KR20200071061A - 배양된 육류 조성물 - Google Patents

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KR20200071061A
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톰 벤-아리에
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알레프 팜스 리미티드
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Abstract

본 발명은, 식용 조성물을 제조하는 방법으로서, 3차원 다공성 스캐폴드, 및 근아세포 또는 이의 전구세포, 세포외 매트릭스(ECM)-분비 세포의 적어도 하나의 유형, 및 내피 세포 또는 이의 전구세포를 포함하는 복수의 세포 유형을 인큐베이팅하는 단계 및 근아세포의 근관으로의 분화를 유도하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

Description

배양된 육류 조성물
상호 참조
본 출원은, 2017년 7월 15일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/532,998호의 우선권의 이익을 주장하며, 이의 내용은 전체가 참조로서 본원에 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 특히 배양된 육류의 조성물 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
조작된 또는 클린육으로서 또한 공지된 배양된 육류는 조직 공학 기술을 사용하여 세포 배양으로부터 생산되고, 살아있는 동물을 사용한 전통적 식육 생산을 위한 유망한 대체물이다. 과거 십년 동안, 이러한 개념은, 특히 최초로 실험실 성장 배양된 우육 버거의 제조 후, 여론, 대중 매체, 투자자 및 과학계에서 증가된 주목을 획득했다. 동물을 사용하여 생산된 식품은, 동물이 이들의 평생에 걸쳐 대량의 식품을 소비하기 때문에 비효율적인 것으로 간주되고, 80 내지 90%의 칼로리는 동물의 대사 및 비-식용 조직의 생산으로 소비된다. 상이한 산업을 비교하면, 우육은 가장 중요한 환경적 영향을 갖지만, 일반적으로, 모든 동물-기반 제품은, 식물-기반 제품과 비교하여, 토양 및 물의 수요, 및 온실 가스(GHG) 배출량의 측면에서 보다 거대한 환경적 부하를 갖는다. UN 식량 농업 기구의 보고에 따르면, 축산 부문은 GHG 배출량의 18%를 담당하고, 지구 지형의 30% 또는 경작지의 70% 및 세계적 담수의 8%를 사용한다. 또한, 세계의 식육 수요는 2050년까지 2배 증가할 것으로 예상되며, 이는 종래의 식육 생산 시스템이 지속가능하지 않음을 의미한다. 몇몇 식육 공급원과 비교하여, 배양된 육류는 7 내지 45%의 에너지 사용, 78 내지 96%의 GHG 배출량, 99%의 토지 사용 및 82 내지 96%의 물 사용을 감소시키는 것으로 추정된다.
집약적 공장 농업 및 빈약한 동물 복지 조건은 식중독의 원인, 예컨대, 돼지 및 조류 인플루엔자, 및 식육에서 발견될 수 있는 이. 콜라이, 살모넬라 및 캄필로박터의 확산의 원인이다. 무균 관리된 환경에서 식육을 생산하는 것은, 식품 안전성을 개선시키는 것을 도울 수 있다. 또한, 미국에서 사용된 모든 항생물질의 70%가 식품 첨가제로서 농장 동물에게 제공되며, 이는 항균제 내성 균주의 선택을 촉진시키고 다약물 내성 박테리아의 가능성을 증가시킨다. 항생물질의 과잉사용은 항생물질 내성 박테리아의 출현의 주요 원인이고, 이는 미국에서만 연간 550억달러의 경제적 부담, 250,000건의 입원사례 및 적어도 23,000건의 사망 원인으로 되고 있다. 최근, 항생물질의 최후의 수단인 콜리스틴에 내성을 갖는 박테리아가 중국 돼지 농장에서 출현되었다.
현재의 배양된 육류 기술은 위성 세포 배양에 초점을 맞추고 있다. 세포는 2차원(2D) 플라스크 내에서 또는 현탁액 중의 마이크로 담체 상에서 성장되고, 단리되고, 분화되고, 회수된다. 그러나, 조직은 세포 단독으로 이루어지지 않고; 거대분자, 예컨대, 당단백질 및 올리고당으로 구성되고 조직에 이의 생화학적 및 생체역학적 특성을 제공하는 세포외 매트릭스(ECM)가 조직의 대부분이다. ECM은 세포 거동을 조절하고 이들의 조성에 영향을 미친다. 따라서, ECM 생산 세포는 배양된 육류에 불가결하고, 프로세스, 예컨대, 세포 채취는 회피되어야 한다. 추가로, 3차원(3D) 세포 배양은 자연 세포 환경을 모방하고, 세포 생화학적 내용에 영향을 미치는 정확한 세포 거동에 불가결하다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 근관을 포함하는 식용 조성물, 및 식용 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 복수의 세포 유형(예를 들면, 위성 세포, ECM-분비 세포 및 내피 세포)을 포함하는 세포 배양이, 예컨대, 3차원 다공성 스캐폴드(porous scaffold)에서 성장시키는 경우, 대조군과 비교하여, 보다 양호한 생존, 증식 및 근관 형성을 나타냈다는 발견에 부분적으로 기초한다.
본 발명은 추가로, 위성 세포, 예컨대, 비-인간 위성 세포가, 높은 EC 농도가 아닌 낮은 내피 세포(EC) 농도로 공-배양하는 경우, 보다 양호한 분화 활성을 가졌다는 놀라운 발견에 부분적으로 기초한다.
한 가지 양태에 따르면, 식용 조성물을 제조하는 방법으로서,
(a) 3차원 다공성 스캐폴드, 및 (i) 근아세포 또는 이의 전구세포; 및 (ii) 세포외 매트릭스(ECM)-분비 세포의 적어도 하나의 유형; 또는 (iii) 내피 세포 또는 이의 전구세포 중의 적어도 하나를 포함하는 복수의 세포 유형을 인큐베이팅(incubating)하는 단계로서, 상기 근아세포 또는 이의 전구세포 및 상기 내피 세포 또는 이의 전구세포가 10:1 내지 1:10 범위의 비율로 인큐베이팅되는, 단계; 및 (b) 근아세포 또는 이의 전구세포의 근관으로의 분화를 유도하여, 식용 조성물을 제조하는 단계
를 포함하는, 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 상기 복수의 세포 유형은 근아세포 또는 이의 전구세포, 세포외 매트릭스(ECM)-분비 세포의 적어도 하나의 유형, 및 내피 세포 또는 이의 전구세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 ECM-분비 세포는 간질 세포, 섬유아세포, 주피세포, 평활근 세포 및 이의 전구세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 상기 복수의 세포 유형은 근아세포, ECM-분비 세포 및 내피 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 근아세포의 상기 전구세포는 위성 세포이다.
일부 실시형태에서, 상기 내피 세포는 골격 미소혈관 내피 세포, 대동맥 평활근 세포 또는 이의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 상기 복수의 세포 유형은 위성 세포, ECM-분비 세포 및 내피 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 근아세포 또는 이의 전구세포 및 ECM-분비 세포는 10:1 내지 1:1 범위의 비율로 인큐베이팅된다.
일부 실시형태에서, 상기 ECM-분비 세포 및 내피 세포는 1:10 내지 1:1 범위의 비율로 인큐베이팅된다.
일부 실시형태에서, 상기 위성 세포, 상기 ECM-분비 세포 및 상기 내피 세포는 10:1:1 내지 2:1:10 범위의 비율로 인큐베이팅된다.
일부 실시형태에서, 상기 ECM-분비 세포는 섬유아세포, 이의 전구세포 또는 이의 조합이다.
일부 실시형태에서, 상기 3차원 다공성 스캐폴드는 조직화 단백질, 비-조직화 단백질 및 다당류(polysaccharide)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 조직화 단백질은 조직화 대두 단백질이다. 일부 실시형태에서, 상기 3차원 다공성 스캐폴드는 20 내지 1,000㎛ 범위의 평균 직경을 갖는 세공(pore)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 복수의 세포 유형은 비-인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 복수의 세포는 가축 포유동물로부터 유래한다.
일부 실시형태에서, 상기 근아세포 또는 이의 전구세포 및 상기 3차원 다공성 스캐폴드는 103 내지 107의 상기 근아세포 또는 이의 전구세포 대 10mg의 상기 3차원 다공성 스캐폴드 범위의 비율로 인큐베이팅된다. 일부 실시형태에서, 상기 3차원 다공성 스캐폴드는 세포외 매트릭스를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, (a) 3차원 다공성 스캐폴드; (b) 상기 3차원 다공성 스캐폴드 mm3당 100,000 내지 250,000 근관 핵을 포함하는 근관; 및 (c) (i) 근아세포 또는 이의 전구세포; 및 (ii) ECM-분비 세포의 적어도 하나의 유형; 또는 (iii) 내피 세포 또는 이의 전구세포 중의 적어도 하나로부터 선택된 복수의 세포 유형으로서, 상기 내피 세포 또는 이의 전구세포는 상기 복수의 세포의 15% 미만을 구성하는, 복수의 세포 유형을 포함하는, 조성물이 제공된다.
일부 실시형태에서, 상기 조성물은 식용이다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 전체 기술적 및/또는 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사 또는 동등한 방법 및 재료를 본 발명의 실시형태의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 예시적 방법 및/또는 재료를 하기에 기재한다. 모순하는 경우, 정의를 포함하는 특허 명세서가 우선할 수 있다. 추가로, 재료, 방법 및 예는 단지 예시적이며, 반드시 한정하는 것을 의도하는 것은 아니다.
본 발명의 추가의 실시형태 및 적용성의 완전한 범위는 하기 제공된 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 예는, 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내고 있지만, 본 발명의 정신 및 범위 내의 다양한 변경 및 수정이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백하기 때문에, 예시로서만 제공되는 것을 이해해야 한다.
도 1a 내지 1c는 상업용 TSP를 나타내는 사진이다. (a)는 TSP의 대, 중 및 소 청크 제품을 나타낸다. (b) 및 (c)는 TVP(좌측) 및 아콘(우측)으로 주석된 바와 같이 2개의 다른 상업용 TSP 플레이크 제품을 나타낸다.
도 2a 내지 2b는 TSP 스캐폴드 제조물(a) 및 세포 함유 TSP 스캐폴드(b)를 나타내는 사진이다.
도 3a 내지 3b는 대 TSP(a) 및 중 TSP(b)의 100× 확대 SEM 이미지이다.
도 4a 내지 4b는 대 TSP(a) 및 중 TSP(b)의 2×105 확대 SEM 이미지이다.
도 5a 내지 5c는, 섬유아세포의 파종후 8일(a), 18일(b) 및 21일(c)에 섬유아세포(적색) 및 내피(녹색) 세포로 채워진 TSP 스캐폴드의 공초점 현미경 이미지이다.
도 6은 대, 중 소 및 90°로부터 중간으로서 표시된 상이한 공급원으로부터 수득한 스캐폴드의 3개 상이한 샘플(샘플 1 내지 3)에 200,000 섬유아세포(적색)의 파종후 14일에 채취한 공초점 현미경 이미지이고, 90°로부터 중간으로서 표시된 스캐폴드는 스캐폴드 제조 절차 TSP 스캐폴드에서 TSP의 세공측으로부터 절단했다. 스케일 바 = 1mm.
도 7은 14일 동안 TSP 스캐폴드에서 배양한 근아세포의 공초점 현미경 이미지이다(청색-DAPI, 녹색-데스민(Desmin)).
도 8은 14일 동안 TSP 스캐폴드에서 배양한 소 골격근 세포의 공초점 현미경 이미지이다(청색-DAPI, 녹색-팔로이딘(Phalloidin)).
도 9a 내지 9e는 상이한 배지에 파종한 소 대동맥 평활근 세포(BAOSMC)(계대 8)의 현미경사진이다. (a) 기초 배지; (b) 상업용 배지; (c) 태소 혈청(15%) 보충; (d) 비-필수 아미노산 보충; 및 (e) 피루베이트 보충. 스케일 바=100㎛.
도 10a 내지 10b는 배양 3일후 계대 9(a) 및 계대 10(b)에서 소 대동맥 평활근 세포 증식에 대한 상이한 배지의 비교의 수직 막대 그래프이다.
도 11a 내지 11b는 소 피부 섬유아세포(BDF)(a) 및 소 대동맥 평활근 세포(BAOSMC; b)의 성장 동태를 나타내는 그래프이다.
