CN114223647A

CN114223647A - 一种含外泌体的湖羊精液冻存液及冻存方法

Info

Publication number: CN114223647A
Application number: CN202111551532.0A
Authority: CN
Inventors: 王争光; 曾建露; 姚婷; 韩强; 张云超; 王邵雨; 陈曦
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-12-17
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2022-03-25

Abstract

本发明提供了一种湖羊精液冻存液。所述湖羊精液冻存液包含以下浓度的组分：Tris 25～40g/L、柠檬酸15～18g/L、果糖5～15g/L、山梨醇5～20g/L、甘油3～10v/v％、BSA 2～7g/L、湖羊间充质干细胞冻干粉0.2～0.8g/L。所述湖羊精液冻存液可以有效降低湖羊精液在冻存过程中的损伤和“衰老”现象，能很好地保持精子的活力和顶体完整性。使用本发明冻存液和冻存方法对湖羊精液进行超低温冻存，解冻后精子仍然具有较好的授精能力，受胎效果稳定，可满足湖羊冷冻精液人工授精的要求，具有广阔的应用前景。

Description

一种含外泌体的湖羊精液冻存液及冻存方法

技术领域

本发明属于湖羊养殖技术领域，具体涉及一种含外泌体的湖羊精液冻存液及冻存方法。

背景技术

湖羊是太湖平原重要的家畜之一，是我国一级保护地方畜禽品种。畜牧学分类上为羔皮、肉食兼用的粗毛羊。湖羊在太湖平原的育成和饲养已有八百多年的历史。由于受到太平湖的自然条件和人为选择的影响，逐渐育成独特的一个稀有品种，产区在浙江、江苏间的太湖流域，所以称为"湖羊"。

为提高湖羊的繁殖效率，充分利用优良种公畜的精液，实际生产中已将人工授精技术应用于湖羊的配种中。但羊的精子和鸡、牛精子相比更加脆弱，在冷冻、解冻过程极易形成损伤，从而失去受精能力。现有羊冷冻精液解冻后活率较低且存在很多“衰老”精子和弱死精子，有效精子少，活力低，质量差，很难满足人工授精的需要。而精液的保存是人工受精技术的核心环节，因此开发一种保存效果好的保存液十分必要。

1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为"exosome"。现今，外泌体特指直径在40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。外泌体可携带多种与源细胞相似的蛋白质、mRNA、miRNA，参与免疫调节、细胞通讯、细胞迁移、血管新生等过程。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种湖羊精液冻存液，其含有湖羊间充质干细胞冻干粉，在用于湖羊精液冻存时能有效保持湖羊精子的存活率、活力和顶体完整性，有效防止精子的损伤和“衰老”。

具体技术方案为：

一种湖羊精液冻存液，其包含以下浓度的组分：Tris 25～40g/L、柠檬酸 15～18g/L、果糖5～15g/L、山梨醇5～20g/L、甘油3～10v/v％、BSA 2～7g/L、湖羊间充质干细胞冻干粉0.2～0.8g/L。

在其中一些实施例中，所述的湖羊精液冻存液包含以下浓度的组分：Tris 30～35g/L、柠檬酸15～18g/L、果糖5～10g/L、山梨醇10～20g/L、甘油5～10v/v％、 BSA 2～5g/L、间充质干细胞冻干粉0.2～0.5g/L。

在其中一些实施例中，所述的湖羊精液冻存液还包括抗生素。

在其中一些实施例中，所述抗生素及使用量如下：青霉素80～100万IU/L、链霉素0.8～1g/L。

在其中一些实施例中，所述湖羊间充质干细胞冻干粉制备方法如下：

(1)无菌条件下收集湖羊脐带；

(2)清洗残留的血液，分离获得华通氏胶，然后将其剪成小块，加入Ⅱ型胶原蛋白酶，于37℃消化得到单细胞悬液，加入PBS终止消化，离心，向细胞沉淀中加入含血清的羊脐带间充质干细胞培养液，吹打均匀后接种于培养板中进行培养；

(3)待步骤(2)中培养的细胞融合度达到80～90％时，对细胞进行传代培养；

(4)取传代至3～5代的细胞，用PBS缓冲液清洗，然后用无血清羊脐带间充质干细胞培养液培养48h，收集培养上清液；

(5)从上述上清液中分离获得外泌体，真空冷冻干燥，得到外泌体冻干粉。

在其中一些实施例中，步骤(5)所述分离获得外泌体的方法为离心法，具体如下：300g离心10min，取上清；2000g离心10min，取上清；10000g离心 30min，取上清；100000g离心70min，取沉淀；用PBS重悬沉淀，然后100000g 离心70min，收集沉淀，即得所述外泌体。

