CN104705290B - 绵羊冻精稀释液及用于绵羊细管冻精的制作工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及羊冷冻精液生产技术领域，尤其是一种绵羊冻精稀释液及用于绵羊细管冻精的制作工艺。一种绵羊冻精稀释液,包括以下步骤制作：步骤一：基础液的制备；步骤二：稀释液A液的配制；步骤三：稀释液B液的配制；上述二、三步骤所获得的稀释液A液和稀释液B液为所要得到的绵羊冻精稀释液。绵羊冻精稀释液用于绵羊细管冻精的制作工艺，主要包括由以下步骤：一、绵羊冷冻精液稀释及平衡；二、制备绵羊冷冻精液细管冻精；三、冷冻及入库。本发明提供的绵羊冻精稀释液大大提高羊精生物活性、提高生产质量、经济实用，用于绵羊细管冻精的制作工艺操作方便、经济实用，操作方便快捷节约了时间，利于提高种羊的精液品质和年产精液量。
Description
技术领域
本发明涉及羊冷冻精液生产技术领域，尤其是一种绵羊冻精稀释液及用于绵羊细管冻精的制作工艺。
背景技术
使用精液冷冻技术可大大提高种公羊的利用率，减少公羊的饲养量，节约成本且不再受地域、时间的限制，加速品种的改良步伐。目前，国内外绵羊精液冷冻技术取得一定进展，但仍处于试验和改进阶段。近年来，随着高效规模化畜牧业发展趋势的要求，有关绵羊冷冻精液技术研究得到格外重视。本发明重点对精液冷冻稀释液配方和冷冻保存程序进行优化，旨在建立一套简单而高效的绵羊精液冷冻技术，同时提高绵羊冻精品质和产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大大提高羊精生物活性、提高生产质量、经济实用的羊冻精稀释液，及操作方便、经济实用，利于提高种羊的精液品质和年产精液量的绵羊细管冻精的制作工艺。
本发明公开了一种绵羊冻精稀释液,其特征在于主要包括以下步骤制作而成：
步骤一：基础液的制备：
三羟甲基氨基甲烷26.8～36.0g、柠檬酸13.8～18.0g、果糖10～20g，使用双蒸水定容至1L作为基础液使用；
步骤二：稀释液A液的配制：
取上述基础液800～880mL，加入蛋黄120～200mL、硫酸链霉素30～80万单位、环丙沙星0.8～1.5g、庆大霉素0.9～2.1g，充分混匀，制得稀释液A液；
步骤三：稀释液B液的配制：
取步骤二中所得的稀释液A液880～900mL，加入甘油100～120mL，其pH值在6.7～7.2之间，制得稀释液B液；
上述二、三步骤所获得的稀释液A液和稀释液B液为所要得到的绵羊冻精稀释液。
所述的绵羊冻精稀释液用于绵羊细管冻精的制作工艺，其特征在于主要包括由以下步骤：
步骤一：绵羊冷冻精液稀释及平衡：
(1)将接入的绵羊鲜精置于27.9℃～32.1℃水浴锅内待检；
(2)密度检测：直接吸取鲜精使用密度仪进行密度测定，要求密度≥20×108个/mL；
(3)活力检测：根据鲜精体积，使用等温稀释液A液即27.9℃～32.1℃进行1:1等量稀释，轻轻摇匀后吸取20±0.2μL精液放在恒温载玻片上，在200～400倍的相差显微镜下观察精液活力，每个样品必须至少观察3个视野，同时注意不同层面的精子运动状态，对精子活力进行全面评定，活力要求≥0.65；
(4)将检测合格的精液，补充添加稀释液A液，使稀释后精子密度为6.4×108～8×108个/mL，轻轻摇匀后，使用同温即27.9℃～32.1℃水浴逐步降温，置于常温环境下经4～11min渗透互溶缓慢降温；