도 12a 내지 12l은 2일(a, d, g 및 j), 6일(b, e, h 및 k) 및 8일(c, f, i 및 l)에 지지 세포와의 공-배양으로 파종한 형광 표지된 소 대동맥 내피 세포(BAEC) 세포의 이미지이다. BAEC 세포(녹색)는 소 대동맥 평활근 세포(SMC; a 내지 f) 또는 소 피부 섬유아세포(BDF; g 내지 l)와 함께 파종했고, 둘 모두는 적색이다. a 내지 c 및 g 내지 i는 ×5 확대로 3×3의 타일 스캔이다. d 내지 f 및 j 내지 l은 ×20 확대이다. 스케일 바=100㎛.
도 13a 내지 13l은 2일(a, d, g 및 j), 6일(b, e, h 및 k) 및 8일(c, f, i 및 l)에 지지 세포와의 공-배양으로 파종한 형광 표지된 소 골격근 미소혈관 내피 세포(BSkMVEC) 세포의 이미지이다. BSkMVEC 세포(녹색)는 소 대동맥 평활근 세포(SMC; a 내지 f) 또는 소 피부 섬유아세포(BDF; g 내지 l)와 함께 파종했고, 둘 모두는 적색이다. a 내지 c 및 g 내지 i는 ×5 확대로 3×3의 타일 스캔이다. d 내지 f 및 j 내지 l은 ×20 확대이다. 스케일 바=100㎛.
도 14a 내지 14f는 상이한 비율로 BAEC 및 SMC를 포함하는 형광 표지된 세포 공-배양의 이미지이다. (a 및 d) 5:1 BAEC 대 SMC; (b 및 e) 1:1 BAEC 대 SMC. (c 및 f)는 각각 b 및 e의 고확대이다. a 내지 c는 2일에 채취한 이미지이고, d 내지 f는 6일에 채취한 것이다. BAEC는 적색이다; 스케일 바=100㎛.
도 15a 내지 15e는 상이한 비율로 BAEC 및 BDF를 포함하는 형광 표지된 세포 공-배양의 이미지이다. (a 및 c) 5:1 BAEC 대 SMC; (b 및 d) 1:1 BAEC 대 SMC. (e)는 d의 고확대이다. a 및 b는 2일에 채취한 이미지이고, c 및 d는 6일에 채취한 것이다. BAEC는 적색이다; 스케일 바=100㎛.
도 16a 내지 16l은 상이한 비율로 BAEC 및 SMC를 포함하는 형광 표지된 세포-공배양의 이미지이다. (a-d) 1:3 BAEC 대 SMC; (e-h) 1:1 BAEC 대 SMC; 및 (i-l 및 f) 5:1 BAEC 대 SMC. (b, d, f, h, j 및 l)은 각각 (a, c, e, g, i 및 k)의 고확대이다. (a, b, e, f, i 및 j)는 2일에 채취한 이미지이고, (c, d, g, h, k 및 l)은 6일에 채취한 것이다. BAEC는 적색이다; 스케일 바=100㎛.
도 17a 내지 17g는 소 위성 세포(BSC)의 분화 및 근관의 형성을 나타낸다. (a-c)는 분화 전의 BSC 세포의 이미지이고; (d-f)는 분화 후의 BSC 세포의 이미지이다. (g)는 샘플의 융합 지수(FI)를 나타내는 수직 막대 그래프이다. (a 및 d) 광학 현미경; (b 및 e) 훽스트(Hoechst); 및 (c 및 f) 미오게닌(Myogenin). 분화 전후의 자동 FI의 차이는 통계학적으로 유의한 것으로 밝혀졌고(P-값=0.00003), 자동 및 수동 FI 사이의 차이는 없었다.
도 18a 내지 18g는 분화 0일에서 BSC의 명시야 현미경사진이다. (a) 대조군; (b) 소 섬유아세포 성장 인자(bFGF); (c) 표피 성장 인자(EGF); (d) IGF-1(인슐린-유사 성장 인자 1); (e) Pro-LIF(성장 인자 LIF(백혈병 억제 인자) 부재하의 증식 배지); (f) 위닝(Weaning); 및 (g) DiI. 스케일 바=300㎛.
도 19a 내지 19g는 분화 4일에서 BSC의 명시야 현미경사진이다. (a) 대조군; (b) 소 섬유아세포 성장 인자(bFGF); (c) 표피 성장 인자(EGF); (d) IGF-1(인슐린-유사 성장 인자 1); (e) Pro-LIF; (f) 위닝; 및 (g) DiI. 스케일 바=300㎛.
도 20a 내지 20h는 분화 7일에서 BSC의 근관 형성을 나타낸다. (a-g)는 (a) 대조군; (b) 소 섬유아세포 성장 인자(bFGF); (c) 표피 성장 인자(EGF); (d) IGF-1(인슐린-유사 성장 인자 1); (e) Pro-LIF; (f) 위닝; 및 (g) DiI의 명시야 현미경사진이다. 스케일 바=300㎛. (h)는 각각의 상이한 확장 조건에 대해 정량한 근관 면적 %의 수직 막대 그래프이다.
도 21은 성장 배지 또는 Pro-LIF 배지에서 7일에 다공성 스캐폴드에 대한 세포 커버리지의 정량 값을 나타내는 수직 막대 그래프이다.
도 22a 내지 22l은 다공성 스캐폴드 상에서 분화된 형광 표지된 BSC의 공초점 현미경 이미지이다. 확장기는 다음을 포함했다: (a-d) 성장 배지에서 배양한 세포; (e-h) Pro-LIF 배지에서 배양한 세포; (i-l) Pro-LIF-bFGF 배지에서 배양한 세포. 분화기는 다음을 포함했다: (a, e 및 i) 성장 인자(GF)가 분화 배지에 첨가되지 않은 것; (b, f 및 j) IGF-1이 분화 배지에 첨가된 것; (c, g 및 k) EGF가 분화 배지에 첨가된 것; 및 (d, h 및 l) IGF-1 및 EGF가 분화 배지에 첨가된 것. DiI(적색); 데스민(녹색); 스케일 바=100㎛.
도 23a 내지 23o는 파종후 14일에 채취한 PLLA/PLGA 스캐폴드에서 성장시킨 삼중-배양의 면역형광 현미경사진이다. BSC, SMC 및 BAEC는 (a-e) 2:1:1 및 (f-j) 2:1:5의 상이한 세포 밀도로 PLLA/PLGA 스캐폴드에 파종했다. (k-o)는 (a-e)의 확대이다. 스캐폴드는 (a, f 및 k) DAPI; (b, g 및 l) 미오게닌; (c, h 및 m) DiI; (d, i 및 n) CD31으로 염색되었다. (e, j 및 o)는 병합된 이미지이다. 스케일 바=100㎛ (a-j); 10㎛ (k-o).
도 24a 내지 24f는 파종후 14일에 PLLA/PLGA 스캐폴드의 면역형광 현미경사진이다. BSC, SMC 및 BEC는 (a-c) 2:1:1 및 (d-f) 2:1:5의 상이한 세포 밀도로 PLLA/PLGA 스캐폴드에 파종했다. (a 및 d) BSC 및 SMC(2:1); (b 및 e) BSC 및 BEC(2:1); 및 (c 및 f) BSC 단독의 단일배양. 스캐폴드는 DAPI(청색); 미오게닌(회색); DiI(적색); 및 CD31(녹색)으로 염색되었다. 스케일 바=100㎛.
도 25a 내지 25h는, 파종후 14일에, 조직화 대두 단백질 스캐폴드에서 SMC와 공-배양된 BSC의 면역형광 현미경사진이다. (a-d) 2:1:1 및 (e-h) 2:1:5의 상이한 세포 밀도를 시험했다. 스캐폴드는 (a 및 e) DAPI; (b 및 f) 미오게닌; (c 및 g) DiI로 염색되었고; (d) 및 (h)는 각각 (a-c) 및 (e-g)의 병합 이미지이다. 스케일 바=100㎛.
도 26a 내지 26e는, 파종후 14일에, 조직화 대두 단백질 스캐폴드에서 삼중-배양된 BSC, SMC 및 BEC의 면역형광 현미경사진이다. 스캐폴드는 (a) DAPI; (b) 미오게닌; (c) DiI; 및 (d) CD31로 염색되었다. (e)는 (a-d)의 병합 이미지이다.
도 27a 내지 27b는, 파종후 14일에, 2:1:1의 비율로 PLLA/PLGA 스캐폴드에 파종된 BSC, SMC 및 BEC의 삼중-배양의 트리-크롬 염색의 현미경사진이다. (a) ×5 확대의 타일 스캔 및 (b) ×10 확대. 스캐폴드는 트리-크롬으로 염색되었다. 양성 세포외 매트릭스(ECM) 염색은 둘러싸여 있다. 스케일 바=100㎛.
도 28a 내지 28c는, 배양물 중의 근원성 분화 및 상이한 세포 비율의 중요성에 대한 지지 세포의 효과를 나타내는 수직 막대 그래프이다. 근원성 분화는 PLLA/PLGA 스캐폴드 상에서 (a) 2:1:1 및 (b) 2:1:5의 세포 밀도로 삼중-배양(BSC:SMC:BEC) 및 대조군(공-배양 또는 단일배양)에 대해 제시되어 있다. (c) 통계 분석으로 조직화 대두 단백질 상의 2:1:1.
도 29a 내지 29n은 조직화 단백질 스캐폴드에서 삼중-배양의 분화를 기재한다. (a-l)은, 파종후 14일에, 면역염색된 조직화 대두 단백질 스캐폴드의 형광 이미지이다. 세포는 조직화 대두 단백질 스캐폴드 (a, e 및 i) BSC, (b, f 및 j) BSC+BEC; (c, g 및 k) BSC+SMC; 및 (d, h 및 l) BSC+SMC+BEC의 삼중 배양으로 파종했다. (a-d) ×20 확대, (e-h) ×20의 타일 스캔 및 (i-l) 미오게닌 염색, ×63 확대. 스캐폴드는 DAPI(청색), 미오게닌(회색), DiI(적색) 및 CD31(녹색)으로 염색되었다. 스케일 바=100㎛. (m)은 단일-배양(BSC 단독), 공-배양(BSC+BEC; 또는 BSC+SMC) 및 삼중-배양(BSC+SMC+BEC)에서 TSP 스캐폴드에 대한 미오게닌 발현 정량화의 수직 막대 그래프이다. (n)은 단일-배양 및 SMC와의 공-배양에서 TSP 스캐폴드에 대한 BSC 커버리지 정량화의 수직 막대 그래프이다.
도 30은, 파종후 14일에, 겔폼 스캐폴드 상에 겔 부재하에 파종한 면역염색된 BSC의 형광 이미지이다. 스캐폴드는 DAPI(청색), 미오게닌(회색), DiI(적색); 및 CD31(녹색)으로 염색되었다. 스케일 바=50㎛.
본 발명은 식품 소비를 위한 조성물, 키트 및 배양된 육류를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 일부 실시형태에서, 다공성 조직화 단백질, 및 근아세포를 포함하는 다공성 조직화 단백질, 및 이에 부착된 하나 이상의 세포 유형을 포함하는 3차원 다-유형 세포 조직을 포함하는 식용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 근아세포 및 하나 이상의 세포 유형을 특정 조건하에서 3차원 다공성 스캐폴드(예를 들면, 다공성 조직화 단백질)과 함께 시험관내 배양함으로써 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 인간, 비-인간 동물 또는 이들 둘 모두에 의한 소비를 위해 의도될 수 있다. 일부 실시형태에서, 배양된 육류 제품은 인간 소비를 위한 식품 제품이다. 다른 실시형태에서, 배양된 육류 제품은 동물 사료, 예컨대, 가축용 사료, 수산양식용 사료 또는 가정용 펫트용 사료에 사용된다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 식용 조성물을 제조하는 방법으로서,
a. 3차원 다공성 스캐폴드, 및 근아세포 및 지방세포, 섬유아세포 및 이의 전구세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 ECM-분비 세포를 포함하는 복수의 세포 유형; 및 내피 세포 또는 이의 전구세포를 인큐베이팅하는 단계;
b. 복수의 세포 유형을 3차원 다공성 스캐폴드 상에서 확장시키는 단계; 및
c. 근관으로의 근아세포 분화를 유도하는 단계를 포함하고,
이에 의해 세포가 근 세포를 포함하는 3차원 다-유형 세포 조직 및 다공성 조직화 단백질을 포함하는 식용 조성물을 형성하는 것을 가능하게 하는 방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "근관"은 복수의 근아세포 및/또는 근세포의 융합으로부터 형성되는 다핵 섬유를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "근 세포"는 근육 조직에 기여하는 임의의 세포를 지칭하고, 근아세포, 위성 세포(SC) 근관, 근섬유 및 근원섬유 조직을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 근아세포를 시험관내 또는 생체외에서 배양하고, 이들 세포를 특정 유형의 근육 세포, 예컨대, 골격근 세포 또는 평활근 세포로 분화시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, 다공성 조직화 단백질; 및 근 세포를 포함하는 3차원 다-유형 세포 조직(여기서, 3차원 다-유형 세포 조직은 다공성 조직화 단백질에 부착되고, 3차원 다-유형 세포 조직은 근아세포, 및 다공성 조직화 단백질을 갖는 지방세포, 섬유아세포, 평활근 세포, 내피 세포 및 이의 전구세포로부터 선택된 하나 이상의 세포 유형을 포함하는 복수의 세포 유형을 시험관내 배양하는 것으로부터 유래한다)을 포함하는 식용 조성물에 관한 것이다.
