CN111108188A

CN111108188A - 培养肉组合物

Info

Publication number: CN111108188A
Application number: CN201880056787.XA
Authority: CN
Inventors: T·本阿里; S·莱文伯格
Original assignee: Alif Farm Co
Current assignee: Alif Farm Co
Priority date: 2017-07-15
Filing date: 2018-07-15
Publication date: 2020-05-05
Also published as: BR112020000952A2; RU2020107028A3; JP2020527054A; EP3728560A1; IL272066B1; JP2023116759A; IL272066B2; RU2020107028A; IL272066A; CA3070048A1; US20200140810A1; SG11201914083TA; EP3728560A4; KR20200071061A; AU2018304618A1; WO2019016795A1

Abstract

本发明涉及用于生产可食用组合物的方法，包括温育三维多孔支架和多种细胞类型，和诱导成肌细胞分化成肌管，所述多种细胞类型包括：成肌细胞或其祖细胞、至少一种类型的分泌细胞外基质(ECM)的细胞和内皮细胞或其祖细胞。

Description

培养肉组合物

交叉引用

本申请要求享有2017年7月15日提交的美国临时专利申请号62/532,998的优先权的权益，其内容通过引用以其全部并入本文。

技术领域

本发明尤其涉及培养肉(cultured meat)的组合物及其生产方法。

背景技术

培养肉，也称为工程肉或清洁肉(人造肉，clean meat)，是使用组织工程技术从细胞培养中生产的，并且是使用活体动物生产传统肉的突出的替代方法。在过去的十年中，这一概念特别是在生产出第一个实验室生长的培养牛肉汉堡之后，在公众舆论、大众媒体、投资者和科学界引起了越来越多的关注。用动物生产的食物被认为效率低下，因为动物在其一生中消耗大量食物，其中80-90％的卡路里浪费在动物的新陈代谢和非食用组织的产生上。在比较不同行业时，牛肉对环境的影响最大，但是总的来说，就土壤和水需求以及温室气体(GHG)排放而言，所有基于动物的产品都比基于植物的产品具有更大的环境足迹。根据联合国粮食及农业组织的报告，畜牧业占GHG排放的18％，使用了30％的地球地域或70％的耕地，以及8％的全球淡水。此外，到2050年，世界对肉的需求预计将增加一倍，这意味着传统的肉生产系统是不可持续的。与几种肉类来源相比，培养肉估计减少7-45％的能源使用、减少78-96％的GHG排放、减少99％的土地使用、和减少82-96％的用水。

集约化工厂化养殖和欠佳的动物福利条件是食源性疾病(如猪流感和禽流感)以及可在肉类中发现的大肠杆菌、沙门氏菌和弯曲杆菌传播的原因。在无菌受控环境中生产肉类可以帮助提高食品安全性。此外，在美国使用的所有抗生素中有70％作为食品添加剂给予农场动物，这些抗生素促进了对抗微生物抗性菌株的选择，并增加了对多种药物产生抗性的细菌的可能。过度使用抗生素是产生抗生素抗性细菌的主要原因，仅在美国，抗生素抗性细菌每年就造成550亿美元的经济负担、200万例感染、250,000例住院治疗和至少23,000例死亡。最近在中国养猪场中出现了对粘菌素具有抗性的细菌，这是抗生素的终极手段。

当前的培养肉技术集中在卫星细胞培养上。细胞可以以悬浮方式在二维(2D)烧瓶中或在微载体上生长、分离、分化和收获。然而，组织并不仅仅由细胞组成；细胞外基质(ECM)，其由糖蛋白和寡糖等大分子组成并赋予组织生化和生物力学性质，是细胞的大部分。ECM调节细胞行为并影响其组成。因此，产生ECM的细胞对于培养肉是必不可少的，并且必须避免诸如细胞收获之类的过程。另外，三维(3D)细胞培养模拟天然细胞环境，并且对影响细胞生化含量的正确的细胞行为是至关重要的。

发明内容

在一些实施方式中，本发明涉及包含肌管的可食用组合物和生产所述可食用组合物的方法。

本发明部分地基于以下发现：与对照相比，包括多种细胞类型(例如，卫星细胞、分泌ECM的细胞和内皮细胞)的细胞培养物诸如在三维多孔支架上生长时，显示出更好的存活、增殖和肌管形成。

本发明进一步部分地基于令人惊讶的发现：当用低内皮细胞(EC)浓度而不是用高EC浓度进行共培养时，卫星细胞(如非人类卫星细胞)具有更好的分化活性。

根据一个方面，提供了生产可食用组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)温育三维多孔支架和多种细胞类型，所述多种细胞类型包括：(i)成肌细胞或其祖细胞；和以下中的至少一种：(ii)至少一种类型的分泌细胞外基质(ECM)的细胞；或(iii)内皮细胞或其祖细胞，其中成肌细胞或其祖细胞与内皮细胞或其祖细胞以范围在10:1至1:10之间的比例温育；和(b)诱导成肌细胞或其祖细胞分化成肌管，从而产生可食用组合物。

在一些实施方式中，多种细胞类型包括成肌细胞或其祖细胞、至少一种类型的分泌细胞外基质(ECM)的细胞、和内皮细胞或其祖细胞。

在一些实施方式中，分泌ECM的细胞选自：基质细胞、成纤维细胞、周细胞、平滑肌细胞、及其祖细胞。

在一些实施方式中，多种细胞类型包括成肌细胞、分泌ECM的细胞和内皮细胞。

在一些实施方式中，成肌细胞的祖细胞是卫星细胞。

在一些实施方式中，内皮细胞选自骨骼微血管内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、或其组合。

在一些实施方式中，多种细胞类型包括卫星细胞、分泌ECM的细胞、和内皮细胞。

在一些实施方式中，成肌细胞或其祖细胞与分泌ECM的细胞以范围在10:1至1:1之间的比例温育。

在一些实施方式中，分泌ECM的细胞与内皮细胞以范围在1:10至1:1之间的比例温育。

在一些实施方式中，卫星细胞、分泌ECM的细胞、和内皮细胞以范围在10:1:1至2:1:10之间的比例温育。

在一些实施方式中，分泌ECM的细胞是成纤维细胞、其祖细胞、或其组合。

在一些实施方式中，三维多孔支架选自：组织化蛋白质(织构蛋白，texturedprotein)、非组织化蛋白质、和多糖。在一些实施方式中，组织化蛋白质是组织化大豆蛋白。在一些实施方式中，三维多孔支架包含平均直径范围在20至1,000微米的孔。