(5)将第(4)步骤得到稀释精液放入0～4℃平衡柜中水浴平衡降温90～120min后，以体积比1:1加入等温稀释液B液，分两次添加稀释液B液，时间间隔为15～30min，每次加入稀释液B液总量的1/2，完成第二步稀释，此时混合精液密度为3.2×108～4×108个/mL，甘油浓度为5～6％，混匀后继续在0～4℃平衡柜中平衡75～90min，即可封装打印；
步骤二：制备绵羊冷冻精液细管冻精：
(1)灌装及打印：
将降温平衡后的精液进行品质评定即活力≥0.6，使用微型精液细管灌装机进行精液灌装，要求每剂微型细管吸入稀释精液量为0.18mL～0.21mL，棉塞端需完全浸湿，超声波封口，对灌装好的细管使用墨机打印生产信息；
(2)排版计数：
在0～4℃低温环境下，使用排版架进行排版计数，排版架规格100计数或175计数，排版过程中动作要迅速，避免温度回升；
步骤三：冷冻及入库：
使用全自动化冷冻设备冷冻仪进行冷冻，经6～7分钟冷冻时间形成冷冻精液，将冷冻好的细管精液快速分批次收集，浸入液氮罐中长期保存；
所述的稀释液A液、稀释液B液指的是绵羊冻精稀释液,由稀释液A液、稀释液B液所构成的绵羊冻精稀释液包括以下步骤制作而成：
步骤一：基础液的制备：
三羟甲基氨基甲烷26.8～36.0g、柠檬酸13.8～18.0g、果糖10～20g，使用双蒸水定容至1L作为基础液使用；
步骤二：稀释液A液的配制：
取上述基础液800～880mL，加入蛋黄200～120mL、硫酸链霉素30～80万单位、环丙沙星0.8～1.5g、庆大霉素0.9～2.1g，充分混匀，制得稀释液A液；
步骤三：稀释液B液的配制：
取步骤二中所得的稀释液A液880～900mL，加入甘油120～100mL，其pH值在6.7～7.2之间，制得稀释液B液；
上述二、三步骤所获得的稀释液A液和稀释液B液为所要得到的绵羊冻精稀释液。
所述的绵羊冻精稀释液用于绵羊细管冻精的制作工艺，所述的使用冷冻仪将排版好的微型精液细管进行冷冻过程中，最好首先在电脑中设置好冷冻的理想温度曲线：稀释精液经过适应区0～4℃、危险区0℃～-60℃、冷冻区-60℃～-110℃和深度冷冻区-110℃以下，总计7min形成冷冻精液。
与现有技术相比，稀释液的基本要求是能够给精子提供能量、有抗冷冻保护剂、有渗透性缓冲液、预防精子冷休克和抗生素。本发明中采用的三羟甲基氨基甲烷作为稀释液的主要成分，因其具有良好的缓冲性和渗透性，且高浓度时对精子的毒性也较低。柠檬酸易溶解，有良好的缓冲性能，并且完全无毒性。在冷冻稀释过程中，卵黄中的低密度脂蛋白可直接渗入精子原生质膜稳定质膜结构对精子具有一定的保护作用，卵黄还可为精子提供能量。甘油作为渗透性冷冻保护剂，由于其亲水性强，分子小，能够自由进入精细胞，在精细胞内能够限制和干扰水分子晶格的排列，减少大冰晶的产生及对精细胞的伤害。稀释液中添加的果糖主要为精子提供营养物质。稀释液中添加硫酸链霉素、环丙沙星、庆大霉素可抑制细菌的生长、繁殖，不影响精子活率，可抑制细菌的生长、繁殖，提高冻后精液质量，同时有利于冷冻精液的保存和运输。
本发明所提供的绵羊冻精生产工艺的优点：
1、温度的优化：
调整稀释温度：在传统羊冻精生产流程中，采用二次稀释法，即鲜精接入后先置于35℃～37℃水浴锅内，经过记录、计算得出所需添加稀释A、B液的量后，首先添加等温A液(35℃～37℃)，混匀后转移冰箱冷藏或4℃低温环境，1.5～2h水浴冷却到0～4℃后，添加等温B液(0～4℃)，平衡2～6h后，封装打印。但是，绵羊精液量较少一般在0.5～2mL，且鲜精采出后，首先要与内胎、集精杯接触，虽然有保温套保温，但不能做到绝对保温，鲜精与外界温差越大，精液降温速度越快，再从采精现场到实验室接精窗口这段时间，精液一直在持续降温。所以，鲜精从采出到放置于水浴锅内，温度已经降低了很多，一般在27.9℃～32.1℃，与附睾内的温度有差异，如果在放入35℃～37℃水浴锅内，鲜精温度将会再次提高。因而精子反复回温，耗能增加，易致精子衰竭。本发明采用下列方式：接入鲜精后，置于27.9℃～32.1℃水浴锅，检测、记录、计算完毕后，添加等温的稀释A液，混匀后，置于常温环境下，水浴(温度27.9℃～32.1℃)逐步降温4～11min。而后连同稀释B液一同放入0～4℃低温操作柜中水浴降温平衡90～120min。对比结果见表1。
