WO2016041034A1 - Processo be congelação/criopreservação de sêmen epididimário e/ou congelação pós-mortem - Google Patents
Processo be congelação/criopreservação de sêmen epididimário e/ou congelação pós-mortem Download PDFInfo
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- A01N1/0278—Physical preservation processes
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Definitions
- the present patent is a process for freezing / cryopiferving epididymal semen and / or postmortem freezing from the head and tail of the epididymis of cattle, buffaloes, goats, horses, sheep and porcine, pertaining to the thermal areas of Biotechnology applied to Animal Reproduction and Cryobiology.
- epididymal semen freezing procedure exists for sole and exclusive research purposes because epididymis sperm is an excellent experimental model for studying the sperm cell in isolation, free of any interaction with the ejaculatory process and with seminal plasma components.
- epididymis sperm is an excellent experimental model for studying the sperm cell in isolation, free of any interaction with the ejaculatory process and with seminal plasma components.
- the postmortem freezing process object of this patent is to preserve genetic material of breeders after death and / or castration with great concern for the fecundating capacity, the concentration of specimen and the conditioning of the epididymal semen samples. Still, it was looking for quality samples that would allow them to be profitably and competitively marketed in the domestic and foreign markets, in order to be more efficient in the semen and genetics industry with high exploitation potential by "agrobusiness" ⁇
- the present invention aims to provide technical and operational facilities by configuring an excellent experimental model for research in the field of sperm physiology.
- the present invention provides an epMidiminal semen congiation / cryopreservation process and / or postmortem freezing, allowing the freezing of semen samples after the death of high zootechnical breeders to conserve genetic material from the head. and tail of bovine, baballnos, cies, goats, horses, ova and swine epididymis through eight main stages:
- testicles are removed by surgical procedure (in case of obit the testicles can be removed from 0 to 12 hours after death) according to the following steps:
- testicles 1.1 - the testicles must be packed in. a plastic bag containing the volume of 3 to 1 liter of Dullbeco's Modified PihosphaCe Buffered Soiutkm (DMFBS). Physiological Saline - 0.9% NaCl (Saline), Ringer Lactate, coconut Water or even Home Serum, for each testis pair;
- testicles may remain in this thermal refrigeration system for a period of 1 to 72 hours during transport to the laboratory;
- testicular tonics upon receipt, the testicular tonics are removed and rinsed with 70 ° GL alcohol;
- testicles are then dried with commercial disposable paper towels and are ready for the start of the procedure;
- the second way is to divide the epidermis and wash the lumen of the senile lobes with DMPBS, or saline or Ringer lactate, the wash drains to the surface of a petri dish and is recovered by aspiration;
- Soy fructose tris-lecithin (2 - 20%) with glycerol (4 - 15%) The choice of diluent depends on the inherent characteristics of each species (cattle, buffaloes, dogs, goats, horses, sheep, swine) and individual characteristics and dilution will aim at obtaining aliquots (doses of semen) with concentrations of between 8,4x10 * and 400x10 6 sperm per ml;
- the blades are obliterated / sealed with polyvinyl alcohol, or metal spheres, or non-toxic mass, or at high temperature;
- the doses are subjected to cooling curves between -0,1 and -1 ° C per minute until they reach 5 ° C (degrees Celsius);
- the stabilization / glycerolization time will be between 15 minutes (minimum) and 240 minutes (maximum) depending on species-specific and individual characteristics;
- cryopreservation strips once the doses of semen are frozen, they are stored in cryopreservation strips and stored in cryogenic canisters containing liquid nitrogen at a temperature of -196 * 0 (degrees Cekius) for an indefinite time.
- testicles from a slaughtered Bull where the testicles were removed by surgical procedure according to the following steps:
- testicles 1. - Conditioning of the testicles:
- testicles were placed in a plastic bag containing the 1 liter volume of Dullbeco's Mod ⁇ fied Phosphate.