在一些实施方式中，多种细胞类型是非人类细胞。在一些实施方式中，多种细胞来源于牲畜哺乳动物。

在一些实施方式中，成肌细胞或其祖细胞和三维多孔支架以范围在10³至10⁷个成肌细胞或其祖细胞与10mg三维多孔支架的比例进行温育。在一些实施方式中，三维多孔支架还包含细胞外基质。

根据另一方面，提供了这样的组合物，其包含：(a)三维多孔支架；(b)每mm³三维多孔支架包含100,000-250,000个肌管核的肌管；和(c)选自以下的多种细胞类型：(i)成肌细胞或其祖细胞；和以下中的至少一种：(ii)至少一种类型的分泌ECM的细胞；或(iii)内皮细胞或其祖细胞，其中内皮细胞或其祖细胞占所述多种细胞的少于15％。

在一些实施方式中，组合物是可食用的。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实施方式的实践或测试中，但是下文描述了示例性方法和/或材料。在有冲突的情况下，以包括了定义的本专利说明书为准。另外，材料、方法和实例仅是示例性的，并不意图必须是限制性的。

根据下文给出的详细描述，本发明的其他实施方式和全部适用范围将变得显而易见。然而，应该理解，详细说明和具体实例虽然指示了本发明的优选实施方式，但是仅是出于示例目的给出，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改通过此详细描述对本领域技术人员而言将是显而易见的。

附图说明

图1A-1C是显示商业TSP的照片。(A)显示了TSP的大块、中块和小块产品。(B)和(C)显示了另外两种商业TSP薄片(flake)产品，注释为TVP(左)和Arcon(右)。

图2A-2B是显示TSP支架制备物(A)和含有细胞的TSP支架(B)的照片。

图3A-3B是大型TSP(A)和中型TSP(B)的100×放大率SEM图像。

图4A-4B是大型TSP(A)和中型TSP(B)的2×10⁵放大率SEM图像。

图5A-5C是在成纤维细胞接种后第8天(A)、第18天(B)和第21天(C)用成纤维细胞(红色)和内皮细胞(绿色)填充(populated)的TSP支架的共聚焦显微镜图像。

图6是将200,000个成纤维细胞(红色)接种到三种不同的支架样品(样品1-3)之后14天拍摄的共聚焦显微镜图像，这些支架样品获自以大型、中型、小型、和90°中型所表示的不同来源，以90°中型所表示的支架在支架制备程序TSP支架中从TSP的孔侧切下。比例尺＝1mm。

图7是在TSP支架上培养14天(蓝色-DAPI，绿色-结蛋白)的成肌细胞的共聚焦显微镜图像。

图8是在TSP支架上培养14天(蓝色-DAPI，绿色-鬼笔环肽)的牛骨骼肌细胞的共聚焦显微镜图像。

图9A-9E是接种在不同培养基中的牛主动脉平滑肌细胞(BAOSMC)(第8代)的显微照片。(A)基础培养基；(B)商业培养基；(C)胎牛血清(15％)补充；(四)非必需氨基酸补充；和(E)丙酮酸盐补充。比例尺＝100μm。

图10A-10B是培养3天后，不同的培养基对第9代(A)和第10代(B)牛主动脉平滑肌细胞增殖的比较的垂直条形图。

图11A-11B是显示牛皮肤成纤维细胞(BDF)(A)和牛主动脉平滑肌细胞(BAOSMC；B)的生长动力学的图。

图12A-12L是被接种与支持细胞共培养的荧光标记的牛主动脉内皮细胞(BAEC)在第2天(A、D、G和J)、第6天(B、E、H和K)和第8天(C、F、I和L)的图像。BAEC细胞(绿色)与均为红色的牛主动脉平滑肌细胞(SMC；A-F)或牛皮肤成纤维细胞(BDF；G-L)一起接种。A-C和G-I是3×3的×5放大率的瓷砖扫描(tile scans)。D-F和J-L是×20放大率。比例尺＝100μm。

图13A-13L是被接种与支持细胞共培养的荧光标记的牛骨骼肌微血管内皮细胞(BSkMVEC)在第2天(A、D、G和J)、第6天(B、E、H和K)和第8天(C、F、I和L)的图像。BSkMVEC细胞(绿色)与均为红色的牛主动脉平滑肌细胞(SMC；A-F)或牛皮肤成纤维细胞(BDF；G-L)一起接种。A-C和G-I是3×3的×5放大率的瓷砖扫描。D-F和J-L是×20放大率。比例尺＝100μm。

图14A-14F是包含不同比例的BAEC与SMC的荧光标记的细胞共培养物的图像。(A和D)5:1的BAEC与SMC；(B和E)1:1的BAEC与SMC。(C和F)分别是B和E的更高放大率。A-C是在第2天拍摄的图像，而D-F是在第6天拍摄的图像。BAEC以红色表示；比例尺＝100μm。

图15A-15E是包含不同比例的BAEC与BDF的荧光标记的细胞共培养物的图像。(A和C)5:1的BAEC与SMC；(B和D)1:1的BAEC与SMC。(E)是D的更高放大率。A和B是在第2天拍摄的图像，而C和D是在第6天拍摄的图像。BAEC以红色表示；比例尺＝100μm。

图16A-16L是包含不同比例的BAEC与SMC的荧光标记的细胞共培养物的图像。(A-D)1:3的BAEC与SMC；(E-H)1:1的SMC与BAEC；和(I-L和F)5:1的BAEC与SMC。(B、D、F、H、J和L)分别是(A、C、E、G、I和K)的更高放大率。(A、B、E、F、I和J)是在第2天拍摄的图像，而(C、D、G、H、K和L)是在第6天拍摄的图像。BAEC以红色表示；比例尺＝100μm。

图17A-17G显示了牛卫星细胞(BSC)的分化和肌管的形成。(A-C)是分化前的BSC细胞的图像；(D-F)是分化后的BSC细胞的图像。(G)是显示样品的融合指数(FI)的垂直条形图。(A和D)光学显微镜；(B和E)Hoechst和(C和F)成肌蛋白。发现分化前后，自动FI的差异在统计学上是显著的(P值＝0.00003)，而自动FI和手动FI之间的差异则不显著。