하기 예시된 바와 같이, 조성물은, 예를 들면, 추가의 구조적 및 기계적 지지를 세포에 제공하는 세포외 매트릭스(ECM)를 형성하기 위해 세포외 분자를 분비하는 섬유아세포를 포함할 수 있다.
하기 추가로 예시된 바와 같이, 조성물은 조직 지지를 제공하고 신호전달을 제공하고/하거나 모세관 내피를 형성하는 내피 세포(EC) 또는 내피 전구세포(EPC)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 3차원 다-유형 세포 조직은 골격근 세포, 평활근 세포 및 위성 세포를 포함하는 근육 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 3차원 다-유형 세포 조직은 지방 세포(fat cell)(예를 들면, 지방세포(adipocyte))를 포함한다. 일부 실시형태에서, 3차원 다-유형 세포 조직은 특수화 세포(예를 들면, 섬유아세포)에 의해 분비된 세포외 매트릭스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 3차원 다-유형 세포 조직은 내피 세포, 또는 내피 세포에 의해 형성된 모세관 내피를 포함하고, 대동맥 내피 세포 및 골격 미소혈관 내피 세포를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 3차원 다-유형 세포 조직은 세포외 매트릭스를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 3차원 다-유형 세포 조직은 지방세포를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 3차원 다-유형 세포 조직은 모세관을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 다공성 조직화 단백질 및 세포 배양 배지를 포함하는 세포 성장에 적합한 조성물에 관한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 세포 성장에 적합한 조성물은, 성장 인자, 사이토킨, 생물활성제, 영양소, 아미노산, 항생물질 화합물, 항-염증 화합물 또는 이의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 세포의 생존력 및 성장에 적합한 배지 및 화합물은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은, 다공성 조직화 단백질에 부착된, 근아세포, 및 지방세포, 섬유아세포, 내피 세포, 평활근 세포 및 이의 전구세포로부터 선택된 하나 이상의 세포 유형을 포함하는 복수의 세포 유형을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 3차원 다공성 스캐폴드(예를 들면, 다공성 조직화 단백질); 근아세포, 및 지방세포, 섬유아세포, 평활근 세포, 내피 세포 및 이의 전구세포로부터 선택된 하나 이상의 세포 유형을 포함하는 복수의 세포 유형을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 키트는 식용 조성물을 제조하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 키트는 세포 배양 배지, 성장 인자, 분화 배지, 분화 유도인자로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 세포 배양 배지를 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포 배양 배지는 건조 분말 배지, 입상 제제, 수성 액체 또는 매질 농축물로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 동결된다. 일부 실시형태에서, 키트는 사용 설명서를 추가로 포함한다.
복수의 세포 유형
당해 기술분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 다수의 세포 유형 또는 세포 모집단은 3차원 다-유형 세포 조직 구조를 형성하도록 3차원 다공성 스캐폴드로 배양할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포 유형은 근아세포, ECM-분비 세포, 내피 세포로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포 유형은 근아세포의 전구세포이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포 유형은 ECM-분비 세포의 전구세포이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 세포 유형은 내피 세포의 전구세포이다.
본원에 사용된 바와 같이, 전구세포는 간엽계 줄기 세포(MSc), 배성 줄기 세포(ESc), 성체 줄기 세포, 분화된 ESc, 분화된 성체 줄기 세포 및 유도된 다능성 줄기 세포(iPSc)를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전구세포"는 복수 계통으로 분화된 세포를 생성시킬 수 있는 세포, 예컨대, 근아세포, 섬유아세포, 지방세포, 간질 세포, 섬유아세포, 주피세포, 평활근 세포 및 내피 세포를 지칭한다. "전구세포"는 이들이 전형적으로 광범위한 자기 복제 능력을 갖지 않는다는 점에서 줄기 세포와는 상이하다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 복수의 세포 유형의 세포는 전구세포이다. 일부 실시형태에서, 전구세포는 단일배양으로 배양된다. 일부 실시형태에서, 전구세포는 단일배양으로 분화된다. 일부 실시형태에서, 전구세포는 단일배양으로 분화되고, 이어서 본 발명의 방법에 따라 복수의 세포로 3차원 다공성 스캐폴드 상에서 인큐베이팅된다. 비-제한적 예는 간엽계 줄기 세포를 근아세포로 배양 및 분화시킨 후, 파종하고, 이어서 분화된 근아세포를 3차원 다공성 스캐폴드 상에서 인큐베이팅하는 것을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 전구세포를 배양하고 성숙 세포로의 분화를 유도하는 방법은 당해 기술분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 근아세포 및 섬유아세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 근아세포, 섬유아세포 및/또는 섬유아세포 전구세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 근아세포, 섬유아세포 및 지방세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 근아세포, 섬유아세포, 지방세포 및/또는 섬유아세포 전구세포 및/또는 지방세포 전구세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 근아세포, 섬유아세포 및 내피 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 근아세포, 섬유아세포 및 내피 세포, 및/또는 섬유아세포 전구세포, 및/또는 내피 전구세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 근아세포 및 평활근 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 근아세포, 평활근 세포 및 내피 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 근아세포, 평활근 세포, 내피 세포 및 지방세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 근아세포, 섬유아세포, 내피 세포 및 지방세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 근아세포, 섬유아세포, 내피 세포, 지방세포 및/또는 섬유아세포 전구세포, 및/또는 지방세포 전구세포, 및/또는 내피 전구세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 살아있는 동물로부터 수득하고, 일차 세포주로서 배양한다. 비-제한적 예로서, 세포는 생검에 의해 수득하고 생체외에서 배양할 수 있다. 또 다른 비-제한적 예로서, 세포는 상업용 공급원으로부터 수득할 수 있다.
일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 줄기 세포, 예컨대, 다능성 배성 줄기 세포로부터 유래한다. 또 다른 실시형태에서, 간엽계 줄기 세포(MSC)가 사용된다. 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이, MSC는 근육 세포, 지방 세포, 골 세포 및 연골 세포를 생성할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 유도된 다능성 줄기 세포(iPS 또는 iPSC)이다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 전능성 배성 줄기 세포, 예컨대, 이들 동물의 배반포 단계, 수정란, 태반 또는 제대로부터의 세포로부터 유래한다.
일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 비-인간 세포로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은, 포유동물, 조류, 어류, 무척추동물, 파충류, 양서류 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 비-인간 세포로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 포유동물로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 비-인간 포유동물로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 가축 포유동물로부터 유래한다. 본원에 사용된 바와 같이, "가축"은 임의의 가축 포유동물, 반-가축 포유동물 또는 포획 야생 포유동물을 포함한다. 비-인간 포유동물의 비-제한적 예는 영양, 곰, 비버, 들소, 멧돼지, 낙타, 순록, 소, 사슴, 코끼리, 엘크, 여우, 기린, 염소, 토끼, 말, 아이벡스, 캥거루, 사자, 라마, 무스, 페커리, 돼지, 래빗, 물개, 양, 다람쥐, 호랑이, 고래, 야크 및 얼룩말, 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 조류 세포로부터 유래한다. 조류의 비-제한적 예는 닭, 오리, 에무, 거위, 그라우스, 타조, 꿩, 비둘기, 메추라기 및 칠면조, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 어류로부터 유래한다. 어류의 비-제한적 예는 배스, 메기, 잉어, 대구, 뱀장어, 도다리, 복어, 그루퍼, 대구, 핼리벗, 청어, 고등어, 마히, 말린, 오렌지 러프, 퍼치, 파이크, 폴락, 연어, 정어리, 상어, 도미, 서대기, 황새치, 틸라피아, 송어, 참치 및 월아이, 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 무척추동물로부터 유래한다. 무척추동물의 비-제한적 예는 랍스터, 게, 새우, 조개, 굴, 홍합 및 성게를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 파충류로부터 유래한다. 파충류의 비-제한적 예는 뱀, 악어 및 거북이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포 유형은 양서류로부터 유래한다. 양서류의 비-제한적 예는 개구리를 포함한다.
세포의 파종 및 배양
당해 기술분야의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 본원에 기재된 조성물 및 방법에 사용된 세포의 각 유형은 바람직한 또는 최적 범위의 세포 밀도를 갖고, 세포의 생존능에 적합한 배지 또는 성장 인자를 선호할 수 있다. 일부 실시형태에서, 각 세포 유형은 특정한 세포 밀도로 파종된다. 일부 실시형태에서, 세포는 동시에 또는 연속적 방식으로 파종된다.
일부 실시형태에서, 근아세포는 10mg의 다공성 조직화 단백질에 대해 103 내지 107 세포의 세포 밀도로 파종된다. 일부 실시형태에서, 상이한 세포 유형은 특정한 비율로 파종된다. 일부 실시형태에서, 파종된 근아세포 대 파종된 섬유아세포의 비율은 1:1,000 내지 1,000:1의 범위이다. 일부 실시형태에서, 파종된 근아세포 및 파종된 섬유아세포 대 파종된 내피 세포의 비율은 1:20 내지 20:1의 범위이다. 일부 실시형태에서, 파종된 근아세포 및 파종된 섬유아세포 대 파종된 지방세포의 비율은 1:5000 내지 5000:1의 범위이다. 일부 실시형태에서, 파종된 위성 세포 대 파종된 평활근 세포의 비율은 5:1 내지 1:5의 범위이다. 일부 실시형태에서, 파종된 위성 세포 대 파종된 골격 미소혈관 내피 세포의 비율은 10:1 내지 1:10의 범위이다. 일부 실시형태에서, 파종된 평활근 세포 대 파종된 골격 미소혈관 내피 세포의 비율은 10:1 내지 1:10의 범위이다. 일부 실시형태에서, 파종된 위성 세포 대 파종된 평활근 세포 대 파종된 골격 미소혈관 내피 세포의 비율은 10:1:1 내지 2:1:10의 범위이다. 한 가지 실시형태에서, 파종된 위성 세포 대 파종된 평활근 세포 대 파종된 골격 미소혈관 내피 세포의 비율은 2:1:1 내지 2:1:5, 또는 이들 사이의 임의 비율의 범위이다. 한 가지 실시형태에서, 파종된 위성 세포 대 파종된 평활근 세포 대 파종된 골격 미소혈관 내피 세포의 비율은 2:1:1 내지 2:1:2, 또는 이들 사이의 임의 비율의 범위이다. 한 가지 실시형태에서, 파종된 위성 세포 대 파종된 평활근 세포 대 파종된 골격 미소혈관 내피 세포의 비율은 2:1:1 내지 2:1:3, 또는 이들 사이의 임의 비율의 범위이다. 한 가지 실시형태에서, 파종된 위성 세포 대 파종된 평활근 세포 대 파종된 골격 미소혈관 내피 세포의 비율은 2:1:1 내지 2:1:4, 또는 이들 사이의 임의 비율의 범위이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 파종된 세포 밀도 및 배양된 세포 밀도는 비교적 동등하다.
한 가지 실시형태에서, "커버리지 %"는, 세포 또는 근관과 접촉하는 다공성 스캐폴드의 면적 또는 용적을 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, 커버리지 %는 세포 또는 근관에 의해 점유되는 다공성 스캐폴드의 면적 또는 용적을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 스캐폴드와 접촉하는 세포는 그 위, 내부 또는 이의 조합으로 존재한다.