表1鲜精在不同流程时的温度：
| 附睾内 | 接入时放置温度 | 稀释A液温度 | |
| 鲜精温度 | 37～38℃ | 28～32℃ | |
| 优化前 | 37～38℃ | 35℃ | 35℃ |
| 优化后 | 37～38℃ | 30℃ | 30℃ |
2、稀释B液添加方法的优化：
常规稀释流程中，第一步稀释混匀后转移至冰箱冷藏室或4℃低温环境，1.5～2h水浴冷却到0～4℃，在相同温度下加入冷冻稀释液并混匀，完成第二步稀释。但是，含有甘油的冷冻保护剂添加的速度过快或是在精子细胞内流动太快，甘油将对精子毒副作用增加。故采用二次添加B稀释液，可降低甘油对精子的损伤。本发明中稀释液的添加方法：将经一次稀释后的稀释精液放入0～4℃低温操作柜中水浴降温平衡90～120min后，分两次添加等温稀释B液(温度0～4℃)，时间间隔为15～30min，每次加入B液总量的1/2，混匀后在0～4℃平衡柜中继续平衡75～90min。增加这一步骤，可降低含有甘油的稀释B液因加入速度过快而引起精子损伤。对比结果见表2。
表2稀释B液在不同流程时的添加方法：
3、甘油添加量及平衡降温时间的优化
虽然稀释液中添加甘油可以降低冷冻过程对精子的冷打击，防止精子冷休克，但高浓度甘油会损伤精子的顶体和有关酶类，影响精子的活力和受精力。因此甘油浓度并不是越高越好，在不影响冷冻效果的前提下，应尽量降低甘油的浓度。同时过长的平衡时间可能也会对精子造成损伤。冷冻速率与甘油的添加量有紧密关系，冷冻速率越快，甘油的需要越少。本发明中降低了甘油的添加量，添加稀释B液后缩短平衡降温时间，这样有效降低了高浓度甘油对精子的损伤，同时缩短降温平衡时间，可减少精子代谢，降低能量消耗。这样有效提高冻后精子活力。对比结果见表3。
表3优化前后精液冷冻保存甘油的添加量：
4、细管冻精制作过程中对灌装、冷冻步骤的优化
传统羊冻精生产中，将稀释平衡后的精液在0～4℃温度下吸入0.25mL细管中，用聚乙烯醇粉封口后，迅速将细管置于距离液氮表面4～5cm的冷冻架上，熏蒸4～5min后，将细管投入到液氮中长期保存。但虽然加入了冷冻保护剂(甘油)，仍然存在着危险区(0℃～-60℃)，如何以最快的速度越过危险区，而又不至于使精子受到损伤，这是一个关键问题。本发明中：采用微型精液细管灌装机对精液进行灌装；使用冷冻仪将排版好的微型精液细管进行冷冻，首先在电脑中设置好冷冻的理想温度曲线：稀释精液经过适应区0～4℃、危险区0℃～-60℃、冷冻区-60℃～-110℃和深度冷冻区-110℃以下，总计7min形成冷冻精液。使用冷冻仪冷冻细管，优点在于可以控制冷冻过程中的温度随时间下降的快慢程度变化是否在这一过程中精子由适应环境到被保护阶段最后深度冷冻阶段，达到最理想值，有效控制通过危险区的时间，减少精子受损伤，实现理想的冷冻状态。自精液灌装至冷冻机械化操作，更适用于规模化批量生产。
表4为利用传统羊冻精制作方法与利用本发明所提供的绵羊冻精制作方法所做的试验对比数据，表中所示利用改进前传统冻精制作方法为试验Ⅰ组，利用改进后本发明所提供的冻精制作方法为试验Ⅱ组。