图18A-18G是分化第0天的BSC的亮场显微照片。(A)对照；(B)牛成纤维细胞生长因子(bFGF)；(C)表皮生长因子(EGF)；(D)IGF-1(胰岛素样生长因子1)；(E)Pro-LIF(不含生长因子LIF(白血病抑制因子)的增殖培养基)；(F)无依赖(无添加，weaning)；和(G)DiI。比例尺＝300μm。

图19A-19G是分化第4天的BSC的亮场显微照片。(A)对照；(B)牛成纤维细胞生长因子(bFGF)；(C)表皮生长因子(EGF)；(D)IGF-1(胰岛素样生长因子1)；(E)Pro-LIF；(F)无依赖；和(G)DiI。比例尺＝300μm。

图20A-20H显示了分化第7天的BSC的肌管形成。(A-G)是以下的亮场显微照片：(A)对照；(B)牛成纤维细胞生长因子(bFGF)；(C)表皮生长因子(EGF)；(D)IGF-1(胰岛素样生长因子1)；(E)Pro-LIF；(F)无依赖；和(G)DiI。比例尺＝300μm。(H)是针对每个不同扩增(扩大，expansion)条件所量化的肌管面积％的垂直条形图。

图21是垂直条形图，其显示了使用生长培养基或Pro-LIF培养基的多孔支架上第7天的细胞覆盖率的定量值。

图22A-22L是多孔支架上分化的荧光标记的BSC的共聚焦显微镜图像。扩增阶段包括：(A-D)在生长培养基上培养的细胞；(E-H)在Pro-LIF培养基上培养的细胞；(I-L)在Pro-LIF-bFGF培养基上培养的细胞。分化阶段包括：(A、E和I)未向分化培养基中添加生长因子(GF)；(B、F和J)将IGF-1添加到分化培养基中；(C、G和K)将EGF添加到分化培养基中；和(D、H和L)将IGF-1和EGF添加到分化培养基中。DiI(红色)；结蛋白(绿色)；比例尺＝100μm。

图23A-23O是接种后14天拍摄的在PLLA/PLGA支架上生长的三培养物的免疫荧光显微照片。BSC、SMC和BAEC以(A-E)2:1:1和(F-J)2:1:5的不同细胞密度接种在PLLA/PLGA支架上。(K-O)是(A-E)的放大率。对支架进行(A、F和K)DAPI染色；对支架进行(B、G和L)成肌蛋白染色；对支架进行(C、H和M)DiI染色；对支架进行(D、I和N)CD31染色。(E、J和O)是合并图像。比例尺＝100μm(A-J)；10μm(K-O)。

图24A-24F是接种后14天的PLLA/PLGA支架的免疫荧光显微照片。将BSC、SMC和BEC以(A-C)2:1:1和(D-F)2:1:5的不同细胞密度接种在PLLA/PLGA支架上。(A和D)BSC与SMC(2:1)；(B和E)BSC与BEC(2:1)；和(C和F)仅BSC的单一培养。对支架进行DAPI染色(蓝色)；对支架进行成肌蛋白染色(灰色)；对支架进行DiI染色(红色)；和对支架进行CD31染色(绿色)。比例尺＝100μm。

图25A-25H是接种后14天，在组织化大豆蛋白支架上与SMC共培养的BSC的免疫荧光显微照片。测试了(A-D)2:1:1和(E-H)2:1:5的不同细胞密度。对支架进行(A和E)DAPI染色；对支架进行(B和F)成肌蛋白染色；对支架进行(C和G)DiI染色；(D)和(H)分别是(A-C)和(E-G)的合并图像。比例尺＝100μm。

图26A-26E是接种后14天，在组织化大豆蛋白支架上三培养的BSC、SMC和BEC的免疫荧光显微照片。对支架进行(A)DAPI染色；对支架进行(B)成肌蛋白染色；对支架进行(C)DiI染色；和对支架进行(D)CD31染色。(E)是(A-D)的合并图像。

图27A-27B是接种后14天，以2:1:1的比例接种在PLLA/PLGA支架上的BSC、SMC和BEC的三培养物的三色染色的显微照片。(A)×5放大率的瓷砖扫描和(B)×10放大率的瓷砖扫描。支架被染成三色。阳性细胞外基质(ECM)染色被包围。比例尺＝100μm。

图28A-28C是垂直条形图，其显示了支持细胞对肌原性分化的影响以及培养物中不同细胞比例的重要性。显示了在(A)2:1:1和(B)2:1:5的细胞密度下PLLA/PLGA支架上的三培养物(BSC:SMC:BEC)和对照(共培养或单一培养)的肌源性分化。(C)以2:1:1对组织化大豆蛋白进行统计学分析。

图29A-29N描述了三培养物在组织化蛋白质支架上的分化。(A-L)是接种后14天的免疫染色的组织化大豆蛋白支架的荧光图像。细胞被接种在组织化大豆蛋白支架上：(A、E和I)BSC、(B、F和J)BSC+BEC；(C、G和K)BSC+SMC；和(D、H和L)BSC+SMC+BEC的三培养物。(A-D)×20放大率、(E-H)×20的瓷砖扫描、和(I-L)×63放大率的成肌蛋白染色。对支架进行DAPI染色(蓝色)、对支架进行成肌蛋白染色(灰色)、对支架进行DiI染色(红色)对支架进行和CD31染色(绿色)。比例尺＝100μm。(M)是在TSP支架上进行的单一培养(仅BSC)、共培养(BSC+BEC；或BSC+SMC)和三培养(BSC+SMC+BEC)的成肌蛋白表达定量的垂直条形图。(N)是在TSP支架上进行的单一培养和与SMC共培养的BSC覆盖率定量的垂直条形图。

图30是接种后14天，在明胶海绵(Gelfoam)支架上于无凝胶情况下接种的免疫染色的BSC的荧光图像。对支架进行DAPI染色(蓝色)、对支架进行成肌蛋白染色(灰色)、对支架进行DiI染色(红色)；和对支架进行CD31染色(绿色)。比例尺＝50μm。