일부 실시형태에서, 복수의 세포의 커버리지 %는 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90 또는 적어도 99%이다. 일부 실시형태에서, 복수의 세포의 커버리지 %는 5 내지 20%, 15 내지 30%, 25 내지 40%, 35 내지 50%, 45 내지 60%, 55 내지 70%, 65 내지 80%, 75 내지 90%, 85 내지 100%, 또는 이들 사이의 임의의 범위이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 위성 세포의 커버리지 %는 적어도 35%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90 또는 적어도 99%이다. 일부 실시형태에서, 위성 세포의 커버리지 %는 25 내지 40%, 35 내지 50%, 45 내지 60%, 55 내지 70%, 65 내지 80%, 75 내지 90%, 85 내지 100%, 또는 이들 사이의 임의의 범위이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 내피 세포의 커버리지 %는 최대 2%, 최대 5%, 최대 10%, 최대 15%, 최대 20%, 최대 25%, 최대 30%, 최대 35%, 최대 40%, 최대 45%, 또는 최대 50%이다. 일부 실시형태에서, 내피 세포의 커버리지 %는 5 내지 15%, 10 내지 25%, 20 내지 35%, 30 내지 50%, 또는 이들 사이의 임의의 범위이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 내피 세포는 근아세포 또는 이의 전구세포의 증식을 증가시키기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 내피 세포는 근아세포 또는 이의 전구세포의 근관으로의 분화를 억제한다. 일부 실시형태에서, 내피 세포는 근아세포 또는 이의 전구세포의 성장 및 증식을 지지한다. 일부 실시형태에서, 내피 세포는 근아세포 또는 이의 전구세포의 분화에 필요하지 않다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라, 내피 세포 활성(예컨대, 근아세포 성장, 생존, 또는 둘 모두를 지지하는, 근원성제(myogenic agent)의 분비)은 정의된 기간 동안 유지된다. 일부 실시형태에서, 내피 활성의 정의된 기간은 근아세포 또는 이의 전구세포가 3차원 다공성 스캐폴드의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 99%의 커버리지에 도달하는데 필요한 기간이다. 일부 실시형태에서, 내피 세포 활성의 정의된 기간은 근아세포 또는 이의 전구세포가 적어도 30%의 커버리지에 도달하는데 필요한 기간이다.
일부 실시형태에서, 근관의 커버리지 %는 적어도 5%, 적어도 20%, 적어도 35%, 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 90%, 또는 적어도 99%이다. 일부 실시형태에서, 근관의 커버리지 %는 1 내지 10%, 5 내지 20%, 15 내지 35%, 30 내지 50%, 40 내지 65%, 60 내지 85%, 80 내지 90%, 90 내지 100%, 또는 이들 사이의 임의의 범위이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물의 근관은 3차원 다공성 스캐폴드의 mm3당 10,000 내지 100,000 핵, 3차원 다공성 스캐폴드의 mm3당 10,000 내지 100,000 핵, 3차원 다공성 스캐폴드의 mm3당 15,000 내지 200,000 핵, 3차원 다공성 스캐폴드의 mm3당 50,000 내지 500,000 핵, 3차원 다공성 스캐폴드의 mm3당 5,000 내지 1,000,000 핵, 3차원 다공성 스캐폴드의 mm3당 100,000 내지 250,000 핵, 3차원 다공성 스캐폴드의 mm3당 10,000 내지 1,500,000 핵, 또는 이들 사이의 임의의 범위이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다.
당해 기술분야의 숙련가에게 명백한 바와 같이, ECM은 근관으로의 근아세포 분화에 영향을 미친다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 이용된 ECM-분비 세포는 근아세포 분화를 개선시킨다. 일부 실시형태에서, ECM-분비 세포는 조직 물리적 특성을 자극시킴으로써 근아세포 분화를 개선시켰다.
본원에 정의된 바와 같이, 용어 "개선된" 및 "증가된"은 교환가능하다.
일부 실시형태에서, 개선된은 적어도 5%, 적어도 20%, 적어도 35%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 250%, 적어도 500%, 적어도 750%, 적어도 1,000%, 적어도 2,500%, 또는 적어도 5,000%이다. 일부 실시형태에서, 개선된은 5 내지 15%, 10 내지 35%, 25 내지 45%, 40 내지 70%, 65 내지 90%, 85 내지 150%, 100 내지 500% 또는 250 내지 1,000%이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다.
조직 물리적 특성의 비-제한적 예는 강성, 다공성, 유연성, 강직성 등을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 조직은 이의 영 모듈러스, 점도 모듈러스 또는 기타 파라미터에 따라 물리적으로 정의할 수 있고, 이들 모두는 당해 기술분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 다공성 조직화 단백질을 멸균시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 다공성 조직화 단백질은 복수의 세포 유형의 파종 또는 인큐베이팅 전에 멸균시킨다. 일부 실시형태에서, 멸균은 감마선에 의한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 멸균은 에탄올-기반 멸균이다. 멸균 절차는 당해 기술분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
당해 기술분야의 숙련가는 세포의 파종 및/또는 배양이 세포 배양 배지의 존재하에 수행되는 것을 이해할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 세포 배양 배지는 성장 인자, 사이토킨, 생물활성제, 영양소, 아미노산, 항생물질 화합물, 항-염증 화합물 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 세포의 생존력 및 성장에 적합한 배지 및 적합한 화합물은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 성장 인자는 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF-1)를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. PDGF 및 IGF-1은 세포분열촉진, 주화성 및 증식(분화) 세포 반응을 자극하는 것으로 공지되어 있다. 성장 인자는 하기 중의 하나 이상일 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다: PDGF, 예를 들면, PDGF AA, PDGF BB; IGF, 예를 들면, IGF-I, IGF-II; 섬유아세포 성장 인자(FGF), 예를 들면, 산성 FGF, 염기성 FGF, β-내피 세포 성장 인자, FGF 4, FGF 5, FGF 6, FGF 7, FGF 8 및 FGF 9; 형질전환 성장 인자(TGF), 예를 들면, TGF-P1, TGF β1.2, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β5; 골 형성 단백질(BMP), 예를 들면, BMP 1, BMP 2, BMP 3, BMP 4; 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 예를 들면, VEGF, 태반 성장 인자; 표피 성장 인자(EGF), 예를 들면, EGF, 암피레귤린, 베타셀룰린, 헤파린 결합 EGF; 인터류킨, 예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14; 콜로니 자극 인자(CSF), 예를 들면, CSF-G, CSF-GM, CSF-M; 신경 성장 인자(NGF); 줄기 세포 인자; 간세포 성장 인자, 및 모양체 신경영양 인자를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
하기 예시된 바와 같이, 소-유래된 세포의 경우에, 최적화 위성 세포(SC) 확장 배지(즉, Pro-LIF 배지)는 소 SC(BSC) 성장 배지(99%), 암포테리신 B(AB/AM; 1% 1×), ZnCl2(50μM), EGF(62ng/ml), IGF-1(100ng/ml) 및 bFGF(10ng/ml)를 포함한다.
하기 예시된 바와 같이, 소-유래된 세포의 경우에, 최적화 SC 성장 배지는 DMEM/HEPES(43.5%), 햄스 F-10 영양 믹스(43.5%), 태소 혈청(10%), MEM NEAA(1% 1×), GlutaMAX(1%) 및 AB/AM(1% 1×)을 포함한다.
하기 예시된 바와 같이, 소-유래된 세포의 경우에, 최적화 SC 분화 배지는 DMEM/HEPES(97%), 공여체 말 혈청(2%), AB/AM(1% 1×), IGF-1(100ng/ml) 및 EGF(62ng/ml)를 포함한다.
다공성 스캐폴드
일부 실시형태에서, 본 발명의 복수의 세포는 다공성 스캐폴드로 인큐베이팅된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "스캐폴드"는 세포의 점착/부착, 성숙, 분화 및 증식에 적합한 표면을 제공하는 재료를 포함하는 구조를 지칭한다. 스캐폴드는 기계적 안정성 및 지지를 추가로 제공할 수 있다. 스캐폴드는, 증식 세포의 모집단에 의해 상정되는 3차원 형상 또는 형태에 영향을 미치거나 범위를 정하도록 특정 형상 또는 형태로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 다공성 스캐폴드는 3차원이다.
일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드의 평균 세공 직경은 20㎛(㎛) 내지 1000㎛, 20㎛ 내지 900㎛, 20㎛ 내지 800㎛, 20㎛ 내지 700㎛, 20㎛ 내지 600㎛, 20㎛ 내지 500㎛, 20㎛ 내지 400㎛, 20㎛ 내지 300㎛, 20㎛ 내지 200㎛, 20㎛ 내지 100㎛, 50㎛ 내지 1000㎛, 50㎛ 내지 900㎛, 50㎛ 내지 800㎛, 50㎛ 내지 700㎛, 50㎛ 내지 600㎛, 50㎛ 내지 500㎛, 50㎛ 내지 400㎛, 50㎛ 내지 300㎛, 50㎛ 내지 200㎛, 50㎛ 내지 100㎛, 100㎛ 내지 1000㎛, 100㎛ 내지 900㎛, 100㎛ 내지 800㎛, 100㎛ 내지 700㎛, 100㎛ 내지 600㎛, 100㎛ 내지 500㎛, 100㎛ 내지 400㎛, 100㎛ 내지 300㎛, 100㎛ 내지 200㎛, 500㎛ 내지 1000㎛, 500㎛ 내지 900㎛, 500㎛ 내지 800㎛, 500㎛ 내지 700㎛ 또는 500㎛ 내지 600㎛의 범위이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 실시형태를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드의 평균 세공 직경은 20㎛ 내지 1000㎛의 범위이다.
일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드는 식용이다. 일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드는 조직화 단백질이다. 일부 실시형태에서, 다공성 스캐폴드는 다당류를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조직화 단백질은 조직화 식물성 단백질이다. 일부 실시형태에서, 조직화 단백질은 조직화 대두 단백질(예를 들면, TSP)이다.
용어 "조직화"는, 다양한 크기, 형상 및 구성으로 용이하게 형성될 수 있고 물에 비-분산성인 개개 세포의 경질 매쓰 또는 유연한 매쓰를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
본원에서 사용하기 위한 적합한 입상 조직화 단백질 재료는, 건조 중량 기준으로, 30% 내지 100% 단백질, 및 단백질 공급원 재료 또는 첨가된 애주번트 재료와 관련된 0% 내지 70% 재료로 구성될 수 있다. 애주번트 재료의 예는 탄수화물, 비타민, 향료, 착색제 등이다. 일부 실시형태에서, 단백질 입자는 건조 중량으로 50% 내지 100% 단백질 또는 50% 내지 80% 단백질로 이루어진다.
조직화 입상 단백질 재료를 형성하기 위해 조직화할 수 있는 적합한 비-조직화 단백질은 다양한 공급원으로부터 이용가능하다. 비-제한적 예로서, 이러한 단백질의 공급원은 식물성 단백질 및 특정 진균 단백질이지만, 동물 단백질이 이용될 수 있다. 적합한 동물 단백질의 예는 카세인, 콜라겐 및 난백이다. 적합한 식물성 단백질 공급원의 예는 대두, 홍화씨, 옥수수, 땅콩, 밀, 밀 글루텐, 완두, 해바라기씨, 병아리콩, 면화씨, 코코넛, 유채, 참깨, 잎 단백질, 글루텐, 단세포 단백질, 예컨대, 효모 등이다.
적합한 단백질 공급원의 또 다른 예는 버섯이다. 일부 실시형태에서, 버섯 단백질 공급원은 건조 중량으로 15 내지 20%(w/w), 20 내지 30%(w/w), 28 내지 45%(w/w) 또는 10 내지 40%(w/w)의 단백질 양을 포함한다.
일반적으로, 단백질 공급원이 식물성 단백질인 경우, 사용 전의 단백질은 비교적 순수한 형태로 배치된다. 따라서, 예를 들면, 단백질 공급원이 대두인 경우, 대두는, 예를 들면, 헥산으로 용매 추출하여, 이로부터 오일을 제거할 수 있다. 수득되는 오일-비함유 대두 밀은 약 50% 단백질을 함유한다.
