管包装、码盘，温度降至-100℃后，两分钟快速降至-140℃，以免包装、码盘升温过高。同时考虑冷冻箱中液氮多少及细管精液多少对冷冻速度的影响。因此，冷冻时将细管放液氮面以上、距离液氮面4cm，分别做如下实验。

实验一：冷冻时细管精液的多少对降温速度影响。

冷冻箱内液氮高度为8.5cm，用原精活力分别为0.9、0.85、0.75的绵羊细管精液冷冻，记录熏蒸3～8支细管精液(所用时间为T1)与满盘150支细管精液冷冻时间(所用时间为T2)，对解冻后精液活力对比。具体实验结果如见表3、表4。

表3液氮熏蒸不同数量绵羊细管精液所用时间统计表

表4液氮熏蒸不同数量细管冻后活力统计表

原精活力	T1冻后	T2冻后
			0.90	0.45	0.44
0.85	0.38	0.37
			0.75	0.36	0.37

结论：在相同高度熏蒸绵羊细管数量的多少影响熏蒸速度，但冻后活力差异不显著。

实验二：液氮量的多少与冷冻时间及活力关系

向相同体积的冷冻箱内倒入不同的液氮量，使液氮量高度分别在5～10cm、10～14cm， 14～40cm，熏蒸细管数量细管采用满盘细管150支(3～8支细管不具备生产价值)进行冷冻实验，得到冷冻时间，见表5，而后并进行解冻后活力对比，见表6。

表5相同空间里面液氮量的多少与熏蒸时间

表6实验二冻后活力统计表

结论：液氮多少影响冷冻速率，但冻后活力差异不显著。

对液氮量5～10cm、14～40cm高的数据绘制冷冻曲线，如图7所示。在这两者范围内细管精液液氮熏蒸冷冻后的活力差异不显著，取二者平均值确定冷冻曲线：所取的平均降温时间如表7所示，并计算平均降温速度，取该平均值进行绘制绵羊细管精液冻精冷冻曲线如图8所示。

表7平均降温时间及速度表

温度	降温时间(min)	降温速度(℃/min)
			4℃到-10℃	(1.08-1.48)取1.28	10.938
-10℃到-100℃	(6.36-12.84)取9.6	9.375
			-100℃到-140℃	2	20

实验三

根据表7和图8所示绵羊细管精液冷冻曲线，将细管精液放入冷冻仪中，按照绵羊细管精液冷冻曲线验证绵羊冻精冷冻效果。

作为对照组，将绵羊细管精液按照牛精液冷冻速度进行冷冻，牛精液冷冻降温时间及速度见表8所示，此处所说的牛精液冷冻降温时间及速度由全国畜牧总站印发的《牛冷冻精液生产技术与管理培训教材》153-158页记载的《牛精液冷冻技术与质量控制》中所得。经冷冻仪冷冻，解冻后活力见表9所示。

表8牛精液冷冻速度及时间表

温度	降温时间(min)	降温速度(℃/min)
			4℃到-10℃	3	5
-10℃到-100℃	2.5	40
			-100℃到-140℃	2	20

表9输入冷冻仪后冻后活力表(与使用牛冷冻曲线比较)

使用绵羊冷冻曲线冻出的冷冻精液不仅活力好，顶体完整率高，运动状态也好；用牛的冷冻曲线冻出的羊细管精液活力有所下降，顶体完整率也明显降低，运动状态差异明显，说明在冷冻过程中对精子有冻伤现象，所以出现凝聚、打转、存活时间短等现象。

在-10～-100℃区间内，牛精液因抗冻力较强，适应快速降温，绵羊精液比较温和，适应缓慢降温。两者冷冻速度及时间大不相同。本实验通过简易的液氮熏蒸方法找出绵羊细管精液最佳冷冻时间及速度，为今后工业化生产绵羊细管冷冻精液提供可靠的冷冻数据，将冷冻数据输入冷冻仪后可工业化生产绵羊细管冻精。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims

1.一种绵羊细管精液的冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤D：当绵羊精液细管达﹣100℃后，快速降温至-140℃，结束冷冻，将细管取出迅速放入液氮中保存。

2.根据权利要求1所述的一种绵羊细管精液的冷冻保存方法，其特征在于，所述步骤A中羊冻精稀释液是将三羟甲基-氨基甲烷、柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、果糖、EDTA、维生素B、维生素C、氯化钠与双蒸水混合均匀后，使用0.2μm滤膜过滤，各组分的浓度范围为：三羟甲基-氨基甲烷35～38 g/L；柠檬酸18～19 g/L；柠檬酸钠5～6 g/L；葡萄糖35～45 g/L；果糖5～8 g/L；EDTA 1～2 g/L ；维生素C 4～6 g/L；维生素B 2～5 g/L；氯化钠3～4 g/L；向过滤后的溶液中加入3000-5000单位青链霉素，配成羊冻精稀释液基础液，取基础液80毫升，加入甘油5毫升、卵黄15毫升，搅拌均匀即为羊冻精稀释液。

3.根据权利要求1所述的一种绵羊细管精液的冷冻保存方法，其特征在于，所述步骤A中平衡时间为4h。

4.根据权利要求3所述的一种绵羊细管精液的冷冻保存方法，其特征在于，所述步骤B中细管位置距离液氮面高度为4cm。

5.根据权利要求1所述的一种绵羊细管精液的冷冻保存方法，其特征在于，在步骤C中，所述绵羊细管精液温度由4℃降温至-10℃所用时间在1.08～1.48min范围内；在步骤D中，所述绵羊细管精液温度由-10℃降温至-100℃所用时间在6.36～12.84 min范围内。

6.根据权利要求5所述的一种绵羊细管精液的冷冻保存方法，其特征在于，在步骤C中，所述绵羊细管精液温度由4℃降温至-10℃所用时间为1.28min；在步骤D中，所述绵羊细管精液温度由-10℃降温至-100℃所用时间为9.6min。

7.根据权利要求1所述的一种绵羊细管精液的冷冻保存方法，其特征在于，所述步骤B中液氮冷冻装置包括液氮罐、温度计和冷冻箱（1），所述液氮罐用于为冷冻箱（1）制造低温环境，所述温度计用于检测冷冻箱（1）内的温度，所述冷冻箱（1）内放置有若干个的托盘架（2）和支撑架（4），所述托盘架（2）为中空的框架结构，所述支撑架（4）为矩形的架体结构，支撑架（4）的两侧对应设置有固定齿（401），所述固定齿（401）用于固定细管，托盘架（2）内部与支撑架（4）可拆卸连接。

8.根据权利要求7所述的一种绵羊细管精液的冷冻保存方法，其特征在于，所述托盘架（2）外侧壁的上端设置有上卷边（203），托盘架（2）外侧壁的下端设置有弧形的卡片（204），所述卡片（204）与上卷边（203）相匹配。

9.根据权利要求7所述的一种绵羊细管精液的冷冻保存方法，其特征在于，所述托盘架（2）的下方设置有多个支脚（201），所述支脚（201）朝托盘架（2）中心的方向倾斜。

10.根据权利要求7所述的一种绵羊细管精液的冷冻保存方法，其特征在于，所述托盘架（2）的两端均设置有把手（202），所述把手（202）的上端朝远离托盘架（2）中心的方向倾斜。