具体实施方式

本发明涉及用于生产供食用(food consumption)的培养肉的组合物、试剂盒(套组，kit)和方法。本发明在一些实施方式中涉及可食用组合物，其包含多孔组织化蛋白质和附着于其上的三维多类型细胞组织，所述三维多类型细胞组织包括成肌细胞和一种或多种细胞类型。本发明还涉及通过在特定条件下用三维多孔支架(例如，多孔组织化蛋白质)体外培养成肌细胞和一种或多种细胞类型来生产组合物的方法。

在一些实施方式中，本发明的组合物可以旨在供人类、非人类动物、或两者食用。在一些实施方式中，培养肉产品是供人食用的食品。在其他实施方式中，培养肉产品用于动物饲料，如牲畜饲料、水产养殖饲料、或家庭宠物饲料。

在一些实施方式中，本发明涉及用于生产可食用组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.温育三维多孔支架和包含成肌细胞与至少一种分泌ECM的细胞类型的多种细胞类型，所述至少一种分泌ECM的细胞类型选自脂肪细胞、成纤维细胞、及其祖细胞；和内皮细胞或其祖细胞

b.使所述多种细胞类型在三维多孔支架上扩增；和

c.诱导成肌细胞分化成肌管；

从而使细胞形成可食用组合物，所述可食用组合物包含三维多类型细胞组织，所述三维多类型组织包含肌肉细胞和多孔组织化蛋白质。

如本文所用，术语“肌管”是指由多个成肌细胞和/或肌细胞的融合所形成的多核纤维。

如本文所用，术语“肌肉细胞”是指对肌肉组织作出贡献(促成，contributes to)的任何细胞，并且可以包括：成肌细胞、卫星细胞(SC)、肌管、肌纤维、和肌原纤维组织。

在一些实施方式中，方法包括体外或离体培养成肌细胞，并使这些细胞分化成特定类型的肌肉细胞，如骨骼肌细胞或平滑肌细胞。

在一些实施方式中，本发明涉及可食用组合物，其包含：多孔组织化蛋白质；和包含肌肉细胞的三维多类型细胞组织，其中三维多类型细胞组织附着于多孔组织化蛋白质，并且其中三维多类型细胞组织来源于将多种细胞类型与多孔组织化蛋白质进行体外培养，所述多种细胞类型包括：成肌细胞和选自以下的一种或多种细胞类型：脂肪细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞及其祖细胞。

如下文举例说明的，组合物可包含分泌细胞外分子的成纤维细胞，从而形成向细胞提供进一步结构和机械支持的细胞外基质(ECM)。

如下文进一步举例说明的，组合物可包含内皮细胞(EC)或内皮祖细胞(EPC)，以提供组织支持、提供信号传导和/或形成毛细血管内皮。

在一些实施方式中，三维多类型细胞组织包括肌肉细胞，肌肉细胞包括骨骼肌细胞、平滑肌细胞和卫星细胞。在一些实施方式中，三维多类型细胞组织包括脂肪细胞(fatcells)(例如，脂肪细胞(adipocytes))。在一些实施方式中，三维多类型细胞组织包括由特化细胞(例如，成纤维细胞)分泌的细胞外基质。在一些实施方式中，三维多类型细胞组织包括内皮细胞或由内皮细胞形成的毛细血管内皮，内皮细胞包括但不限于主动脉内皮细胞和骨骼微血管内皮细胞。在一些实施方式中，三维多类型细胞组织还包括细胞外基质。在一些实施方式中，三维多类型细胞组织还包括脂肪细胞。在一些实施方式中，三维多类型细胞组织还包括毛细血管。

在一些实施方式中，本发明涉及适合细胞生长的组合物，其包含多孔组织化蛋白质和细胞培养基。在另一实施方式中，适合细胞生长的组合物还包含生长因子、细胞因子、生物活性剂、营养物、氨基酸、抗生素化合物、抗炎化合物、或其任意组合。适合细胞存活和生长的合适的培养基和化合物是本领域技术人员已知的。

在一些实施方式中，本发明涉及这样的组合物，其包含：附着于多孔组织化蛋白质的多种细胞类型，所述多种细胞类型包括：成肌细胞和一种或多种选自以下的细胞类型：脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、及其祖细胞。

在一些实施方式中，本发明提供了这样的试剂盒，其包含：三维多孔支架(例如，多孔组织化蛋白质)；和多种细胞类型，其包括：成肌细胞和一种或多种选自以下的细胞类型：脂肪细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、及其祖细胞。在一些实施方式中，试剂盒用于生产可食用组合物。在一些实施方式中，试剂盒还包含至少一种选自以下的组分：细胞培养基、生长因子、分化培养基、分化诱导剂。在一些实施方式中，试剂盒还包含细胞培养基。在另一实施方式中，细胞培养基选自干粉培养基、颗粒制剂、水性液体或培养基浓缩物。在一些实施方式中，多种细胞类型是冷冻的。在一些实施方式中，试剂盒还包含使用说明书。

多种细胞类型

如本领域技术人员将理解的，可用三维多孔支架培养许多细胞类型或细胞群，从而形成三维多类型细胞组织结构。在一些实施方式中，一种或多种细胞类型选自：成肌细胞、分泌ECM的细胞、内皮细胞。

在一些实施方式中，一种或多种细胞类型是成肌细胞的祖细胞。在一些实施方式中，一种或多种细胞类型是分泌ECM的细胞的祖细胞。在一些实施方式中，一种或多种细胞类型是内皮细胞的祖细胞。

如本文所用，祖细胞包括间充质干细胞(MSc)、胚胎干细胞(ESc)、成年干细胞、分化的Esc、分化的成年干细胞、和诱导的多能干细胞(iPSc)。如本文所用，术语“祖细胞”是指能够在多个谱系中产生分化细胞的细胞，如成肌细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、基质细胞、成纤维细胞、周细胞、平滑肌细胞、和内皮细胞。“祖细胞”与干细胞的不同之处在于它们一般不具有广泛的自我更新能力。

在一些实施方式中，本发明的多种细胞类型的细胞是祖细胞。在一些实施方式中，祖细胞在单一培养中培养。在一些实施方式中，祖细胞在单一培养中分化。在一些实施方式中，祖细胞在单一培养中分化，然后根据本发明的方法在具有多个细胞的三维多孔支架上温育。非限制性实例包括但不限于将间充质干细胞培养并分化为成肌细胞，之后接种，并随后在三维多孔支架上温育分化的成肌细胞。培养和诱导祖细胞分化为成熟细胞的方法对本领域普通技术人员而言是显而易见的。