대두 밀은 공지된 방식으로 처리하여 탄수화물을 제거하고 보다 높은 수준의 단백질, 예를 들면, 약 70% 단백질을 함유하는 대두 단백질 농축물 또는 약 90% 이상의 단백질을 함유하는 대두 단백질 분리물을 수득할 수 있다. 이어서, 다양한 적합한 종래 기술의 프로세스를 사용하여 대두 밀, 농축물, 분리물 및 기타 식용 단백질 함유 재료를 적합한 조직화 입자상 단백질 재료로 전환시킬 수 있다.
비-조직화 동물 및 식물 단백질 함유 재료를 입자상 조직화 단백질로 전환시키는데 적합한 방법은, 예를 들면, 하기 미국 특허 제2,682,466호(보이어(Boyer)에게 1954년 6월 29일자로 허여); 제3,142,571호(키스첼(Kitchel)에게 1964년 7월 28일자로 허여); 제3,488,770호(아트킨슨(Atkinson)에게 1970년 1월 6일자로 허여); 제3,498,794호(칼버트 등(Calvert et al)에게 1970년 3월 3일자로 허여); 제3,759,715호(로에픽티에 등(Loepiktie et al.)에게 1973년 9월 18일자로 허여); 제3,778,522호(스트로머(Strommer)에게 1973년 12월 11일자로 허여); 제3,794,731호(단너트 등(Dannert et al.)에게 1974년 2월 26일자로 허여); 제3,814,823호(양 등(Yang et al.)에게 1974년 6월 4일자로 허여); 및 공동 양도된 미국 특허 출원번호 제248,581호(1972년 4월 28일자로 출원), 현재 미국 특허 제3,840,679호(리에파 등(Liepa et al.)에게 1974년 10월 8일자로 허여)에 개시되어 있고; 이들 모든 특허는 본원에서 참조로 편입된다.
또 다른 실시형태에서, 다공성 조직화 단백질은, 섭취가능한 식용 및 씹을 수 있는 다른 다공성 조성물로 치환될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "섭취가능한" 및 "식용"은 체내로 안전하게 섭취할 수 있는 조성물을 지칭한다. 이들 조성물은 흡수되는 것, 흡수되지 않는 것, 또한 소화가능한 및 소화불가능한 것들을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "씹을 수 있는"은 삼키기 전에 씹음으로써 보다 작은 절편으로 분쇄/파쇄될 수 있는 조성물을 지칭한다. 당해 기술분야의 숙련가는 목적하는 용도(예를 들면, 인간 성인에 의한 소비)에 대한 물리적 특성(예를 들면, 영 모듈러스, 점도 모듈러스, 강성 등)에 따라 적합한 식용 조성물을 선택할 수 있음을 이해한다.
본 발명의 방법에 따르면, 복수의 세포 유형은 3차원 다공성 스캐폴드 자체에 파종된다. 일부 실시형태에서, 3차원 다공성 스캐폴드에 파종된 복수의 세포 유형은 응고제를 필요로 하지 않는다. 일부 실시형태에서, 3차원 다공성 스캐폴드에 파종된 복수의 세포 유형은 응고제를 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 응고제는 3차원 다공성 스캐폴드에 대한 복수의 세포 유형의 점착 또는 부착을 증가시킨다. 응고제의 비제한적 예는 트롬빈 또는 피브린을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "겔화제" 및 "응고제"는 교환가능하다.
논의에서, 달리 언급하지 않는 한, 형용사, 예컨대, 본 발명의 실시형태의 특징 또는 특징들의 상태 또는 관계 특성을 변경하는 "실질적으로" 및 "약"은 그것이 의도되는 응용을 위해 실시형태의 작동에 허용되는 용인 범위 내로 정의되는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 달리 명시하지 않는 한, 명세서 및 특허청구범위에서 어구 "또는"은, 배타적이 아닌 포괄적 "또는"인 것으로 간주되며, 이것이 결합하는 항목의 적어도 하나 또는 임의의 조합을 나타낸다.
상기 및 본원의 다른 곳에서 사용된 용어 단수 표현("a" 및 "an")은 열거된 성분의 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 달리 명시하지 않는 한, 단수형의 사용이 복수형을 포함한다는 것은 당해 기술분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 따라서, 용어 단수 표현("a", "an") 및 "적어도 하나"는 본 출원에서 호환가능하게 사용된다.
본 교시의 범위를 한정하지 않고서 본 교시의 보다 양호한 이해를 목적으로, 달리 명시하지 않는 한, 양, 퍼센트 또는 비율, 및 명세서 및 특허청구범위에 사용된 기타 수치 값을 나타내는 모든 수치는, 모든 경우에 용어 "약"으로 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 지시되지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부 특허청구범위에 기재된 수치 파라미터는 수득되어야 하는 목적하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 적어도, 보고된 유효 숫자의 수치를 고려하고 통상의 반올림 기술을 적용하여 각 수치 파라미터를 적어도 해석할 필요가 있다.
본 출원의 설명 및 특허청구범위에서, 각각의 동사, "포함하다(comprise)", "포함하다(include)", "갖다(have)" 및 그 접합체는 그 동사의 목적 또는 목적들이 반드시는 아니지만 그 동사의 대상체 또는 대상체들의 성분, 요소 또는 부분의 완전한 리스트인 것을 나타내기 위해 사용된다.
본원에 사용된 다른 용어들은 당해 기술분야에서 보다 양호하게 공지된 의미에 의해 정의되는 것을 의미한다.
본 발명의 추가의 목적, 이점 및 신규한 특징은, 통상, 한정하는 것을 의도하지 않는 하기 실시예를 고찰하면, 당해 기술분야의 숙련가에게 명백해질 것이다. 추가로, 본 명세서중 상기에 서술되고 하기 특허청구범위 부분에서 청구되는 본 발명의 다양한 실시형태 및 양태의 각각은 하기 실시예에서 실험적 지지를 발견한다.
명확하게 하기 위해, 별개의 실시형태의 문맥에서 설명되는 본 발명의 특정 특징은 또한 단일 실시형태에서 조합하여 제공될 수 있는 것으로 이해된다. 역으로, 요약을 위해, 단일 실시형태의 문맥에서 기재되는 본 발명의 다양한 특징은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 부분-조합으로 또는 본 발명의 임의의 기재된 실시형태에 적합한 것으로 제공될 수 있다. 다양한 실시형태의 문맥에서 기재된 특정한 특징은, 그 실시형태가 이들 요소 없이 작동불능하지 않는 한, 이들 실시형태의 본질적 특징으로 간주되지 않는다.
실시예
일반적으로, 본원에 사용된 명명법, 및 본 발명에 이용된 실험 절차는 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에 상세하게 설명되어 있다[참조: 예를 들면, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologies as set forth in U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); "Bacteriophage Methods and Protocols", Volume 1: Isolation, Characterization, and Interactions, 이들 모두는 참조로서 편입된다.]. 다른 일반적 참조는 이 문헌 전체에 걸쳐 제공된다.
재료 및 방법
조직화 대두 단백질
조직화 대두 단백질(TSP)은 몇몇 상이한 제품으로서 시판되고 있다. TSP 스캐폴드는, 상업용 TSP의 5개의 상이한 공급원 - 지역 건강 식품점에서 구입한 3개의 TSP 청크(도 1a) 및 ADM으로부터 구입한 2개의 TSP 플레이크(도 1b-1c)로부터 제조했다. TSP는 3.5시간 동안 25 내지 40 kGy의 감마선으로 멸균시키고, 멸균 환경에서 또는 15분 동안 70%(v/v) 에탄올을 사용하여 유지했다. 이어서, PBS로 3회 세정을 수행했다.
TSP 스캐폴드 제조물
TSP 플레이크(아콘 또는 TVP)는 약 200 내지 400㎛(1층당)의 유사한 두께를 갖도록 그라에페 집게(Graefe Forceps)를 사용하여 선택했다. 플레이크를 37℃에서 밤새(50ml 팔콘에서) 5 내지 10ml의 멸균 DDW에서 인큐베이팅했다. 다음 날, 플레이크는 비-TC 10cm 플레이트 상의 후드 내부에 6mm 생검 펀치를 사용하여 6mm 스캐폴드로 절단했다. 파스퇴르 피펫을 사용하여, 스캐폴드를 생검 펀치로부터 제거하고, 5ml 성장 배지를 갖는 팔콘에 옮겼다. TSP 청크를 37℃로 밤새 DDW에서 인큐베이팅했다. 이어서, 청크는 생검 펀치를 사용하여 실리더로 절단하고(도 2a의 삽입도), 나이프를 사용하여 1mm 두께 디스크로 절단했다(도 2a). 이어서, 스캐폴드를 5ml 성장 배지에 배치했다.
스캐폴드 파종
단일 스캐폴드당, 2×106 BSC를 에펜도르프로 옮기고, 4분 동안 1,500rcf에서 원심분리했다. 반면, 각각의 스캐폴드는 성장 배지를 갖는 50㎕의 비-TC 6-웰 플레이트의 웰에 넣었다. 원심분리 후, 배지를 에펜도르프 튜브로부터 흡인하여 세포 펠렛을 잔류시켰다. 이어서, 각각의 에펜도르프당 하기 단계를 수행했다: (1) 배지는 집게를 사용하여 스캐폴드로부터 철저히 흡인하여 스캐폴드를 온화하게 압착시키고, 배지 잔류물을 진공시켰고; (2) 7㎕의 트롬빈(PBS 중의 20MHU/ml 시그마) 및 7㎕의 피브리노겐(PBS 중의 15mg/ml 시그마)을 첨가하고; (3) 이어서 세포를 스캐폴드에 파종하고; (4) 스캐폴드를 건조될 때까지 37℃에서 30분 동안 인큐베이팅한 다음, 웰에 2ml의 확장 배지를 첨가하고; (5) 건조시킨 후, 스캐폴드는 멸균 그라에페 집게를 사용하여 새로운 용기(예를 들면, 커버슬립 하부를 갖는 24 비-TC 웰)로 옮기고, 2ml의 확장 배지를 첨가하고; (6) 스캐폴드를 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이팅하고; (7) 스캐폴드를 7일 동안 확장 배지에 유지시키고; (8) 배지를 2일마다 회수하고(2ml); (9) 7일 후, 확장 배지를 BSC 분화 배지로 교환하고; (10) 분화 배지를 5일의 기간 동안 2일마다 교환했다.
세포 배양
소 위성 세포(BSC)를 50μM ZnCl2(Millipore), 62ng/ml EGF(R&D Systems), 100ng/ml IGF-1(R&D Systems), 10ng/ml LIF(R&D Systems) 및 10ng/ml bFGF(R&D Systems)이 보충된 43.5% DMEM/HEPES(Gibco), 43.5% F-10 Nut Mix(Gibco), 10% FBS(HyClone), 1% NEAA(Gibco), 1% GlutaMAX(Gibco) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B 용액(Biological Industries (Ab/Am, BI))의 BSC 증식 배지에서 배양했다. BSC 분화 배지는 2% FBS 및 1% Ab/Am이 보충된 DMEM/HEPES로 구성되었다. 피부 섬유아세포(Lonza, USA)를 발현하는 적색 형광 단백질(RFP)을 10% FBS(HyClone; Thermo Fisher Scientific), 1% 비필수 아미노산(Biological Industries), 0.2% β-머캅토에탄올(Biological Industries) 및 100단위/ml 페니실린 및 0.1mg/ml 스트렙토마이신(Pen-Strep Solution, Biological Industries, Israel)이 보충된 둘베코 최소 필수 배지(DMEM; Gibco Life Technologies)에서 배양했다. 근아세포(American Type Culture Collection)는 10% FBS, 2.5% HEPES 완충액(Biological Industries) 및 1% Pen-strep 용액이 보충된 DMEM에서 배양했다. 근아세포 분화 배지는 2% FBS, 2.5% HEPES 완충액 및 1% Pen-strep 용액이 보충된 DMEM으로 구성된다. 모든 인큐베이션은 37℃에서 5%(v/v) CO2 가습 분위기하에 수행한다. 소 평활근 세포(SMC; CellAplications)는 표 3에 기재된 바와 같이 배양했다. 소 대동맥 내피 세포(BAEC; CellApplications)는 상업용 배지(CellApplications)에서 배양했다. 소 골격근 미소혈관 EC(BSkMVEC; AngioProteomie)는 10% 전체 FBS를 갖는 ECM 상업용 배지(ScienCell)에서 배양했다. 소 피부 섬유아세포(BDF; Sciencell)는 상업용 배지(FM-2; ScienCell) 또는 15% FBS가 보충된 DMEM 고글루코즈 배지에서 배양했다.