表4冻精制作流程优化前后数据对比
由表4可知，使用本发明提供的稀释液配方及工艺流程可提高不同品种绵羊各个年龄阶段冻精冻后活力，有效降低冻后菌落数，提高冻精精液品质，对精液冷冻保存具有良好效果。优化生产工艺流程前后主要生产数据结果见表5。
表5优化生产工艺流程前后主要生产数据
综上所述，本发明提供的绵羊冻精稀释液大大提高羊精生物活性、提高生产质量、经济实用，用于绵羊细管冻精的制作工艺操作方便、经济实用，操作方便快捷节约了时间，利于提高种羊的精液品质和年产精液量。
具体实施方式
实施例1：
一种绵羊冻精稀释液,主要包括以下步骤制作而成：
步骤一：基础液的制备：
三羟甲基氨基甲烷30.44g、柠檬酸17.21g、果糖12.65g，使用双蒸水定容至1L作为基础液使用；
步骤二：稀释液A液的配制：
取上述基础液800mL，加入蛋黄200mL、硫酸链霉素50万单位、环丙沙星1.15g、庆大霉素1.6g，充分混匀，制得稀释液A液；
步骤三：稀释液B液的配制：
取步骤二中所得的稀释液A液890mL，加入甘油110mL，其pH值在6.7～7.2之间，制得稀释液B液；
上述二、三步骤所获得的稀释液A液和稀释液B液为所要得到的绵羊冻精稀释液。
实施例2：
一种绵羊冻精稀释液,主要包括以下步骤制作而成：
步骤一：基础液的制备：
三羟甲基氨基甲烷26.8g、柠檬酸13.8g、果糖10g，使用双蒸水定容至1L作为基础液使用；
步骤二：稀释液A液的配制：
取上述基础液800mL，加入蛋黄200mL、硫酸链霉素30万单位、环丙沙星1.5g、庆大霉素2.1g，充分混匀，制得稀释液A液；
步骤三：稀释液B液的配制：
取步骤二中所得的稀释液A液880mL，加入甘油120mL，其pH值在6.7～7.2之间，制得稀释液B液；
上述二、三步骤所获得的稀释液A液和稀释液B液为所要得到的绵羊冻精稀释液。
实施例3：
一种绵羊冻精稀释液,主要包括以下步骤制作而成：
步骤一：基础液的制备：
三羟甲基氨基甲烷29.0g、柠檬酸15.0g、果糖13g，使用双蒸水定容至1L作为基础液使用；
步骤二：稀释液A液的配制：
取上述基础液820mL，加入蛋黄180mL、硫酸链霉素50万单位、环丙沙星1.4g、庆大霉素2.0g，充分混匀，制得稀释液A液；
步骤三：稀释液B液的配制：
取步骤二中所得的稀释液A液885mL，加入甘油115mL，其pH值在6.7～7.2之间，制得稀释液B液；
上述二、三步骤所获得的稀释液A液和稀释液B液为所要得到的绵羊冻精稀释液。
实施例4：
一种绵羊冻精稀释液,主要包括以下步骤制作而成：
步骤一：基础液的制备：
三羟甲基氨基甲烷32.0g、柠檬酸16.0g、果糖15g，使用双蒸水定容至1L作为基础液使用；
步骤二：稀释液A液的配制：
取上述基础液840mL，加入蛋黄160mL、硫酸链霉素60万单位、环丙沙星1.2g、庆大霉素0.95g，充分混匀，制得稀释液A液；
步骤三：稀释液B液的配制：
取步骤二中所得的稀释液A液890mL，加入甘油110mL，其pH值在6.7～7.2之间，制得稀释液B液；
上述二、三步骤所获得的稀释液A液和稀释液B液为所要得到的绵羊冻精稀释液。
实施例5：
一种绵羊冻精稀释液,主要包括以下步骤制作而成：
步骤一：基础液的制备：
三羟甲基氨基甲烷35.0g、柠檬酸17.0g、果糖18g，使用双蒸水定容至1L作为基础液使用；
步骤二：稀释液A液的配制：
取上述基础液860mL，加入蛋黄140mL、硫酸链霉素70万单位、环丙沙星1.0g、庆大霉素2.05g，充分混匀，制得稀释液A液；
步骤三：稀释液B液的配制：