在一些实施方式中，多种细胞类型包括成肌细胞和成纤维细胞。在一些实施方式中，多种细胞类型包括成肌细胞、成纤维细胞和/或成纤维细胞祖细胞。在一些实施方式中，多种细胞类型包括成肌细胞、成纤维细胞和脂肪细胞。在一些实施方式中，多种细胞类型包括成肌细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、和/或成纤维细胞祖细胞和/或脂肪细胞祖细胞。在一些实施方式中，多种细胞类型包括成肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞。在一些实施方式中，多种细胞类型包括成肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞、和/或成纤维细胞祖细胞、和/或内皮祖细胞。在一些实施方式中，多种细胞类型包括成肌细胞和平滑肌细胞。在一些实施方式中，多种细胞类型包括成肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。在一些实施方式中，多种细胞类型包括成肌细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、和脂肪细胞。在一些实施方式中，多种细胞类型包括成肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、和脂肪细胞。在一些实施方式中，多种细胞类型包括成肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞和/或成纤维细胞祖细胞、和/或脂肪细胞祖细胞、和/或内皮祖细胞。

在一些实施方式中，多种细胞类型获自活体动物并被培养成原代细胞系。作为非限制性实例，可通过活检获得细胞并离体培养。对于另一非限制性实例，细胞可获自商业来源。

在一些实施方式中，多种细胞类型来源于干细胞，如多能胚胎干细胞。在另一实施方式中，使用间充质干细胞(MSC)。如本领域技术人员已知的，MSC可产生肌肉细胞、脂肪细胞、骨细胞、和软骨细胞。在另一实施方式中，细胞是诱导型多能干细胞(iPS或iPSC)。在另一实施方式中，细胞来源于全能胚胎干细胞，如来自这些动物的胚泡期、受精卵、胎盘、或脐带的细胞。

在一些实施方式中，多种细胞类型来源于非人类细胞。在一些实施方式中，多种细胞类型来源于选自以下的非人类细胞：哺乳动物、鸟类、鱼类、无脊椎动物、爬行动物、两栖动物、及其组合。在一些实施方式中，多种细胞类型来源于哺乳动物。在一些实施方式中，多种细胞类型来源于非人类哺乳动物。在一些实施方式中，多种细胞类型来源于牲畜哺乳动物。如本文所用，“牲畜”包括任何家养哺乳动物、半家养哺乳动物或圈养野生哺乳动物。非人类哺乳动物的非限制性实例包括：羚羊、熊、海狸、野牛、野猪、骆驼、驯鹿、牛、鹿、大象、麋鹿、狐狸、长颈鹿、山羊、野兔、马、野山羊、袋鼠、狮子、美洲驼、驼鹿、西貒、猪、兔子、海豹、绵羊、松鼠、虎、鲸、牦牛、和斑马、或其组合。在一些实施方式中，多种细胞类型来源于鸟细胞。鸟类的非限制性实例包括：鸡、鸭、鸸鹋、鹅、松鸡、鸵鸟、野鸡、鸽子、鹌鹑、和火鸡、或其组合。在一些实施方式中、多种细胞类型来源自鱼类。鱼的非限制性实例包括：鲈鱼(bass)、鲶鱼、鲤鱼、鳕鱼、鳗鱼、比目鱼、河豚、石斑鱼、黑线鳕、大比目鱼、鲱鱼、鲭鱼、鯕鳅、马林鱼、橙棘鲷、鲈鱼(perch)、派克鱼、明太鱼(pollock)、鲑鱼、沙丁鱼、鲨鱼、鲷鱼、鳎鱼、剑鱼、罗非鱼、鳟鱼、金枪鱼、和碧古鱼、或其组合。在一些实施方式中，多种细胞类型来源于无脊椎动物。无脊椎动物的非限制性实例包括：龙虾、螃蟹、虾、蛤、牡蛎、贻贝、和海胆。在一些实施方式中，多种细胞类型源自爬行动物。爬行动物的非限制性实例包括：蛇、鳄鱼、和龟。在一些实施方式中，多种细胞类型来源于两栖动物。两栖动物的非限制性实例包括蛙类。

接种和培养细胞

如本领域技术人员将理解的，本文所述的组合物和方法中使用的每种类型的细胞可具有优选或最佳的细胞密度范围，并且喜好适合细胞存活的培养基或生长因子。在一些实施方式中，每种细胞类型以特定的细胞密度接种。在一些实施方式中，将细胞同时地或以顺序方式进行接种。

在一些实施方式中，成肌细胞以相对于10mg的多孔组织化蛋白质，10³至10⁷个细胞的细胞密度接种。在一些实施方式中，以特定比例接种不同的细胞类型。在一些实施方式中，接种的成肌细胞与接种的成纤维细胞的比例范围在1:1,000和1,000:1之间。在一些实施方式中，接种的成肌细胞和接种的成纤维细胞与接种的内皮细胞的比例范围在1:20和20:1之间。在一些实施方式中，接种的成肌细胞和接种的成纤维细胞与接种的脂肪细胞的比例范围在1:5000和5000:1之间。在一些实施方式中，接种的卫星细胞与接种的平滑肌细胞的比例范围在5:1和1:5之间。在一些实施方式中，接种的卫星细胞与接种的骨骼微血管内皮细胞的比例范围在10:1和1:10之间。在一些实施方式中，接种的平滑肌细胞与接种的骨骼微血管内皮细胞的比例范围在10:1和1:10之间。在一些实施方式中，接种的卫星细胞与接种的平滑肌细胞与接种的骨骼微血管内皮细胞的比例范围在10:1:1和2:1:10之间。在一个实施方式中，接种的卫星细胞与接种的平滑肌细胞与接种的骨骼微血管内皮细胞的比例范围在2:1:1和2:1:5之间，或两者之间的任何比例。在一个实施方式中，接种的卫星细胞与接种的平滑肌细胞与接种的骨骼微血管内皮细胞的比例范围在2:1:1和2:1:2之间，或两者之间的任何比例。在一个实施方式中，接种的卫星细胞与接种的平滑肌细胞与接种的骨骼微血管内皮细胞的比例范围在2:1:1与2:1:3之间，或两者之间的任何比例。在一个实施方式中，接种的卫星细胞与接种的平滑肌细胞与接种的骨骼微血管内皮细胞的比例范围在2:1:1与2:1:4之间，或两者之间的任何比例。每种可能性都代表本发明的单独的实施方式。