- DMFBS Buffered Solution
- testicular tunics were removed and they were washed with alcohol 70 GL;
- testicles then dried with commercial disposable paper towels and were ready for the start of the procedure;
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Abstract
Trata-se a presente patente de invenção, de um proceso de congelação/criopreservação de sêmen epididimário e/ou congelação pósmortem, proveniente da cabeça e cauda dos epidídimos de bovinos, bubalinos, cães, caprinos, equinos, ovinos e suínos, pertencente às áreas de técnicas de Biotecnologias aplicadas à Reprodução Animal e Criobiologia. A sua importancia refere-se à possibilidade de congelação de amostras de sêmen após a morte de repredutores de alto valor zootécnico de maneira a se conservar material genético o qual faz parte de um dos maiores bancos de germoplasma do mundo que é o brasileiro. A presente invenção apresenta um processo de congelação/criopreservação de sêmen epididimário e/ou congelação pósmortem, permitindo a congelação de amostras de sêmen após a norte de reprodutores de alto valor zootécnico de maneira a se conservar material genético provenientes da cabeça e cauda dos epidídimos de bovinos, bubalinos, cães, caprinos, equinos, ovinos e suínos, através de oito etapas principais: 1.- Acondicionamento dos testículos; 2.- Lavagem e secagem dos testículos; 3.- Extração dos espermatozóides; 4.- Análise laboratorial; 5.- Diluição; 6.- Criopreservação; 7.- Congelação e 8.- Armazenamento.
Description
PROCESSO BE CONGELAÇÃO/CEIOFMESERVAÇÃO DE SÉMEN EPIDIDIMÁRIO E/OU CONGELAÇÃO PÓS-MORTEM
[1] Trata-se a presente patente de invenção, de um processo de congelaçâo/criopifcservação de sémen epididimário e/ou congelação põs- mortem, proveniente da cabeça e cauda dos epididimos de bovinos, bubalinos, cies, caprinos, equinos, ovinos e suínos, -pertencente às áreas técmeas de Biotecnologias aplicadas à Reprodução Animal e Criobioiogia.
[2] A sua importância refere-se à pwsiMBdade de congelação de amostras de sémen após a morte de reprodutores de alto valor .zootécnico de maneira a. se conservar material genético o qual faz parte de um dos maiores básicos de germoplasma do mundo que é o brasileiro;
[3] O melhoramento animal com a utilização de. material genético de qualidade superior impacta diretamente no desenvolvimento de rebanhos mais rentáveis corroborando a maior produção de alimentos por área* Ainda, em virtude do Brasil ser protagonista no cenário -mundial de agropecuária, esta técnica promoveria impacto económico de grande peso na balança comercial. FUNDAMENTOS DA TÉCNICA
[4] O procedimento de congelação de sémen epidtdkmáoo existe para fins únicos e exclusivos de pesquisa em virtude do espermatozóide proveniente dos epídídimos ser um excelente modelo experimental para se estudar a célula espermática de maneira isolada, livre de qualquer interaçâo com o processo ejaculatôrio e com componentes do plasma seminal. Entretanto» neste caso,, não há preocupação nenhuma com a capacidade fecundante dos espermatozáides descongelados, nem tâo pouco são amostras preparadas para pronta utilização na inseminação artificiai e fecundação in vitro.