면역조직화학
스캐폴드를 PBS에서 2회 세정한 다음, 진탕기 상에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)에서 고정시킨다. 스캐폴드를 진탕기 상에서 PBS로 2회 세척하고, 이어서 10분 동안 0.3% 트리톤 X-100(Bio Lab Ltd)로 투과처리했다. 이어서, 스캐폴드를 5분 동안 PBS로 2회 세척한 다음, 4℃에서 밤새 PBS 중의 5% 소 혈청 알부민(BSA; Millipore)에 침적시켰다. 스캐폴드를 실온에서 3시간 동안 250㎕ 일차 항체(PBS 중의 5% BSA에서)로 인큐베이팅한다. 인큐베이션 후, 스캐폴드를 5분 동안 PBS로 4회 세척한다. 이어서, 세포를 진탕기 상에서 주석 박으로 피복된 플레이트에서 3시간 동안 실온에서 이차 항체(PBS 중) 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, PBS 중의 1:1000, Vector Laboratories)로 인큐베이팅한다. 스캐폴드를 진탕기 상에서 5분 동안 PBS로 세척하고, 공초점 현미경(LSM 700, Zeiss)으로 이미지화한다.
소 대동맥 평활근 세포 (BAMSC)
4개의 상이한 배지 제형의 세포 증식에 대한 효과를 상업용 배지(BSM)과 비교했다(표 3). 실험의 개시시에, 세포는 계대 8이었고, 6-웰 플레이트에서 4,000 세포/cm2으로 파종했다. 3일에서, 세포를 트립신처리하고, 혈구계수기로 계수하고, 4,000 세포/cm2으로 재파종했다. 실험은 각 조건에 대해 동일한 세포를 사용하여 2회 수행했다. 일원 분산분석(One-way ANOVA)을 사용하여 통계적 유의성을 시험했다.
세포 성장 동태
대략 4×103 세포/cm2을 파종하고, 6일에 걸쳐 혈구계수기로 매일 계수했다. 계수된 값을 플롯팅했다.
세포 염색
지지 세포(BDF 또는 BASMC)는 15㎕의 친유성-트레이서 DiD(무수 에탄올에서 희석시킨 1mg/ml; #D7757, Molecular Probes®, USA)를 갖는 3ml 신선한 배지로 염색시켰다. 소 내피 세포(BEC; BAEC 또는 BSkMVEC)는 5㎕의 친유성-트레이서 DiI(무수 에탄올에서 희석시킨 3mg/ml; #D, Molecular Probes®, USA)를 갖는 3ml 신선한 배지로 염색시키고, 30분 동안 37℃에서 인큐베이팅했다. 배지로 1회 세척한 다음, PBS로 2회 더 세척한 후, 세포를 트립신처리하고, 하기 기재된 바와 같이 파종을 준비했다.
다공성 스캐폴드로의 세포 파종
소 EC(1.25×105) 및 지지 세포(0.25×105)를 15mg/ml 피브리노겐(Sigma Aldrich) 및 20NIHu/ml 트롬빈(Sigma Aldrich)의 1:1 혼합물 5㎕에 재현탁시켰다. 피브리노겐 용액은 동결건조된 인간 피브리노겐(Sigma Chemical)을 40mM 글리신-트리스 완충액에서 희석시켜 제조했다. 트롬빈 용액은 트롬빈(Sigma Aldrich)을 40mM 염화칼슘에서 희석시켜 제조했다. 이어서, 공-배양 현탁액을 4mm 직경의 원형 PLLA-PLGA 다공성 스캐폴드에 파종하고, 30분 동안 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에서 12-웰 비-조직 플레이트에서 고형화시켰다. 고형화 후, 추가의 5% FBS 및 2nM VEGF가 보충된 2ml의 내피 배양 배지(ECM, ScienCell)를 각 웰에 첨가했다. 배지는 하루 걸러 교환했다.
다공성 스캐폴드에 파종된 세포의 비율을 추가로 변경하기 위해, 세포를 하기 변형으로 상기 기재된 바와 같이 파종했다: 세포를 먼저 1:1 배지(bEBM, AngioProteomie: 지지 세포의 상업용 배지)에 파종하고, 세포를 15mg/ml 피브리노겐(Johnson and Johnson) 및 2U/ml 트롬빈(Johnson and Johnson)의 1:1 혼합물 5㎕에 재현탁시켰다.
2D에서 소 위성 세포(BSC) 분화
5×104 BSC(계대 4)는 삼중으로 커버슬립 하부를 갖는 TS 24-웰 플레이트에 파종했다. 세포는 다음과 같이 근관 형성 프로토콜에 따라 성장시켰다: 성장 배지에서 4일 및 분화 배지에서 7일(t=0은, 분화 배지의 사용이 개시되는 시점을 지칭한다). 이어서, 세포를 -1일 및 7일에서 훽스트(Hoechst) 및 미오게닌으로 염색했다.
2D에서 BSC 분화의 최적화
BSC(계대 4)는 상이한 GF(하기 기재된 바와 같음)을 갖는 확장 배지에서 4일 동안 성장시킨 다음, 분화 배지(DMEM-HEPES + 2% HS)에서 7일 동안 성장시켰다. 0일은 배지를 분화 배지로 교환한 일로서 정의했다.
확장 배지 제형은 하기를 포함했다: (1) 대조군 - 성장 배지(GF 첨가하지 않음); (2) 소 섬유아세포 성장 인자(bFGF; 10ng/ml); (3) 표피 성장 인자(EGF; 62ng/ml); (3) 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF-1; 100ng/ml); (4) Pro-LIF; bFGF 10ng/ml, EGF 62ng/ml, IGF-1 100ng/ml 및 ZnCl2 50μM); (6) GF 위닝: 3일 동안 Pro-LIF 배지, 이어서 성장 배지로 3회 세척(5분 마다), 이어서 1일 성장 배지; (7) 세포를 성장 배지에서 성장시킨 DiI로 염색시켰다 - DiI, 세포를 추적하기 위해 첨가된 형광 색이 세포 분화에 영향을 미치는지를 체크하기 위해.
본 발명자들은 분화기 동안 GF: IGF-1, EGF 및 이들의 조합의 효과를 추가로 체크했다. BSC(계대 4)를 성장 배지에서 4일 동안 성장시키고, 이어서 상이한 GF를 갖는 분화 배지에서 7일 동안 성장시켰다(하기 기재된 바와 같음). 분화 배지 제형은 하기를 포함했다: (1) 대조군 - 본래의 분화 배지(DMEM-HEPES + 2% HS); (2) IGF-1(100ng/ml); (3) EGF(62ng/ml); 및 (4) IGF-1(100ng/ml) + EGF(62ng/ml). 상기 기재된 모든 경우에 대하여 명시야 현미경을 사용하여 세포를 시각화했다.
3D 스캐폴드에서 BSC 확장의 최적화
이 목적을 위해, 이중 요인 실험(파종 용적 및 확장 배지 제형)을 다음과 같이 이중으로 설정했다: (1) 파종 용적 및 세포 수: (a) 10㎕ 파종 용적 및 1×106 BSC; (b) 10㎕ 파종 용적 및 2×106 BSC; 및 (c) 20㎕ 파종 용적 및 2×106 BSC. (2) 확장 배지: (a) 성장 배지; 및 (b) Pro-LIF 배지(성장 배지 + bFGF + EGF + IGF-1 + ZnCl2). BSC(계대 4)는 DiI를 사용하여 염색시키고, 이어서 아콘 파종 프로토콜에 따라 다공성 스캐폴드(아콘)에 파종했다.
3D 스캐폴드에서 BSC 분화의 최적화
이 목적을 위해, 이중 요인 실험(제1 주에 확장 배지 및 제2 주에 분화 배지)을 다음과 같이 설정했다: (1) 확장 배지: (a) 대조군(성장 배지); (b) Pro-LIF; 및 (c) Pro-LIF-bFGF. (2) 단독 또는 다음과 같이 보충된 분화 배지: (a) 대조군(2% 말 혈청을 갖는 분화 배지); (b) + IGF-1; (c) + EGF; 및 (d) + IGF-1 + EGF. BSC(계대 4)는 DiI를 사용하여 염색시켰다. 4(4)mm 다공성 스캐폴드는 5㎕의 피브린 중의 0.5×106 BSC(계대 4)를 파종했다. 세포를 파종후 2일, 7일 및 14일에서 이미지화했다. 이어서, 스캐폴드를 데스민으로 염색시켰다. 염색은 일차 폴리클로날 항체 1:100 염소 α 데스민(Santa Cruz Cat. No. sc-7559) 및 이차 항체 알렉사 1:200 488 당나귀 α 염소(Invitrogen Cat. No. A11055)로 전체 마운트 염색 프로토콜에 따라 수행했다.
파종전 소 위성 세포(BSC)의 염색
BSC는 5㎕의 친유성-트레이서 DiI(무수 에탄올에서 희석시킨 3mg/ml, Molecular Probes®, USA)를 갖는 1ml 신선한 배지로 염색하고, 30분 동안 37℃에서 인큐베이팅했다. 배지로 1회 세척 및 이어서 PBS로 2회 세척한 후, 세포를 트립신처리하고, 기재된 바와 같이 파종 준비를 했다.
PLLA-PLGA에 세포 파종
소 EC(BEC)의 존재 또는 부재하 및 지지 세포의 존재 또는 부재하의 소 위성 세포(BSC)를 15mg/ml 피브리노겐(Sigma Aldrich) 및 20NIHU/ml 트롬빈(Sigma Aldrich)의 1:1 혼합물 6㎕에 재현탁시켰다. 피브리노겐 용액은 동결건조된 인간 피브리노겐(Sigma Chemical)을 40mM 글리신-트리스 완충액에서 희석시켜 제조했다. 트롬빈 용액은 트롬빈(Sigma Aldrich)을 40mM 염화칼슘에서 희석시켜 제조했다. 이어서, 세포의 현탁액을 4mm 직경의 원형 PLLA-PLGA 스캐폴드에 파종하고, 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 내부에서, 30분 동안 12-웰 비-조직 플레이트에서 고형화시켰다. 고형화 후, BSC 성장 배지(Pro-LIF)와 내피 배양 배지의 1:1 혼합물 1ml를 각 웰에 첨가했다. 배지는 하루 걸러 교환했다. 1주일 후, 배지를 추가의 주 동안 BSC 분화 배지(IGF-1 및 EGF가 보충됨)로 교환했다.
조직화 대두 단백질 스캐폴드에 세포 파종
소 EC의 존재 또는 부재하 및 지지 세포의 존재 또는 부재하에 소 위성 세포(BSC)를 15mg/ml 피브리노겐(Sigma Aldrich) 및 20NIHU/ml 트롬빈(Sigma Aldrich)의 1:1 혼합물 15㎕에 재현탁시켰다. 피브리노겐 용액은 동결건조된 인간 피브리노겐(Sigma Chemical)을 40mM 글리신-트리스 완충액에서 희석시켜 제조했다. 트롬빈 용액은 트롬빈(Sigma Aldrich)을 40mM 염화칼슘에서 희석시켜 제조했다. 이어서, 세포의 현탁액을 6mm 직경의 원형 조직화 대두 단백질 스캐폴드의 양면에 파종하고, 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 내부에서, 45분 동안 12-웰 비-조직 플레이트에서 고형화시켰다. 고형화 후, 내피 배양 배지와 BSC 성장 배지(Pro-LIF)의 1:1 혼합물 1ml를 각 웰에 첨가했다. 배지는 하루 걸러 교환했다. 1주일 후, 배지는 추가의 주 동안 BSC 분화 배지(IGF-1 및 EGF가 보충됨)로 교환했다.