在一些实施方式中，接种的细胞密度和温育的细胞密度是同等相同的(comparably the same)。

在一个实施方式中，“覆盖率％”是指与细胞或肌管接触的多孔支架的面积或体积。在另一实施方式中，覆盖率％是指细胞或肌管所占据的多孔支架的面积或体积。如本文所用，与支架接触的细胞在其上、其内部、或是其上和其内部的组合。

在一些实施方式中，多种细胞的覆盖率％是至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90、或至少99％。在一些实施方式中，多种细胞的覆盖率％是5-20％、15-30％、25-40％、35-50％、45-60％、55-70％、65-80％、75-90％、85-100％、或其之间的任何范围。每种可能性都代表本发明的单独的实施方式。

在一些实施方式中，卫星细胞的覆盖率％是至少35％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90、或至少99％。在一些实施方式中，卫星细胞的覆盖率％是25-40％、35-50％、45-60％、55-70％、65-80％、75-90％、85-100％、或其之间的任何范围。每种可能性都代表本发明的单独的实施方式。

在一些实施方式中，内皮细胞的覆盖率％至多是2％、至多是5％、至多是10％、至多是15％、至多是20％、至多是25％、至多是30％、至多是35％、至多是40％、至多是45％、或至多是50％。在一些实施方式中，内皮细胞的覆盖率％是5-15％、10-25％、20-35％、30-50％、或其之间的任何范围。每种可能性都代表本发明的单独的实施方式。

在一些实施方式中，内皮细胞用于增加成肌细胞或其祖细胞的增殖。在一些实施方式中，内皮细胞抑制成肌细胞或其祖细胞分化成肌管。在一些实施方式中，内皮细胞支持成肌细胞或其祖细胞的生长和增殖。在一些实施方式中，成肌细胞或其祖细胞的分化不需要内皮细胞。在一些实施方式中，根据本发明的方法，内皮细胞活性(例如，肌源剂(myogenic agent)的分泌、支持成肌细胞生长、存活、或两者)维持限定的时间。在一些实施方式中，内皮活性的限定时间是成肌细胞或其祖细胞达到三维多孔支架至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少99％的覆盖率所需的时间。在一些实施方式中，内皮活性的限定时间是成肌细胞或其祖细胞达到至少30％的覆盖率所需的时间。

在一些实施方式中，肌管的覆盖率％是至少5％、至少20％、至少35％、至少50％、至少70％、至少85％、至少90％、至少90％、或至少99％。在一些实施方式中，肌管的覆盖率％是1-10％、5-20％、15-35％、30-50％、40-65％、60-85％、80-90％、90-100％，或其之间的任何范围。每种可能性都代表本发明的单独的实施方式。

在一些实施方式中，本发明的组合物的肌管包含每mm³的三维多孔支架10,000-100,000个核、每mm³的三维多孔支架10,000-100,000个核、每mm³的三维多孔支架15,000-200,000个核、每mm³的三维多孔支架50,000-500,000个核、每mm³的多孔支架5,000-1,000,000个核、每mm³的三维多孔支架100,000-250,000个核、每mm³的三维多孔支架10,000-1,500,000个核，或其之间的任何范围。每种可能性都代表本发明的单独的实施方式。

对于熟练的技术人员显而易见的是，ECM影响成肌细胞向肌管的分化。在一些实施方式中，根据本发明的方法所利用的分泌ECM的细胞提高了成肌细胞的分化。在一些实施方式中，分泌ECM的细胞通过模拟组织物理性质提高了成肌细胞分化。

如本文定义的，术语“提高”和“增加”是可互换的。

在一些实施方式中，提高了至少5％、至少20％、至少35％、至少50％、至少75％、至少90％、至少100％、至少250％、至少500％、至少750％、至少1,000％、至少2,500％、或至少5,000％。在一些实施方式中，提高了5-15％、10-35％、25-45％、40-70％、65-90％、85-150％、100-500％、或250-1,000％。每种可能性都代表本发明的单独的实施方式。

组织物理性质的非限制性实例包括但不限于硬度、孔隙度、柔性、刚度等。组织可以根据其杨氏模量、粘度模量、或其他参数在物理学上进行定义，所有这些对于本领域普通技术人员来说都是显而易见的。

在一些实施方式中，本发明的方法还包括对多孔组织化蛋白质进行灭菌的步骤。在一些实施方式中，在接种或温育多种细胞类型之前，对多孔组织化蛋白质进行灭菌。在一些实施方式中，灭菌是通过γ辐射进行的。在另一实施方式中，灭菌是基于乙醇的灭菌。灭菌程序对于本领域普通技术人员将是显而易见的。

技术人员将理解，在细胞培养基的存在下进行细胞的接种和/或培养。在另一实施方式中，细胞培养基包含生长因子、细胞因子、生物活性剂、营养物、氨基酸、抗生素化合物、抗炎化合物、或其任何组合。适合细胞存活和生长的合适的培养基和化合物是本领域技术人员已知的。

可以用于本发明的方法和组合物中的生长因子包括但不限于血小板源性生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)。已知PDGF和IGF-1刺激促有丝分裂的、趋化性的和增殖(分化)细胞响应。生长因子可以是但不限于以下的一种或多种：PDGF，例如PDGF AA、PDGFBB；IGF，例如，IGF-I、IGF-II；成纤维细胞生长因子(FGF)，例如，酸性FGF、碱性FGF、β-内皮细胞生长因子、FGF 4、FGF 5、FGF 6、FGF 7、FGF 8、和FGF 9；转化生长因子(TGF)，例如，TGF-P1、TGF-β1.2、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β5；骨形态发生蛋白(BMP)，例如，BMP 1、BMP 2、BMP3、BMP 4；血管内皮生长因子(VEGF)，例如，VEGF、胎盘生长因子；表皮生长因子(EGF)，例如，EGF、双调蛋白、β细胞素(β动物纤维素，betacellulin)、肝素结合EGF；白介素，例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14；集落刺激因子(CSF)，例如，CSF-G、CSF-GM、CSF-M；神经生长因子(NGF)；干细胞因子；肝细胞生长因子，和睫状神经营养因子。