[5] O processo de congelação pos -mortem ,objeto- da presente
patente, visa preservar material genético de reprodutores apos sua morte e/ou castração com grande preocupação com a capacidade fecundante, a concentração de espetnmiozóide e acondicionamento das amostras provenientes de sémen epidldimârio. Ainda, buscasse qualidade de amostras que permita cotnercializaçâo das mesmas de maneira lucrativa e competitiva, no mercado interno e externo, de maneira a ser mais ema verteste da indústria do sémen e da genética com elevado potencial de exploração pelo "agrobusiness '\
[6] Assim, a presente patente de invenção tem como objetivo proporcionar facilidades técnicas e operacionais configurando um excelente modelo experimental para pesquisas na área de fisiologia espermática.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[7] A presente invenção apresenta um processo de congciaçâo/criopreservação de sémen epMidimário e/ou congelação pós- mortem, permitindô a congelação de amostras de sémen após a morre de reprodutores de alto valor zootécnico de maneira a se conservar material genético provenientes da cabeça e cauda dos epídídimos de bovinos, baballnos, cies, caprinos, equinos, oviaos e suínos, através de oito etapas principais:
1.- Acondicionamento dos testículos;
2.- Lavagem e secagem dos testículos;
3.- Bxtração dos espermatozóides;
4.- Análise laboratorial;
5.- Diluição;
6.- Criopreservação;
7.- Congelação; e
8.- Armazenamento.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[8] O processo de coagelaçâo/criopreservação de sémen epididlmário e/ou congelação pos-mortem, se inicia após a morte ou castração de um reprodutor do grupo que consiste em bovinos, bubalinos, cães, caprinos, equinos, ovinos e suínos, onde os testículos são retirados por procedimento cirúrgico (no caso de obito, os testículos podem ser removidos de 0 a 12 horas após a morte), de acordo cosi as seguintes etapas:
L- Acondicionamento dos testículos:
1.1 - os testículos devem ser acondicionados em. um saco plástico onde deverá conter o volume de 03 a I litro de Dullbeco's Modified PihosphaCe Buffered Soiutkm (DMFBS). Solução salina fisiológica - NaCI 0,9% » (soro fisiológico), Ringer Lactato, Água de côco ou mesmo soro caseiro, para cada par de testículo;
1.2. - o saco deve ser lacrado retirando~se todo o volume de ar que for possível;
1.3. - coíoca-se dentro de uma caixa de isopor cobrese com uma camada de 20 centímetros de gelo em cubos comercial e o espaço vazio é preenchido com plástico bolha comercial;
1.4.- os testículos poderão permanecer neste sistema térmico de refrigeração por um tempo de 1 a 72 horas, durante o transporte para o laboratório;
2. - Lavagem e secagem dos testículos:
2.1.- após a recepção sao retiradas as tónicas testiculares e os mesmos são submetidos à lavagem com álcool 70° GL;
2.2.- os testículos são então enxutos com papel toalha descartável comercial e estão prontos para o início do procedimento;
3. - Extraçâo dos espermatozóides:
3.1- A extracto dos espennatozóides poderá ser realizada de ditas maneiras:
3.1.1. - a primeira denominada "fatiamento" onde a cabeça do epidldimo é pingada e com o uso de um bisturi com lâmina descartável realiza-se cortes longitudinais e transversais em toda a área determinada evitando- se a ocorrência de ruptura dos pequenos vasos sanguíneos presentes;
3.1.2. - a segunda maneira consiste em se divuisionar o epidldimo e lavar o lumen dos lóbulos senániferos com DMPBS, ou soro fisiológico ou Ringer Lactato, o lavado escorre para a superfície de uma placa de Petri e é recuperado por aspiração;
3,2,- a medida que os cortes são realizados e ou o lavado é obtido» colhe-se o conteúdo com o auxílio de uma pipeta e armazena-se o material em um tubo comendo 1 urL diluente Keuney simples ou acrescido de rafinose, ou DM.PBS, ou soro fisiológico, ou Ringer Lactato ou Água de côco;
4. - Análise laboratorial:
4,1 ," todo material recolhido segue segue então para analise onde sâo avaliados os seguintes parâmetros: concentração, motilidade, trajetéria, tipo de movimento, amplitude de movimento, patologias e danos a ultraestruturas tais como membrana, acrossoma, mitocôndrias e DN A;
5, - Diluição:
5.1." uma vez estabelecidos estes parâmetros, as amostras são diluídas em meio comercial ou de fabricação própria para a criopreservação, podendo ser a base de:
1 ) Glicina-gema-kúie (2 - 20%) com glicerol (4 - 15%)
2·') Tris-aema-cítrato (2 - 20%) com glicerol (4 - 15%)
3) Tris-gema- frutose (2 - 20%) com glicerol (4 - 15%)
4) Glicina-gema-leite (2 - 20%) cota glicerol e Dimetil Foimamtda (2 - 10%)
5) Tris-frutose-Dimetilfulfôxido (2 - 10%)