本发明还提供了所述湖羊精液冻存液在湖羊精液保存中的应用。

本发明还提供了一种湖羊精液保存方法，包括以下步骤：

(1)取新鲜湖羊精液，将所述精液加入所述湖羊精液冻存液中，混合均匀后加入冻存管；

(2)将冻存管于4℃放置1～2h，然后于距离液氮液面4～6cm处放置8～ 10min，最后投入液氮中进行保存。

在其中一些实施例中，所述步骤(1)冻存管中精子的密度为2×10⁸～6×10⁸个/mL。

本发明经过研究发现，将湖羊间充质干细胞冻干粉用于制备湖羊精液冻存液，并通过组分的优化获得了一种稳定高效的湖羊精液冻存液，其可以有效降低湖羊精液在冻存过程中的损伤和“衰老”现象，能很好地保持精子的活力和顶体完整性。使用本发明冻存液和冻存方法对湖羊精液进行超低温冻存，解冻后精子仍然具有较好的授精能力，受胎效果与鲜精接近，可满足湖羊冷冻精液人工授精的要求，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和 /或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

本实施例一种湖羊精液冻存液，包含以下浓度的组分：Tris 30g/L、柠檬酸 16g/L、果糖8g/L、山梨醇10g/L、甘油7.5v/v％、BSA 3g/L、间充质干细胞冻干粉0.3g/L、青霉素100万IU/L、链霉素1g/L。

所述湖羊间充质干细胞冻干粉制备方法如下：

(1)无菌条件下收集湖羊脐带；

(2)清洗残留的血液，分离获得华通氏胶，然后将其剪成小块，加入浓度为1mg/mL的Ⅱ型胶原蛋白酶，于37℃消化6h得到单细胞悬液，加入PBS终止消化，离心，弃上清，向细胞沉淀中加入含血清的羊脐带间充质干细胞培养液，吹打均匀后接种于培养板中进行培养；

(3)待步骤(2)中培养的细胞融合度达到80～90％时，对细胞进行传代培养：弃培养上清，加入0.25％胰酶，于37℃消化2～3min，待细胞变圆脱落，加入PBS终止消化，离心弃上清，细胞用入含血清的羊脐带间充质干细胞培养液进行培养；

(4)收集传代至4代的细胞，用PBS缓冲液清洗，离心弃上清，细胞用无血清羊脐带间充质干细胞培养液培养48h，收集培养上清液；

(5)从上述上清液中分离获得外泌体：300g离心10min，取上清；2000g 离心10min，取上清；10000g离心30min，取上清；100000g离心70min，取沉淀；用PBS重悬沉淀，然后100000g离心70min，收集沉淀，即得所述外泌体；然后真空冷冻干燥，得到所述外泌体冻干粉。

实施例2

本实施例一种湖羊精液冻存液，包含以下浓度的组分：Tris 35g/L、柠檬酸17.5g/L、果糖6g/L、山梨醇20g/L、甘油5.5v/v％、BSA 4g/L、间充质干细胞冻干粉0.5g/L、青霉素100万IU/L、链霉素1g/L。

所述湖羊间充质干细胞冻干粉制备方法同实施例1。

实施例3

本实施例一种湖羊精液冻存液，包含以下浓度的组分：Tris 33g/L、柠檬酸15.5g/L、果糖9g/L、山梨醇15g/L、甘油10v/v％、BSA 2.5g/L、间充质干细胞冻干粉0.4g/L、青霉素100万IU/L、链霉素1g/L。

所述湖羊间充质干细胞冻干粉制备方法同实施例1。

对比例1

本对比例一种湖羊精液冻存液，包含以下浓度的组分：Tris 30g/L、柠檬酸 16g/L、果糖8g/L、山梨醇10g/L、甘油7.5v/v％、BSA 3g/L、新鲜蛋黄液5v/v％、青霉素100万IU/L、链霉素1g/L。

利用上述实施例和对比例中的精液冻存液对湖羊精液进行冻存，解冻后对精子活率、活力和顶体完整率进行检测。

实施例1～3中精液冻存液的制备方法如下：按比例称取Tris、柠檬酸、果糖、山梨醇和BSA，加入双蒸水中，充分溶解并混合均匀后，用0.2um滤膜过滤，然后加入青霉素和链霉素，混合均匀，然后加入甘油，混合均匀，使用前加入间充质干细胞冻干粉，混合均匀，即得所述湖羊精液冻存液。

对比例1中精液冻存液的制备方法如下：按比例称取Tris、柠檬酸、果糖、山梨醇和BSA，加入双蒸水中，充分溶解并混合均匀后，用0.2um滤膜过滤，然后加入青霉素和链霉素，混合均匀，然后加入甘油，混合均匀，使用前加入灭菌的新鲜蛋黄液，混合均匀，即得所述湖羊精液冻存液。