如下文举例说明的，在牛源细胞的情况下，优化的卫星细胞(SC)扩增培养基(即，Pro-LIF培养基)包含牛SC(BSC)生长培养基(99％)、两性霉素B(AB/AM；和1％1×)，ZnCl₂(50μM)、EGF(62ng/ml)、IGF-1(100ng/ml)、和bFGF(10ng/ml)。

如下文举例说明的，在牛源细胞的情况下，优化的SC生长培养基包括DMEM/HEPES(43.5％)、Ham's F-10营养混合物(Nutrient Mix)(43.5％)、胎牛血清(10％)、MEM NEAA(1％l×)、GlutaMAX(1％)、和AB/AM(1％l×)。

如下文举例说明的，牛源细胞的情况下，优化的SC分化培养基包含DMEM/HEPES(97％)、供体马血清(2％)、AB/AM(1％l×)、IGF-1(100ng/ml)、和EGF(62ng/ml)。

多孔支架

在一些实施方式中，将本发明的多种细胞与多孔支架一起温育。如本文所用，术语“支架”是指包含提供适于细胞的粘附/附着、成熟、分化、和增殖的表面的材料的结构。支架还可提供机械稳定性和支持。支架可以是特定的形状或形式，从而影响或界定增殖细胞群所呈现的三维形状或形式。在一些实施方式中，本发明的多孔支架是三维的。

在一些实施方式中，多孔支架的平均孔径的范围是20微米(μm)至1000μm、20μm至900μm、20μm至800μm、20μm至700μm、20μm至600μm、20μm至500μm、20μm至400μm、20μm至300μm、20μm至200μm、20μm至100μm、50μm至1000μm、50μm至900μm、50μm至800μm、50μm至700μm 50μm至600μm、50μm至500μm、50μm至400μm、50μm至300μm、50μm至200μm、50μm至100μm、100μm至1000μm、100μm至900μm、100μm至800μm、100μm至700μm、100μm至600μm、100μm至500μm、100μm至400μm、100μm至300μm、100μm至200μm、500μm至1000μm、500μm至900μm、500μm至800μm、500μm至700μm、或500μm至600μm。每种可能性都代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，多孔支架的平均孔径范围是20μm至1000μm。

在一些实施方式中，多孔支架是可食用的。在一些实施方式中，多孔支架包含组织化蛋白质。在一些实施方式中，多孔支架包含多糖。在一些实施方式中，组织化蛋白质是组织化植物蛋白质。在一些实施方式中，组织化蛋白质是组织化大豆蛋白(例如，TSP)。

本文使用的术语“组织(质地，texture)”是指个体细胞的刚性块(rigid mass)或柔性块(flexible mass)，其可以容易地形成各种尺寸、形状和构型，并且在水中不分散。

用于本文的合适的颗粒状组织化蛋白质材料可由基于干重的30％至100％的蛋白质和与蛋白质源材料或添加的佐剂材料相关的0％至70％的材料组成。佐剂的实例是碳水化合物、维生素、调味剂、色素或其他。在一些实施方式中，蛋白质颗粒按干重计包括50％至100％的蛋白质、或50％至80％的蛋白质。

可组织化(纹理化，织构化，texturized)以形成组织化的颗粒状蛋白质材料的合适的非组织化蛋白质可从多种来源获得。作为非限制性实例，此类蛋白质的来源是植物蛋白质和某些真菌蛋白质；然而，可以使用动物蛋白质。合适的动物蛋白质的实例是酪蛋白、胶原蛋白和蛋清。合适的植物蛋白质来源的实例是大豆、红花种子、玉米、花生、小麦、小麦面筋(谷蛋白，gluten)、豌豆、向日葵种子、鹰嘴豆、棉籽、椰子、油菜籽、芝麻籽、叶蛋白、面筋、单细胞蛋白(如酵母)等。

合适的蛋白质来源的另一个实例是蘑菇。在一些实施方式中，蘑菇蛋白质来源包含按干重计15-20％(w/w)、20-30％(w/w)、28-45％(w/w)、或10-40％(w/w)的蛋白质含量。

通常地，如果蛋白质来源是植物蛋白质，则蛋白质在使用前是处于相对纯的形式。因此，例如如果蛋白质来源是大豆，则可以溶剂(如用己烷)萃取大豆，以从中除去油。所得的无油大豆粉含有约50％的蛋白质。

可以用已知的方式加工大豆粉来除去碳水化合物并获得具有较高蛋白质水平的产物，例如，包含约70％蛋白质的大豆浓缩蛋白或包含约90％或更多蛋白质的大豆分离蛋白。继而，可以采用各种合适的现有技术工艺将大豆粉、浓缩物、分离物和其他含有可食用蛋白质的材料转化成合适的组织化颗粒蛋白质材料。

例如，在以下美国专利号中公开了用于将含有非组织化动物蛋白、植物蛋白质的材料转化成颗粒状组织化蛋白质的合适的方法：1954年6月29日授予Boyer的2,682,466；1964年7月28日授予Kitchel的3,142,571；1970年1月6日授予Atkinson的3,488,770；1970年3月3日授予Calvert等人的3,498,794；1973年9月18日授予Loepiktie等人的3,759,715；1973年12月11日授予Strommer的3,778,522；1974年2月26日授予Dannert等人的3,794,731；1974年6月4日授予Yang等人的3,814,823；和1972年4月28日提交的共同受让的美国专利申请序列号248,581，现在是1974年10月8日授予Liepa等人的美国专利号3,840,679；所有这些专利均通过引用并入本文。

在可选实施方式中，多孔组织化蛋白质可被其他的可摄取可食用的以及可咀嚼的多孔组合物代替。如本文所用，术语“可摄取的”和“可食用的”是指可以安全摄入体内的组合物。这些组合物包括被吸收的组合物、未被吸收的组合物以及可消化的和不可消化的组合物。如本文所用，术语“可咀嚼的”是指在吞咽之前可通过咀嚼将其破碎/粉碎成较小的片块的组合物。本领域技术人员将理解，可根据期望的用途(例如，成人食用)的物理性质(例如，杨氏模量、粘度模量、刚度等)来选择合适的可食用组合物。

根据本发明的方法，将多种细胞类型接种在三维多孔支架本身上。在一些实施方式中，接种在三维多孔支架上的多种细胞类型不需要固化剂。在一些实施方式中，接种在三维多孔支架上的多种细胞类型需要固化剂。在一些实施方式中，固化剂增加了多种细胞类型与三维多孔支架的粘附或附着。固化剂的非限制性实例包括但不限于凝血酶或纤维蛋白。