取步骤二中所得的稀释液A液895mL，加入甘油105mL，其pH值在6.7～7.2之间，制得稀释液B液；
上述二、三步骤所获得的稀释液A液和稀释液B液为所要得到的绵羊冻精稀释液。
实施例6：
一种绵羊冻精稀释液,主要包括以下步骤制作而成：
步骤一：基础液的制备：
三羟甲基氨基甲烷36.0g、柠檬酸18.0g、果糖20g，使用双蒸水定容至1L作为基础液使用；
步骤二：稀释液A液的配制：
取上述基础液880mL，加入蛋黄120mL、硫酸链霉素80万单位、环丙沙星0.8g、庆大霉素0.9g，充分混匀，制得稀释液A液；
步骤三：稀释液B液的配制：
取步骤二中所得的稀释液A液900mL，加入甘油100mL，其pH值在6.7～7.2之间，制得稀释液B液；
上述二、三步骤所获得的稀释液A液和稀释液B液为所要得到的绵羊冻精稀释液。
实施例7：
本实施例与实施例1相比，其不同地方在于：
利用制备完成的所述的绵羊冻精稀释液用于绵羊细管冻精的制作工艺，主要包括由以下步骤：
步骤一：绵羊冷冻精液稀释及平衡：
(1)将接入的绵羊鲜精置于27.9℃水浴锅内待检；
(2)密度检测：直接吸取鲜精使用密度仪进行密度测定，要求密度≥20×108个/mL；
(3)活力检测：根据鲜精体积，使用等温稀释液A液即27.9℃进行1:1等量稀释，轻轻摇匀后吸取19.8μL精液放在恒温载玻片上，在200倍的相差显微镜下观察精液活力，每个样品必须至少观察3个视野，同时注意不同层面的精子运动状态，对精子活力进行全面评定，活力要求≥0.65；
(4)将检测合格的精液，补充添加稀释液A液，使稀释后精子密度为6.4×108个/mL，轻轻摇匀后，使用同温即27.9℃水浴逐步降温，置于常温环境下经4min渗透互溶缓慢降温；
(5)将第(4)步骤得到稀释精液放入0℃平衡柜中水浴平衡降温90min后，以体积比1:1加入等温稀释液B液，分两次添加稀释液B液，时间间隔为15min，每次加入稀释液B液总量的1/2，完成第二步稀释，此时混合精液密度为3.2×108个/mL之间，甘油浓度为5％，混匀后继续在0℃平衡柜中平衡75min，即可封装打印；
步骤二：制备绵羊冷冻精液细管冻精：
(1)灌装及打印：
将降温平衡后的精液进行品质评定即活力≥0.6，使用微型精液细管灌装机进行精液灌装，要求每剂微型细管吸入稀释精液量为0.18mL，棉塞端需完全浸湿，超声波封口，对灌装好的细管使用墨机打印生产信息；
(2)排版计数：
在0℃低温环境下，使用排版架进行排版计数，排版架规格100计数或175计数，排版过程中动作要迅速，避免温度回升；
步骤三：冷冻及入库：
使用全自动化冷冻设备冷冻仪进行冷冻，经6分钟冷冻时间形成冷冻精液，将冷冻好的细管精液快速分批次收集，浸入液氮罐中长期保存。
实施例8：
本实施例与实施例2相比，其不同地方在于：
利用制备完成的所述的绵羊冻精稀释液用于绵羊细管冻精的制作工艺，主要包括由以下步骤：
步骤一：绵羊冷冻精液稀释及平衡：
(1)将接入的绵羊鲜精置于28℃水浴锅内待检；
(2)密度检测：直接吸取鲜精使用密度仪进行密度测定，要求密度≥20×108个/mL；
(3)活力检测：根据鲜精体积，使用等温稀释液A液即28℃进行1:1等量稀释，轻轻摇匀后吸取20μL精液放在恒温载玻片上，在300倍的相差显微镜下观察精液活力，每个样品必须至少观察3个视野，同时注意不同层面的精子运动状态，对精子活力进行全面评定，活力要求≥0.65；
(4)将检测合格的精液，补充添加稀释液A液，使稀释后精子密度为6.8×108个/mL，轻轻摇匀后，使用同温即28℃水浴逐步降温，置于常温环境下经6min渗透互溶缓慢降温；