6) Tris-lecitina de soja-frutose (2 - 20%) com glicerol (4 - 15%) a eleição do diluente depende das características inerentes à cada espécie {bovinos, bubalmos» cães, caprinos, equinos, ovinos, suínos) e particularidades individuais e a diluição visará a obtenção de alíquotas (doses de sémen) com concentrações compreendidas entre 8,4x10* e 400x106 espermatozóides por mL;
Criopreservação:
6.1. - as doses de sémen são envasadas em palhetas francesas de 0,25 e/ou 0,5 mL devidamente identificadas;
6.2. - as palhetas são obliteradas/lacradas com álcool polívinflico, ou esferas de metal, ou massa atóxica, ou à alta temperatura;
6.3. - «pós o envase e obliteração das palhetas, as doses são submetidas às curvas de resfriamento compreendidas entre -0,1 e -1°C por minuto até atingirem o patamar de 5°C (graus Celcius);
6.4. - as doses serão mantidas à esta temperatura por um período de tempo compreendido entre 1 minuto e 10 minutos para estabilização e, quando diluídas com meios contendo glícerol, glicerolização das membranas, o tempo de estabilzação/glicerolização será entre 15 minutos (mínimo) e 240 minutos (máximo) dependendo das características espécie-específicas e individuais;
Congelação:
Vencida esta etapa da biotecnologia da criopreservação, segue a congelação a qual ocorre por curvas compreendidas entre -5 e -30°€ por minuto até atingirem o patamar de - 120°Ç (graus Celcius); e
8.- Armazenamento:
uma vez congeladas as doses de sémen serio acondicionadas em raques de crioarmazenamento e estocadas em botijões criobiológicos contendo nitrogénio liquido à uma temperatura de -196*0 (graus Cekius) por tempo indetenrimado.
EXEMPLO DE OBTENÇÃO
{9} A seguir será apresentado um exemplo de aplicação do invento realizado utilizando-se testículos de um Touro abatido, onde os testículos foram retirados por procedimento cirúrgico, de acordo com as seguistes etapas:
1. - Acondicionamento dos testículos:
LL- os testículos foram acondicionados em um saco plástico onde continha o volume de 1 litro de Dullbeco's Modífied Phosphate
Buffered Solutíon (DMFBS), para o par de testículos;
1.2.~ o saco foi lacrado retirando-se todo o volume de ar que foi possível;
1.3. - Colocou-se dentro de uma caixa de isopor cobriu-se com unia camada de 20 centímetros de gelo em cubos e o espaço vazio foi preenchido com plástico bolha comercial;
1.4. » Os testículos permaneceram «este sistema térmico de refrigeração por um tempo de 30 horas, durante o transporte para o laboratório;
2. - Lavagem e secagem dos testículos:
2.1. - após a recepção foram retiradas as túnicas testiculares e os mesmos foram submetidos à lavagem com álcool 70 GL;
2.2. - os testículos forma então enxutos com papel toalha descartável comercial e ficaram prontos para o início do procedimento;
3. - Extração dos espermatozóides;
3.1. - A extraçào dos espermatozóides foi realizada através de "fatiamènto" , onde a cabeça do epidídimo foi pitiçada e com o uso de um bisturi com lâmina descartável realizou-se cortes longitudinais e transversais em toda a área determiaada evitando-se a ocorrência de ruptura dos pequenos vasos sanguíneos presentes;
3.2. - a medida <|ue os cortes foram sendo realizados, colheu-se o conteúdo com o auxílio de uma pipeta e annazenou-se o material em um tubo contendo 1mL diluente Kenney;
4. - Análise laboratorial:
4.1.- todo material recolhido seguiu então para análise onde foram avaliados os seguintes parâmetros: concentração, motilidade, trajetória, tipo de movimento, amplitude de movimento, patologias e danos a ultraestruturas tais como membrana, acrossoma, mitocdndrias e DNA;
5, - Diluição:
5.1. - uma vez estabelecidos estes parâmetros, as amostras foram diluídas em meio comercial para a criopreservação a base de gema de ovo (20%) com glicerol (7%);
a diluição visou a obtenção de alíquotas (doses de sémen) com concentrações de 20x106 espermatozóides por mL;
6. - Criopreservação:
6.1- as doses de sémen foram envasadas em palhetas francesas de 0,25ce devidamente identificadas;
6.2. - as palhetas foram obliteradas com álcool polivmílico;
6.3. - após o envase e obliteração das palhetas, as doses foram submetidas à curva de resfriamento de -0,25°C por minuto até atingirem o patamar de 5°C (graus Celsius);
6A.- as doses foram mantidas à esta temperatura por um período de
tempo de 60 minutos para estabilização e glicerolização das membranas plasmática e acrossomais dos espermatozóides;
7.- Congelação:
Vencida esta de resfriamento, seguiu-se a congelação a qual se deu por curva de -2(fC por minuto até atingirem o patamar de -120°C (graus Celsius);
8.- Armazenamento:
Uma vez congeladas à 120 °C as doses de sémen foram acondicionadas em raques de crioarmazenamento e estocadas em botijões criobiológicos contendo nitrogénio liquido à uma temperatura de -19ó°C (graus Celsius).