2개 파종 비율 및 2개 유형의 내피 세포 (및 이들의 적절한 배지)는 하기 표에 기재된 바와 같이 시험했다:
PLLA＼PLGA 스캐폴드 상에 파종
배양 BSC SMC BEC 전체
삼중-배양 2:1:1 250,000 125,000 125,000 500,000
삼중-배양 2:1:5 125,000 62,500 312,500 500,000
공-배양 2:1 250,000 125,000 375,000
공-배양 2:1 250,000 125,000 375,000
2:1:1로 단일배양 대조군 250,000 　 　 250,000
공-배양 2:1 125,000 62,500 　 187,500
공-배양 2:5 125,000 312,500 437,500
2:1:5로 단일배양 대조군 125,000 　 　 125,000
조직화 대두 단백질 스캐폴드 상에 파종
배양 BSC SMC BEC 전체
삼중-배양 2:1:1 750,000 375,000 375,000 1,500,000
삼중-배양 2:1:5 375,000 187,500 937,500 1,500,000
2:1:1로 단일배양 대조군 750,000 750,000
공-배양 2:1 750,000 375,000 1,125,00
공-배양 2:1 750,000 375,000 1,125,00
2:1:5로 단일배양 대조군 375,000 375,000
공-배양 2:1 375,000 187,500 562,500
공-배양 2:5 375,000 937,500 1,312,500
겔폼에서 세포 파종
소 위성 세포(BSC)를 15㎕의 BSC 성장 배지에 재현탁시켰다. 이어서, 세포의 현탁액을 6mm 직경의 실린더 겔폼ⓒ 스캐폴드의 양면에 파종하고, 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 내부에서, 30분 동안 12-웰 비-조직 플레이트에서 고형화시켰다. 고형화 후, 1ml의 BSC 성장 배지(Pro-LIF)를 각 웰에 첨가했다. 배지는 하루 걸러 교환했다. 1주일 후, 배지는 추가의 주 동안 BSC 분화 배지(IGF-1 및 EGF가 보충됨)로 교환했다.
스캐폴드에서 세포 성장
파종후 1 및 2주에서, PLLA/PLGA 및 아콘 스캐폴드에 파종된 DiI 표지된-BSC는 세포 성장을 평가하기 위해 공초점 현미경을 사용하여 이미지화했다.
전체-마운트 면역형광 염색
파종후 2주에서, 스캐폴드를 20분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA; Electron Microscopy Sciences)로 고정시킨 다음, PBS(Gibco® Life Technologies)로 3회 세척했다. 투과처리는 스캐폴드를 15분 동안 실온(RT)에서 0.3% 트리톤 X-100(Bio Lab Ltd)에서 인큐베이팅하여 달성했다. PBS로 3회 세척한 후, 스캐폴드를 4℃에서 차단 완충액(PBS 중의, 10% FBS, 1%(w/v) 글리신 및 0.01% 트리톤)에서 밤새 인큐베이팅했다. 이어서, 스캐폴드를 밤새 4℃에서, 차단 완충액에서 희석시킨, 1:50 마우스 항-MYH(Santa Cruz)의 존재 또는 부재하에, 일차 항체: 1:50 염소-항-CD31(Santa Cruz)로 인큐베이팅했다. PBS로 수회 세척한 후, 샘플을, 실온에서 3시간 동안 1:300 알렉사 플로우르 647 항-마우스의 존재 또는 부재하에, 1:400 당나귀 항-염소 알렉사 플루오르® 488(Jackson ImmunoResearch), 1:50 알렉사 플로우르 647-접합된 마우스 항-미오게닌(Santa Cruz) 및 1:1,000 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌, Sigma-Aldrich)로 인큐베이팅했다. PBS로 수회 세척한 후, 스캐폴드는, 젠(Zen) 소프트웨어를 사용하여, Zeiss LSM700 공초점 현미경(Carl Zeiss)으로 즉시 이미지화했다. 이미지 처리 및 추가의 분석은 FIJI 소프트웨어를 사용하여 수행했다. 또한, PLLA/PLGA 스캐폴드는 파종후 1주일에 전체-마운트 면역형광-염색되었다.
동결절편화 및 트리크롬 염색
각 실험의 말기에, 스캐폴드를 4℃에서 30%(w/v) 수크로즈 용액에서 밤새 인큐베이팅했다. 이어서, 스캐폴드를 최적 절단 온도(OCT) 화합물(Tissue-Tec, USA)에 매립하고, 후속 동결절편화를 위해 동결시켰다. OCT 매립된 스캐폴드를 5 및 10㎛-두께 절편으로 동결절편화시켰다. 이어서, 5㎛-두께 절편을 트리크롬 표준 염색 프로토콜에 따라 염색했다.
실시예 1
TSP 다공성 스캐폴드의 3차원 구조 분석
TSP 스캐폴드는 주사 전자 현미경(SEM)을 사용하여 검사하여 마이크론 및 나노 스케일 둘 모두로 이들의 3차원(3D) 구조를 분석했다. 100× 이미지는 TSP가 100 내지 1,000㎛ 세공 크기를 갖는 다공성이었음을 나타냈고, 이는 세포 배양에 사용될 수 있다. 대-TSP 중의 벽은 배지 공급된 TSP와 비교하여 보다 두꺼운 것을 나타냈다(도 3a 및 3b). 대 TSP의 SEM 이미지(2×105 확대)은 TSP가 30nm 볼 형상의 단백질 클러스터로 이루어졌음을 나타냈다. 중 TSP의 분석은 이들 클러스터 사이에 보다 많은 무정형의 글루-유사 재료를 나타냈다(도 4a 및 4b).
실시예 2
다공성 스캐폴드에서 배양한 섬유아세포의 성장 및 증식
TSP 스캐폴드 상에서 섬유아세포의 부착 및 증식을 검사했다. 먼저, RFP로 표지된 50,000 피부 섬유아세포를 TSP 스캐폴드에 파종하고, 배양했다. 인큐베이션 14일 후, 피부 섬유아세포가 채워진 TSP 스캐폴드에 200,000 내피 세포를 추가로 파종하고, 추가로 7일 동안 인큐베이팅했다. 세포가 채워진 TSP의 샘플을 면역-염색하고, 섬유아세포의 파종후 8, 18 및 21일에서 공초점 현미경을 사용하여 이미지화했다. 결과는, 50,000 세포의 낮은 세포 수로 파종하는 경우에도, 섬유아세포가 증식하고 TSP 스캐폴드를 피복했음을 입증했다(도 5a). 내피 세포의 파종 후(도 5b), 내피 세포를 클러스터로 수집했다(도 5c). 이어서, 각 스캐폴드 공급원으로부터의 스캐폴드, 및 TSP의 표면 방향에 대해 90°로 절단된 스캐폴드를 검사했다. 각각의 스캐폴드에 200,000 섬유아세포를 파종하고, 14일 동안 인큐베이팅했다. 결과는 섬유아세포가 대 및 중 TSP 스캐폴드 상에서 성장 및 증식했음을 입증했다(도 6). 이들 결과는 세포가 배양 14일 후에 스캐폴드를 충전시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 3
다공성 스캐폴드에서 배양한 근아세포의 성장
근육 조직을 생성하는 적용성을 평가하기 위해, 실험을 수행하여 근육 세포가 TSP 스캐폴드에서 성장할 수 있는지를 검사했다.
이러한 목적을 위해, 0.5×106 근아세포를 TSP 스캐폴드에 파종하고, 혈청이 낮은 및 따라서 배양된 육류 생산에 보다 적합한 분화 배지의 존재하에 배양했다. 14일에서 근아세포의 이미지(도 7)는 근아세포가 TSP 스캐폴드에서 성장했음을 나타냈고, 이는 세포가 배양 14일 후에 스캐폴드를 충전시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 4
TSP에서 배양한 소 골격근 세포의 증식
인간 소비를 위한 적용성을 평가하기 위해, 소 골격근 세포(bSkMC)를 TSP 스캐폴드에 파종했다. 구체적으로, 0.5×106 bSkMC 세포를 각 스캐폴드에 파종하고, 분화 배지의 존재하에 배양했다. 14일에, 세포는 공초점 현미경을 사용하여 이미지화했다. 이미지(도 8)는 bSkMC가 TSP 스캐폴드 상에서 증식했음을 나타냈고, 이는 TSP가 배양된 육류 생산에 적용가능함을 나타낸다.
실시예 5
소 대동맥 평활근 세포(SMC)의 증식
본 발명자들은 하기 기재된 배지에서 파종된 SMC(도 9a 내지 9e)의 증식에 대하여 상업용 배지(BSM; 표 3)와 비교한 4개의 상이한 배지 제형의 효과를 검사했다.
SMC에서 시험된 상이한 배지의 제형
1 2 (기초) 3 4 5
BSM + - - - -
둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM) - + + + +
태소 혈청 (FBS) - 10% 15% 10% 10%
페니실린-스트렙토마이신 (PS) - 1% 1% 1% 1%
비-필수 아미노산 (NEAA) - - - 1% -
나트륨 피루베이트 - - - - 1 mM
3일에서, 세포 수에서의 유의한 차이는 5개 상이한 배지에서 검출할 수 없었다(도 10a). 실험후 3일에서(도 10b), 4개 상이한 처리 사이의 유의한 차이가 관찰되었고(P<0.01), 사후 분석(pos-hoc analysis)은 피루베이트-보충된 배지에 노출된 세포의 수가 NEAA 보충된 배지 및 15% FBS 보충된 배지와 비교하여 유의적으로 더 높은 것을 나타냈다(각각, P-값 <0.05 및 <0.01). 상업용 배지 및 나트륨 피루베이트-보충된 배지 사이의 차이는 미미하게 유의적이었다(P=0.052). 따라서, 본 발명자들은 BAOSMC 배양을 위해 나트륨 피루베이트 보충된 배지(1mM)로 진행했다.
실시예 6
규정된 조건하에 BDF 및 SMC의 성장 특성화
통상의 배지 제형을 정의한 후, 본 발명자들은 이들 조건하에 이들의 성장 동태를 검사했다(실시예 5). BDF(도 11a) 및 BAOSMC의 성장 속도는 매우 유사한 것으로 밝혀졌다(도 11b).
실시예 7
혈관신생에 대한 EC 및 지지 세포의 효과
지지 세포와의 공-배양으로 파종된 소 내피 세포(EC; BAEC-소 대동맥 내피 세포 또는 BSkMVEC-소 골격근 미소혈관 내피 세포)가 혈관신생 및 스캐폴드 커버리지를 증강시키는지를 시험하기 위해, BAEC를 BDF 또는 BASMC와 함께 공-파종했다. 실제로, 근아세포 및 내피 세포와 함께 섬유아세포를 공-배양하는 것은 조작된 근육 작제물의 혈관신생을 증가시키고 경시적으로 혈관 구조의 안정화를 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 세포는 전체 스캐폴드를 피복하는 것으로 밝혀졌다(도 12). 추가로, BAEC를 BASMC와의 공-배양으로 파종하는 경우(도 12a), 본 발명자들은 EC에 대한 염색이 경시적으로 감소되는 것을 알았다. 또한, 혈관 유사 구조는 이러한 조합에서 2일에 명백했다. BAEC를 BDF와의 공-배양으로 파종하는 경우(도 12b), 본 발명자들은 혈관-유사 구조가 없음을 알았다. BSkMVEC를 BASMC와의 공-배양으로 파종하는 경우(도 13a), 본 발명자들은 BSkMVEC보다 훨씬 많은 BASMC를 주목했다. 또한, 혈관-유사 구조는, 전체 실험 기간에 걸쳐, BASMC(도 13a) 및 BDF(도 13b)에서 명백했다.
실시예 8
특정의 세포 비율은 혈액 혈관 네트워크 형성을 개선시킨다
혈관 네트워크를 추가로 개선시키기 위해, 본 발명자들은 지지 세포(BDF 또는 BASMC)를 갖는 소 BAEC를 상이한 비율로 파종했다. 본 발명자들은 1:3, 1:1 및 5:1 EC 대 지지 세포인 3개의 상이한 비율을 검사했다. 본 발명자들은, BASMC의 존재하에(도 14 및 16) 2일보다 신속하게, 혈관을 생성한 BAEC 세포의 자가-조립을 명백하게 관찰했다(도 14 내지 16). 본 발명자들은 또한, 6일에는 2일보다 적은 EC가 존재했고 BAEC가 1:1 BAEC 대 BASMC 비율에서 혈관 네트워크의 영역을 생성했음에 주목했다. BDF의 존재하에 BAEC는 혈관을 생성하지 않는 것으로 생각된다(도 15).