(5)将第(4)步骤得到稀释精液放入2℃平衡柜中水浴平衡降温100min后，以体积比1:1加入等温稀释液B液，分两次添加稀释液B液，时间间隔为18min，每次加入稀释液B液总量的1/2，完成第二步稀释，此时混合精液密度为3.5×108个/mL，甘油浓度为5.5％，混匀后继续在2℃平衡柜中平衡78min，即可封装打印；
步骤二：制备绵羊冷冻精液细管冻精：
(1)灌装及打印：
将降温平衡后的精液进行品质评定即活力≥0.6，使用微型精液细管灌装机进行精液灌装，要求每剂微型细管吸入稀释精液量为0.19mL，棉塞端需完全浸湿，超声波封口，对灌装好的细管使用墨机打印生产信息；
(2)排版计数：
在1℃低温环境下，使用排版架进行排版计数，排版架规格100计数或175计数，排版过程中动作要迅速，避免温度回升；
步骤三：冷冻及入库：
使用全自动化冷冻设备冷冻仪进行冷冻，经6.5分钟冷冻时间形成冷冻精液，将冷冻好的细管精液快速分批次收集，浸入液氮罐中长期保存。
实施例9：
本实施例与实施例3相比，其不同地方在于：
利用制备完成的所述的绵羊冻精稀释液用于绵羊细管冻精的制作工艺，主要包括由以下步骤：
步骤一：绵羊冷冻精液稀释及平衡：
(1)将接入的绵羊鲜精置于30℃水浴锅内待检；
(2)密度检测：直接吸取鲜精使用密度仪进行密度测定，要求密度≥20×108个/mL；
(3)活力检测：根据鲜精体积，使用等温稀释液A液即30℃进行1:1等量稀释，轻轻摇匀后吸取19.9μL精液放在恒温载玻片上，在400倍的相差显微镜下观察精液活力，每个样品必须至少观察3个视野，同时注意不同层面的精子运动状态，对精子活力进行全面评定，活力要求≥0.65；
(4)将检测合格的精液，补充添加稀释液A液，使稀释后精子密度为7.0×108个/mL，轻轻摇匀后，使用同温即30℃水浴逐步降温，置于常温环境下经8min渗透互溶缓慢降温；
(5)将第(4)步骤得到稀释精液放入3℃平衡柜中水浴平衡降温105min后，以体积比1:1加入等温稀释液B液，分两次添加稀释液B液，时间间隔为20min，每次加入稀释液B液总量的1/2，完成第二步稀释，此时混合精液密度为3.6×108个/mL，甘油浓度为6.0％，混匀后继续在3℃平衡柜中平衡80min，即可封装打印；
步骤二：制备绵羊冷冻精液细管冻精：
(1)灌装及打印：
将降温平衡后的精液进行品质评定即活力≥0.6，使用微型精液细管灌装机进行精液灌装，要求每剂微型细管吸入稀释精液量为0.2mL，棉塞端需完全浸湿，超声波封口，对灌装好的细管使用墨机打印生产信息；
(2)排版计数：
在2℃低温环境下，使用排版架进行排版计数，排版架规格100计数或175计数，排版过程中动作要迅速，避免温度回升；
步骤三：冷冻及入库：
使用全自动化冷冻设备冷冻仪进行冷冻，经6.8分钟冷冻时间形成冷冻精液，将冷冻好的细管精液快速分批次收集，浸入液氮罐中长期保存。
实施例10：
本实施例与实施例4相比，其不同地方在于：
利用制备完成的所述的绵羊冻精稀释液用于绵羊细管冻精的制作工艺，主要包括由以下步骤：
步骤一：绵羊冷冻精液稀释及平衡：
(1)将接入的绵羊鲜精置于31℃水浴锅内待检；
(2)密度检测：直接吸取鲜精使用密度仪进行密度测定，要求密度≥20×108个/mL；
(3)活力检测：根据鲜精体积，使用等温稀释液A液即31℃进行1:1等量稀释，轻轻摇匀后吸取20.1μL精液放在恒温载玻片上，在300倍的相差显微镜下观察精液活力，每个样品必须至少观察3个视野，同时注意不同层面的精子运动状态，对精子活力进行全面评定，活力要求≥0.65；