精液冻存方法如下：用假阴道法采集成年湖羊种公羊精液，测定精液活率，符合要求(活率大于80％)即进行冷冻保存，保存方法如下：将来源于同一湖羊的精液分别加入实施例1～3和对比例1所述湖羊精液冻存液中，使精子的密度为6×10⁸个/mL，混合均匀后加入冻存管中，将冻存管于4℃放置2h，然后于距离液氮液面5cm处放置10min，最后投入液氮中进行保存。

解冻和质量指标检测：冻存1个月后，将上述各组冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴锅中，摇晃至精液溶化成透明状，取出精液进行以下质量指标检测：

(1)精子活率测定：取15μL样品在400倍视野下评定精子活率，精子运动参数主要包括精子活率、精子直线运动速率和曲线速率。

(2)顶体完整率的检测：取15μL样品制作抹片，经含有甲醛的柠檬酸盐液固定、姬姆萨染液染色后封装，1000倍或相差显微镜下随机计算每200个精子顶体完整率。

检测结果如下表1所示：

组别	冻存前活率	解冻后活率	活力	顶体完整率
					实施例1	85％	72.8％	60.2％	80.2％
实施例2	85.6％	70.4％	62.3％	79.3％
					实施例3	85％	73.1％	61.7％	80％
对比例1	85.5％	56.8％	50.2％	60.5％

由表1的结果可知，使用本发明提供的精液冻存液(实施例1～3)对湖羊精液进行冻存，能有效降低低温冻存过程中精子的损伤，当重新解冻后，精子的活率、活力和顶体完整率都保持在较好的水平。

与实施例1相比，对比例1利用常用的新鲜蛋黄液代替间充质干细胞冻干粉来制备精液冻存液，在相同冻存条件下，其对湖羊精液的冻存效果明显低于实施例1，说明间充质干细胞冻干粉中可能存在某种能在低温条件下对湖羊精子起保护作用的组分，从而降低冻存过程中精子的损伤程度。

实施例4

本实施例研究使用实施例1所述冻存液对湖羊精液进行冻存再解冻后精子的授精效果。具体如下：

用假阴道法采集成年湖羊种公羊精液，测定精液活率，符合要求(活率大于80％)即进行冷冻保存，保存方法如下：将湖羊的精液加入实施例1所述湖羊精液冻存液中，使精子的密度为6×10⁸个/mL，混合均匀后加入冻存管中，将冻存管于4℃放置2h，然后于距离液氮液面5cm处放置10min，最后投入液氮中进行保存。

解冻：1个月后，将上述冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴锅中，摇晃至精液溶化成透明状，取出精液进行人工授精。

经检测，上述解冻后的湖羊精液具有授精能力的时间高达28h，使发情期湖羊母羊受胎率高达87.8％，接近鲜精的受胎率，说明实施例1所述冻存液对湖羊精液具有很好的保持效果，精子的活力和顶体完整性保持得很好。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种湖羊精液冻存液，其特征在于，包含以下浓度的组分：Tris 25～40g/L、柠檬酸15～18g/L、果糖5～15g/L、山梨醇5～20g/L、甘油3～10v/v％、BSA 2～7g/L、湖羊间充质干细胞冻干粉0.2～0.8g/L。

2.如权利要求1所述的湖羊精液冻存液，其特征在于，包含以下浓度的组分：Tris 30～35g/L、柠檬酸15～18g/L、果糖5～10g/L、山梨醇10～20g/L、甘油5～10v/v％、BSA 2～5g/L、间充质干细胞冻干粉0.2～0.5g/L。

3.如权利要求1所述的湖羊精液冻存液，其特征在于，还包括抗生素。

4.如权利要求3所述的湖羊精液冻存液，其特征在于，所述抗生素及使用量如下：青霉素80～100万IU/L、链霉素0.8～1g/L。

5.如权利要求1所述的湖羊精液冻存液，其特征在于，所述湖羊间充质干细胞冻干粉制备方法如下：

(1)无菌条件下收集湖羊脐带；

6.如权利要求5所述的湖羊精液冻存液，其特征在于，步骤(5)所述分离获得外泌体的方法为离心法，具体如下：300g离心10min，取上清；2000g离心10min，取上清；10000g离心30min，取上清；100000g离心70min，取沉淀；用PBS重悬沉淀，然后100000g离心70min，收集沉淀，即得所述外泌体。

7.如权利要求1～6任一项所述湖羊精液冻存液在湖羊精液保存中的应用。

8.一种湖羊精液保存方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取新鲜湖羊精液，将所述精液加入如权利要求1～6任一项所述湖羊精液冻存液中，混合均匀后加入冻存管；

(2)将冻存管于4℃放置1～2h，然后于距离液氮液面4～6cm处放置8～10min，最后投入液氮中进行保存。

9.如权利要求8所述的湖羊精液保存方法，其特征在于，所述步骤(1)冻存管中精子的密度为2×10⁸～6×10⁸个/mL。