VANTAGENS OBTIDAS COM O INVENTO
[10] O processo assim obtido, oferece as seguintes e extraordinárias vantagens:
- Preservação de material genético de um dado animal tido corno superior, mesmo após a morte;
- Maior produção de descendentes;
* Comercialização do material genético;
- Melhor congelabilidade dos espermatozóides;
- Maior facilidade de processamento paracriopreservação;
- Excelente modelo experimental para o desenvolvimento de biotecnologias com emprego de sémen animai; e
- Bloqueio de efeitos e interações nocivos e/ou indesejáveis inerentes ao plasma seminal.
[11] A abrangência da presente patente de invenção, não deve ser limitada ao exemplo, mas sim, aos termos definidos na reivindicação e seus equivalentes.
Claims
1.- PROCESSO DE CONGELAÇÃO/CRIOPRESERVÀÇÃO DE SÉMEN EPIDIDIMÁRIO E/OU CONGELAÇÃO PÓS-MORTEM, o qual se inicia após a morte ou castração de um reprodutor do grupo que consiste em bovinos, bubalinos, cães, caprinos» equinos, ovinos e suínos, onde os testículos sao retirados por procedimento cirúrgico (no caso de óbito, os testículos podem ser removidos de 0 a 12 horas após a morte), caracterizado por compreender as seguintes etapas:
1 Acondicionamento dos testículos:
1.1. - os testículos devem ser acondicionados em um saco plástico onde deverá conter o volume de 0,5 a 1 litro de Duilbcco's Modified Phosphate Buífered Solution (DMPBS), Solução salina fisiológica ~ NaCÍ 0,9% - (soro fisiológico), Ringer Lactato, Água de côco ou mesmo soro caseiro, para cada par de testículo;
1.2. - o saco deve ser lacrado rearando-se todo o volume de ar que for possível;
1.3. - coloca-se dentro de uma caixa de isopor cobre-se com uma camada de 20 centímetros de gelo em cubos comercial e o espaço vazio ê preenchido com plástico bolha comerciai;
1.4. - os testículos poderão permanecer neste sistema térmico de refrigeração por um tempo de 1 a 12 horas, durante o transporte para o laboratório;
2.- Lavagem e secagem dos testículos:
2.1. · após a recepção são retiradas as túnicas testiculares e os mesmos são submetidos à lavagem com álcool 70° GL;
2.2. - os testículos são então enxutos com papel toalha descartável comercial e estão prontos para o início do procedimento;
3. - Extração dos espermatozóides:
3.1. ~ A extraçâo dos espermatozóides poderá ser reatada de duas maneiras:
3.11- a primeira denominada "fatíaxnento", onde a cabeça do epidídímo é pínçada e com o uso de um bisturi com Jâmina descartável realim-se cortes longitudinais e transversais em toda a área determinada evitando-se a oeorrência de ruptura dos pequenos vasos sanguíneos presentes;
3.1.2.- a segunda maneira consiste em se divulsionar o epidídimo e lavar o Mmen dos ttíbulos seminíferos com DMPBS, ou soro fisiológico ou Ringer Lactato, o lavado escorre para a superfície de ama placa de Petri e é recuperado por aspiração;
3.2. - a medida que os cortes sào realizados e ou o lavado é obtido» coihe-se o conteúdo com o auxílio de uma pipeta e arma&ena-se o material em um tubo contendo LmL diluente Kenney simples ou acrescido de rafinose, ou DMPBS, ou soro fisiológico, ou Ringer Lactato ou Água de côco;
4. - Análise laboratorial:
4.1.· avaliação dos seguintes parâmetros: concentração, motilidade, trajetória, tipo de movimento, amplitude de movimento, patologias e danos a ultraesttuturas tais como membrana, acrossotim, mitocôiidrias e DNA;