(4)将检测合格的精液，补充添加稀释液A液，使稀释后精子密度为7.5×108个/mL，轻轻摇匀后，使用同温即31℃水浴逐步降温，置于常温环境下经10min渗透互溶缓慢降温；
(5)将第(4)步骤得到稀释精液放入4℃平衡柜中水浴平衡降温110min后，以体积比1:1加入等温稀释液B液，分两次添加稀释液B液，时间间隔为25min，每次加入稀释液B液总量的1/2，完成第二步稀释，此时混合精液密度为3.9×108个/mL，甘油浓度为5.0％，混匀后继续在4℃平衡柜中平衡85min，即可封装打印；
步骤二：制备绵羊冷冻精液细管冻精：
(1)灌装及打印：
将降温平衡后的精液进行品质评定即活力≥0.6，使用微型精液细管灌装机进行精液灌装，要求每剂微型细管吸入稀释精液量为0.21mL，棉塞端需完全浸湿，超声波封口，对灌装好的细管使用墨机打印生产信息；
(2)排版计数：
在3℃低温环境下，使用排版架进行排版计数，排版架规格100计数或175计数，排版过程中动作要迅速，避免温度回升；
步骤三：冷冻及入库：
使用全自动化冷冻设备冷冻仪进行冷冻，经7分钟冷冻时间形成冷冻精液，将冷冻好的细管精液快速分批次收集，浸入液氮罐中长期保存。
实施例11：
本实施例与实施例5相比，其不同地方在于：
利用制备完成的所述的绵羊冻精稀释液用于绵羊细管冻精的制作工艺，主要包括由以下步骤：
步骤一：绵羊冷冻精液稀释及平衡：
(1)将接入的绵羊鲜精置于32.1℃水浴锅内待检；
(2)密度检测：直接吸取鲜精使用密度仪进行密度测定，要求密度≥20×108个/mL；
(3)活力检测：根据鲜精体积，使用等温稀释液A液即32.1℃进行1:1等量稀释，轻轻摇匀后吸取20.2μL精液放在恒温载玻片上，在400倍的相差显微镜下观察精液活力，每个样品必须至少观察3个视野，同时注意不同层面的精子运动状态，对精子活力进行全面评定，活力要求≥0.65；
(4)将检测合格的精液，补充添加稀释液A液，使稀释后精子密度为8.0×108个/mL，轻轻摇匀后，使用同温即32.1℃水浴逐步降温，置于常温环境下经11min渗透互溶缓慢降温；
(5)将第(4)步骤得到稀释精液放入4℃平衡柜中水浴平衡降温120min后，以体积比1:1加入等温稀释液B液，分两次添加稀释液B液，时间间隔为30min，每次加入稀释液B液总量的1/2，完成第二步稀释，此时混合精液密度为4.0×108个/mL，甘油浓度为6.0％，混匀后继续在4℃平衡柜中平衡90min，即可封装打印；
步骤二：制备绵羊冷冻精液细管冻精：
(1)灌装及打印：
将降温平衡后的精液进行品质评定即活力≥0.6，使用微型精液细管灌装机进行精液灌装，要求每剂微型细管吸入稀释精液量为0.2mL，棉塞端需完全浸湿，超声波封口，对灌装好的细管使用墨机打印生产信息；
(2)排版计数：
在4℃低温环境下，使用排版架进行排版计数，排版架规格100计数或175计数，排版过程中动作要迅速，避免温度回升；
步骤三：冷冻及入库：
使用全自动化冷冻设备冷冻仪进行冷冻，经7分钟冷冻时间形成冷冻精液，将冷冻好的细管精液快速分批次收集，浸入液氮罐中长期保存。
实施例12：
本实施例与实施例7相比，其不同地方在于：所述的使用冷冻仪将排版好的微型精液细管进行冷冻过程中，首先在电脑中设置好冷冻的理想温度曲线：稀释精液经过适应区0～4℃、危险区0℃～-60℃、冷冻区-60℃～-110℃和深度冷冻区-110℃以下，总计7min形成冷冻精液。
实施例13：
本实施例与实施例8相比，其不同地方在于：所述的使用冷冻仪将排版好的微型精液细管进行冷冻过程中，首先在电脑中设置好冷冻的理想温度曲线：稀释精液经过适应区0～4℃、危险区0℃～-60℃、冷冻区-60℃～-110℃和深度冷冻区-110℃以下，总计7min形成冷冻精液。