실시예 9
세포 배양에서 소 위성 세포(BSC)의 분화
이어서, 본 발명자들은 BSC로부터 근관 형성의 전후에 미오게닌 발현을 검사하고, 융합 지수(FI) 측정을 위해 DAPI-미오게닌을 사용하는 능력을 추가로 평가했다. 본 발명자들은 미분화된 BSC에서 미오게닌 발현의 증거가 거의 없음을 밝혀냈다(도 17). 미오게닌 발현은 근관의 핵에서 및 근관 주위의 일부 핵에서 주로 발생했다. 융합 지수(FI)는 미오게닌/훽스트(Hoechst) 핵 계수의 비율에 의해 자동적으로 계산할 수 있는 것으로 나타났고, 이는 수동 FI 계산에 필적하는 것으로 밝혀졌다. 이 프로토콜은 근관 형성의 정량화에 추가로 사용했다.
실시예 10
세포 배양에서 BSC 분화의 최적화
이어서, 본 발명자들은 2D에서 BSC 분화를 최적화하는 것을 원했다. 본 발명자들은 어느 성장 인자(GF)가 (1) 분화 단계 동안 근관 형성을 억제하지 않는 확장기 동안 및 (2) 근관 크기 및 FI를 증가시키는 분화기의 종료시에 첨가될 수 있는지를 체크했다.
확장기 후 및 분화기 전에, 자발적 근관은 bFGF를 함유하지 않은 샘플에서 나타났고(도 18), 이는 bFGF가 근관 형성을 억제하는 것을 시사한다. EGF, IGF-1 및 DiI는 근관 형성에 영향을 미치지 않는 것 같다. 증가된 세포 밀도는 IGF-1, Pro-LIF 및 위닝에서 발생했다. 분화 4일에서, 본 발명자들은 bFGF 및 Pro-LIF 배양 조건하에 전체 근관의 증가를 관찰했다. bFGF는 BSC의 줄기를 유지했고, 세포를 제거하면 분화하기 시작했다(도 19). 분화 7일에서, 본 발명자들은, 다른 시험된 조건과 비교하여, 대조군, 위닝 및 DiI에서 근관의 높은 면적을 관찰했다(도 20). 본 발명자들은 근관 형성과 세포 사멸 사이는 구분이 쉽지 않은 것으로 결론지었다. 따라서, 세포는, 컨플루언시에 도달할 때까지 bFGF 함유 확장 배지(단독으로 또는 Pro-LIF와 함께)에서 성장한 다음, 2 내지 5일의 단기간 동안 분화 배지로 옮겨져야 한다. 추가로, IGF-1 또는 IGF-1 및 EGF가 세포 배양 배지에 첨가되는 경우, 근관의 높은 풍부함이 나타났다.
실시예 11
다공성 스캐폴드에서 BSC 확장의 최적화
이어서, 본 발명자들은, 이전 실험이 다공성 스캐폴드에서 낮은 세포 커버리지를 나타냈기 때문에, TSP 스캐폴드 상에서 60% 이상의 BSC 커버리지를 증가시키려고 시도했다. 따라서, GF를 확장기에 첨가하고, 파종시에 초기 세포 수를 증가시켰다. 세포 커버리지 면적의 정량화는 GF(즉, Pro-LIF)가 보충된 성장 배지로 배양한 세포가 스캐폴드의 72±15%를 피복한 반면, 성장 배지 단독으로 배양한 세포는 스캐폴드의 대략 18%를 피복했음을 나타냈다(도 21). 2개 처리 사이의 차이는 통계학적으로 유의한 것으로 밝혀졌다(P 값 = 0.0009).
실시예 12
다공성 스캐폴드에서 BSC 분화의 최적화
3D 스캐폴드 상에서 근관 형성을 위한 최적 조건을 발견하기 위해, 본 발명자들은 확장 배지 및 후속 분화 배지의 다중 조합을 스캔했다. 분화 배지에서 GF의 부재하에 형성된 근관(도 22a, e 및 i)는 보다 작고 원형이었다. 분화 배지에 대한 IGF-1의 첨가는 근관을 생성했고, 이는 성장 배지에서 드물게 관찰되고(도 22b), Pro-LIF-bFGF에서 통상적이고(도 22j), Pro-LIF 배지에서 풍부했다(도 22f). 분화 배지에 대한 EGF의 첨가는 모든 확장 배지에서 근관을 생성했다(도 22c, g 및 k). IGF-1 + EGF의 첨가는 성장 배지(도 22d) 및 Pro-LIF-bFGF(도 22l)에서 근관을 생성했고, Pro-LIF에서 근관이 풍부했다(도 22h).
실시예 13
삼중-배양은 다공성 스캐폴드에서 BSC 증식, 신장 및 커버리지를 증가시킨다
이어서, 본 발명자들은, BSC 생존, 증식 및 근관 분화(분화 마커-미오게닌에 대해 양성)에 대해 일정량의 평활근 세포(SMC) 및 상이한 양의 골격 미소혈관 내피(SkMVEC)(각각 2:1:1 및 2:1:5)와의 BSC 삼중-배양의 효과를 검사하기를 원했다. 본 발명자들은, 고농도의 SkMVEC(2:1:5; 도 28)로 인큐베이팅할 때의 이들의 외관과 비교하여, 낮은 SkMVEC 농도(2:1:1)에서 BSC가 더욱 신장되는 것을 관찰했다. 본 발명자들은 또한 BSC가 다공성 스캐폴드 위의 이들의 커버리지를 증가시키고 단일배양 또는 BSC 함유 공-배양(대조군)과 비교하여 더욱 분화되는 것을 관찰했다. 본 발명자들은 삼중-배양이 양 배양 비율에서 다른 시험된 그룹과 비교하여 BSC 증식 및 분화를 양호하게 지지하는 것으로 결론지었고, BSC 분화 가능성을 다음과 같이 요약했다: BSC 단독 < BSC + EC < BSC + SMC < BSC + EC + SMC(도 23 내지 26 및 28). 본 발명자들은 또한 BSC + SMC + SkMVEC(2:1:1)의 삼중-배양에서 세포외 매트릭스(ECM) 분비를 관찰했다(도 27a 내지 27b).
실시예 14
삼중-배양은 조직화 대두 단백질 스캐폴드에서 BSC 분화를 증가시킨다
이어서, 본 발명자들은 BSC 생존, 증식 및 근관 분화(분화 마커-미오게닌에 대해 양성)에 대해 일정량의 평활근 세포(SMC) 및 골격 미소혈관 내피(SkMVEC)(각각 2:1:1)와의 BSC 삼중-배양의 효과를 검사하기를 원했다. 본 발명자들은, SMC와의 공-배양 또는 SMC 및 BEC와의 삼중-배양으로 파종하는 경우, BSC가 TSP 스캐폴드 위의 이들의 커버리지를 증가시킬 뿐만 아니라 단일배양(BSC 단독) 또는 공-배양(BEC와의 BSC; 도 29)과 비교하여 더욱 분화되는 것을 관찰했다.
실시예 15
응고 겔을 첨가하지 않고서 BSC 파종
이어서, 본 발명자들은 응고제(예를 들면, 피브린)를 첨가하지 않고서 FDA-승인된 콜라겐 기초 스캐폴드(겔폼ⓒ)에 대한 BSC 파종의 효과를 검사하기를 원했다. 본 발명자들은, 근관 형성에 의해 입증된 바와 같이, 성공적 BSC 분화를 관찰했다(도 30).
본 발명의 특정 특징이 본원에 설명되고 기재되었지만, 당해 기술분야의 숙련가에게는 다수의 변형, 치환, 변경 및 동등물이 일어날 것이다. 따라서, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 진정한 정신의 범위 내에 속하는 이러한 모든 변형 및 변경을 포괄하는 것을 의도하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (30)

  1. 식용 조성물을 제조하는 방법으로서,
    a. 3차원 다공성 스캐폴드(porous scaffold), 및 (i) 근아세포 또는 이의 전구세포; 및 (ii) 세포외 매트릭스(ECM)-분비 세포의 적어도 하나의 유형; 또는 (iii) 내피 세포 또는 이의 전구세포 중의 적어도 하나를 포함하는 복수의 세포 유형을 인큐베이팅(incubating)하는 단계로서, 상기 근아세포 또는 이의 전구세포 및 상기 내피 세포 또는 이의 전구세포가 10:1 내지 1:10 범위의 비율로 인큐베이팅되는, 단계; 및
    b. 근아세포 또는 이의 전구세포의 근관으로의 분화를 유도하여, 식용 조성물을 제조하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 복수의 세포 유형이 근아세포 또는 이의 전구세포, 세포외 매트릭스(ECM)-분비 세포의 적어도 하나의 유형, 및 내피 세포 또는 이의 전구세포를 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 ECM-분비 세포가 간질 세포, 섬유아세포, 주피세포, 평활근 세포 및 이의 전구세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 세포 유형이 근아세포, ECM-분비 세포 및 내피 세포를 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 근아세포의 상기 전구세포가 위성 세포인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 내피 세포가 골격 미소혈관 내피 세포, 대동맥 평활근 세포 또는 이의 조합으로부터 선택되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 세포 유형이 위성 세포, ECM-분비 세포 및 내피 세포를 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 근아세포 또는 이의 전구세포 및 ECM-분비 세포가 10:1 내지 1:1 범위의 비율로 인큐베이팅되는, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 ECM-분비 세포 및 내피 세포가 1:10 내지 1:1 범위의 비율로 인큐베이팅되는, 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 위성 세포, 상기 ECM-분비 세포 및 상기 내피 세포가 10:1:1 내지 2:1:10 범위의 비율로 인큐베이팅되는 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 ECM-분비 세포가 섬유아세포, 이의 전구세포 또는 이의 조합인, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 3차원 다공성 스캐폴드가 조직화 단백질, 비-조직화 단백질 및 다당류(polysaccharide)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 조직화 단백질이 조직화 대두 단백질인, 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 3차원 다공성 스캐폴드가 20 내지 1,000㎛ 범위의 평균 직경을 갖는 세공(pore)을 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 세포 유형이 비-인간 세포인, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 세포가 가축 포유동물로부터 유래하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 근아세포 또는 이의 전구세포 및 상기 3차원 다공성 스캐폴드가 103 내지 107의 상기 근아세포 또는 이의 전구세포 대 10mg의 상기 3차원 다공성 스캐폴드 범위의 비율로 인큐베이팅되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 3차원 다공성 스캐폴드가 세포외 매트릭스를 추가로 포함하는, 방법.
  19. a. 3차원 다공성 스캐폴드;
    b. 상기 3차원 다공성 스캐폴드 mm3당 100,000 내지 250,000 근관 핵을 포함하는 근관; 및
    c. (i) 근아세포 또는 이의 전구세포; 및 (ii) ECM-분비 세포의 적어도 하나의 유형; 또는 (iii) 내피 세포 또는 이의 전구세포 중의 적어도 하나로 이루어진 그룹으로부터 선택된 복수의 세포 유형으로서, 상기 내피 세포 또는 이의 전구세포는 상기 복수의 세포의 15% 미만을 구성하는, 복수의 세포 유형을 포함하는,
    조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 복수의 세포 유형이 근아세포 또는 이의 전구세포, 세포외 매트릭스(ECM)-분비 세포의 적어도 하나의 유형, 및 내피 세포 또는 이의 전구세포를 포함하는, 조성물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 근아세포의 상기 전구세포가 위성 세포인, 조성물.
  22. 제19항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 세포 유형이 위성 세포, ECM-분비 세포 및 내피 세포를 포함하는, 조성물.
  23. 제19항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 ECM-분비 세포가 섬유아세포, 이의 전구세포 또는 이의 조합인, 조성물.
  24. 제19항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 3차원 다공성 스캐폴드가 조직화 단백질, 비-조직화 단백질 및 다당류로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 조직화 단백질이 조직화 대두 단백질인, 조성물.
  26. 제19항 또는 제25항에 있어서, 상기 3차원 다공성 스캐폴드가 20 내지 1,000㎛ 범위의 평균 직경을 갖는 세공을 포함하는, 조성물.
  27. 제19항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 세포 유형이 비-인간 세포인, 조성물.
  28. 제19항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 세포가 가축 포유동물로부터 유래하는, 조성물.
  29. 제19항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 3차원 다공성 스캐폴드가 세포외 매트릭스를 추가로 포함하는, 조성물.
  30. 제19항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 식용인, 조성물.
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