5. - Diluição:
5.1.- uma vez estabelecidos estes parâmetros* as amostras são diluídas em meio comercial ou de fabricação própria para a criopreservaçào, podendo ser a base de:
1) Glicina-gema-leite (2 - 20%) com glícerol (4 - 15%)
2) Tris-gema-citrato (2 - 20%) com glice?oi(4 - 1.5%)
3) Tris-gema-frutose (2 - 20%) com glicerol (4 - 15%)
4) Oljcma-gema-leite (2 - 20%) com glicerol e Dimetil Formamida
(2 - 10%)
5) Trk-frutose-Dimetilsulfóxido (2 - 10%)
6) Tris-iecitina de soja-frutose (2 - 20%) cora glicerol (4 - 35%) a eleição do diluente depende das características Inerentes à cada espécie (bovinos, bubalinos, cães» caprinos, equinos, ovinos, suínos) e particularidades individuais e a diluição visará a obtenção de aliquotas (doses de sémen) com concentrações compreendidas entre 8,4x106 e 400x106 espermatozóides por mL;
6. Criopreservação:
6.1. - as doses de sémen são envasadas em palhetas francesas de 0,25 e/ou 0,5 mL devidamente identificadas;
6.2. - as palhetas são obliteradas/lacradas com álcool polivimlico, ou esferas de metal, ou massa atóxica, ou à alta temperatura;
63 - após o envase e obliteração das palhetas, as doses sao submetidas às curvas de resfriamento compreendidas entre -0,1 e - 1°C por minuto até atingirem o patamar de 5°C (graus Celcius);
6A- as doses serão mantidas à esta temperatura por um período de tempo compreendido entre .1 minuto e 10 minutos para estabilização e, quando diluídas com meios contendo glicero], glicerolização das membranas, o tempo de estabilização/glicerolização será entre 15 minutos (mínimo) e 240 minutos (máximo) dependendo das características spécie-especificas e individuais;
7. Congelação;
Vencida esta etapa da biotecnologia da criopreservação, segue a congelação a qual ocorre por curvas compreendidas entre -5 e -30°C
por minuto até atingirem o patamar de -120*0 (graus Celcíus); e 8.- Armazenamento:
uma vez congeladas as doses de sémen serão acondicionadas em raques de crioarmazeaamento e estocadas em botijões criobiológicos contendo nitrogénio líquido à uma temperatura de -196°C (graus Celcius) por tempo indeterminado.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BR102014022854A BR102014022854A2 (pt) | 2014-09-15 | 2014-09-15 | processo de congelação/criopreservação de sêmen epididimário e/ou congelação pós-mortem |
| BRBR102014022854-3 | 2014-09-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2016041034A1 true WO2016041034A1 (pt) | 2016-03-24 |
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| PCT/BR2015/000141 WO2016041034A1 (pt) | 2014-09-15 | 2015-09-14 | Processo be congelação/criopreservação de sêmen epididimário e/ou congelação pós-mortem |
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|---|---|
| BR (1) | BR102014022854A2 (pt) |
| WO (1) | WO2016041034A1 (pt) |
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| MOTA FILHO, A.C. ET AL.: "Recuperação e conservação de espermatozoides epididimários de mamiferos", ACTA VETERINARIA BRASILICA, vol. 6, no. 1, 2012, pages 1 - 8 * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN111771872A (zh) * | 2020-07-29 | 2020-10-16 | 天津市畜牧兽医研究所 | 一种牛精液冷冻稀释液及其制备方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR102014022854A2 (pt) | 2016-05-03 |
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