实施例14：
本实施例与实施例11相比，其不同地在于：所述的使用冷冻仪将排版好的微型精液细管进行冷冻过程中，首先在电脑中设置好冷冻的理想温度曲线：稀释精液经过适应区0～4℃、危险区0℃～-60℃、冷冻区-60℃～-110℃和深度冷冻区-110℃以下，总计7min形成冷冻精液。
Claims (1)
1.一种绵羊冻精稀释液用于绵羊细管冻精的制作方法，其特征在于主要包括以下步骤：
步骤一：绵羊冷冻精液稀释及平衡：
(1)将接入的绵羊鲜精置于27.9℃～32.1℃水浴锅内待检；
(2)密度检测：直接吸取鲜精使用密度仪进行密度测定，要求密度≥20×108个/mL；
(3)活力检测：根据鲜精体积，使用等温稀释液A液即27.9℃～32.1℃进行1:1等量稀释，轻轻摇匀后吸取20±0.2μL精液放在恒温载玻片上，在200～400倍的相差显微镜下观察精液活力，每个样品必须至少观察3个视野，同时注意不同层面的精子运动状态，对精子活力进行全面评定，活力要求≥0.65；
(4)将检测合格的精液，补充添加稀释液A液，使稀释后精子密度为6.4×108～8×108个/mL，最终添加量为鲜精液的3～7倍，轻轻摇匀后，使用同温即27.9℃～32.1℃水浴逐步降温，置于常温环境下经4～11min渗透互溶缓慢降温；
(5)将第(4)步骤得到稀释精液放入0～4℃平衡柜中水浴平衡降温90～120min后，以体积比1:1加入等温稀释液B液，分两次添加稀释液B液，时间间隔为15～30min，每次加入稀释液B液总量的1/2，完成第二步稀释，此时混合精液密度为3.2×108～4×108个/mL，甘油浓度为5～6％，混匀后继续在0～4℃平衡柜中平衡75～90min，即可封装打印；
步骤二：制备绵羊冷冻精液细管冻精：
(1)灌装及打印：
将降温平衡后的精液进行品质评定即活力≥0.6，使用微型精液细管灌装机进行精液灌装，要求每剂微型细管吸入稀释精液量为0.18mL～0.21mL，棉塞端需完全浸湿，超声波封口，对灌装好的细管使用墨机打印生产信息；
(2)排版计数：
在0～4℃低温环境下，使用排版架进行排版计数，排版架规格100计数或175计数，排版过程中动作要迅速，避免温度回升；
步骤三：冷冻及入库：
使用全自动化冷冻设备冷冻仪进行冷冻，经6～7分钟冷冻时间形成冷冻精液，将冷冻好的细管精液快速分批次收集，浸入液氮罐中长期保存；
所述的稀释液A液、稀释液B液指的是绵羊冻精稀释液,由稀释液A液、稀释液B液所构成的绵羊冻精稀释液包括以下步骤制作而成：
步骤一：基础液的制备：
三羟甲基氨基甲烷26.8～36.0g、柠檬酸13.8～18.0g、果糖10～20g，使用双蒸水定容至1L作为基础液使用；
步骤二：稀释液A液的配制：
取上述基础液800～880mL，加入蛋黄200～120mL、硫酸链霉素30～80万单位、环丙沙星0.8～1.5g、庆大霉素0.9～2.1g，充分混匀，制得稀释液A液；
步骤三：稀释液B液的配制：
取步骤二中所得的稀释液A液880～900mL，加入甘油120～100mL，其pH值在6.7～7.2之间，制得稀释液B液；
上述二、三步骤所获得的稀释液A液和稀释液B液为所要得到的绵羊冻精稀释液；
所述的使用冷冻仪将排版好的微型精液细管进行冷冻过程中，首先在电脑中设置好冷冻的理想温度曲线：稀释精液经过适应区0～4℃、危险区0℃～-60℃、冷冻区-60℃～-110℃和深度冷冻区-110℃以下，总计7min形成冷冻精液。
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