如本文所用，术语“胶凝剂”和“固化剂”是可互换的。

在讨论中，除非另有说明，否则修饰本发明的实施方式的一个或多个特征的条件或关系特征的形容词诸如“基本上”和“约”，应理解为意指该条件或特征被定义为在这样的公差范围内：该公差对于意图应用的该实施方式的操作而言是可接受的。除非另有说明，否则说明书和权利要求中的词语“或”被认为是包含性的“或”而非是排他性的“或”，并且表示其所连接的项目中的至少一个或任何组合。

应当理解，如上文和本文其他地方所使用的术语“一个”和“一种”是指所列举的组分中的“一个或多个(一种或多种)”。本领域普通技术人员会明白，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。因此，术语“一”、“一个”和“至少一个(种)”在本申请中可互换使用。

为了更好理解本教导，并且绝不限制本教导的范围，除非另有说明，否则说明书和权利要求中使用的表示数量、百分数或比例、以及其他数值的所有数字均应理解为由在所有情况下都以术语“约”进行修饰。因此，除非相反地指示，否则以下说明书和所附权利要求中列出的数值参数是近似值，其可根据试图获得的期望性质而变化。至少，至少应该根据所记录的有效数字的数目并通过应用普通的四舍五入技术来解释每一个数值参数。

在本申请的说明书和权利要求中，动词“包含”、“包括”和“具有”中的每一个及其共轭词都用于表示该动词的一个或多个宾语并不一定是该动词的一个或多个主语的组分、要素或部分的完整列举。

如本文所使用的其他术语旨在由其在本领域中的公知的含义来定义。

通过研究以下实例，本发明的其他目的、优点、和新颖特征对于本领域普通技术人员将变得显而易见，而这些方式并非旨在是限制性的。另外，如上文所述且如以下权利要求部分所要求保护的，本发明的各种实施方式和方面中的每一个在以下实例中均得到实验支持。

应当理解，为清楚起见，在单独的实施方式的背景下描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中以组合方式提供。相反，为简洁起见，在单个方式的背景下描述的本发明的各种特征，也可以单独地或以任何合适的子组合或在本发明的任何其他所述实施方式中合适地提供。在各种方式的背景下描述的某些特征不应被认为是那些实施方式的必要特征，除非该方式在没有那些要素的情况下是不可操作的。

实施例

通常地，本文所用的命名法以及本发明中使用的实验室程序包括分子、生化、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如，"Molecular Cloning:Alaboratory Manual"Sambrook et al.,(1989)；"Current Protocols in MolecularBiology"第I-III卷Ausubel,R.M.,ed.(1994)；Ausubel et al.,"Current Protocols inMolecular Biology",John Wiley和Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,"APractical Guide to Molecular Cloning",John Wiley&Sons,New York(1988)；Watsonet al.,"Recombinant DNA",Scientific American Books,New York；Birren et al.(eds)"Genome Analysis:A Laboratory Manual Series",第1-4卷,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York(1998)；美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中列出的方法学；"Cell Biology:A Laboratory Handbook",第I-III卷Cellis,J.E.,ed.(1994)；Freshney,Wiley-Liss N.Y.(1994)的"Culture of AnimalCells-A Manual of Basic Technique",第三版；"Current Protocols in Immunology"第I-III卷Coligan J.E.,ed.(1994)；Stites et al.(eds),"Basic and ClinicalImmunology"(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds),"Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory CourseManual"CSHL Press(1996)；"Bacteriophage Methods and Protocols",第1卷:Isolation,Characterization,and Interactions，所有这些均通过引用并入。本文件全文中提供了其他的一般性参考。

材料和方法

组织化大豆蛋白

组织化大豆蛋白(TSP)作为几种不同的产品可商购获得。由5种不同来源的商业TSP——在当地的保健食品商店购买的3种TSP块(图1A)和从ADM购买的2种TSP薄片(图1B-1C)来制备TSP支架。将TSP在25-40kGy的γ射线中灭菌3.5小时并保持在无菌环境中，或使用70％(v/v)的乙醇灭菌15分钟。随后用PBS洗涤3次。

TSP支架的制备

使用Graefe镊子选择TSP薄片(Arcon或TVP)，以具有约200-400μm(每1层)的相似厚度。将薄片在37℃下于5-10ml无菌DDW中温育过夜(在50ml falcon中)。第二天，在非TC10cm平板上的罩(hood)内使用6mm活检穿孔器(biopsy punch)将薄片切成6mm支架。使用Pasteur移液器将支架从活检穿孔器中移除，并转移到具有5ml生长培养基的falcon中。将TSP块在37℃下于DDW中温育过夜。然后使用活检穿孔器将块切成圆柱体(图2A的小图)，并使用小刀切成1mm厚的圆盘(图2)。然后将支架置于5ml生长培养基中。

支架接种

对于单个支架，将2×10⁶个BSC转移至Eppendorf，并在1,500rcf下离心4分钟。同时，将每个支架置于具有50μl生长培养基的非TC六孔板的孔中。离心后，从Eppendorf管中吸出培养基，留下细胞沉淀(团块，pellet)。然后，对于每个Eppendorf，进行以下步骤：(1)用镊子轻轻地挤压支架，从支架上彻底吸出培养基，然后将培养基残留物抽真空；(2)加入7μl凝血酶(PBS中20MHU/ml sigma)和7μ1纤维蛋白原(PBS中15mg/ml sigma)；(3)然后将细胞接种在支架上；(4)将支架在37℃下温育30分钟直至干燥，然后向孔中加入2ml扩增培养基；(5)次日，使用无菌的Graefe镊子将支架转移到新的容器中(例如，具有盖玻片底部的24个非TC孔)，并加入2ml扩增培养基；(6)将支架在37℃和5％CO₂下温育；(7)将支架在扩增培养基中维持7天；(8)每2天更换一次培养基(2ml)；(9)7天后，将扩增培养基替换为BSC分化培养基；和(10)每2天更换分化培养基，持续5天的时间。

细胞培养

在BSC增殖培养基：43.5％DMEM/HEPES(Gibco)、43.5％F-10Nut Mix(Gibco)、10％FBS(HyClone)、1％NEAA(Gibco)、1％GlutaMAX(Gibco)和用50μM ZnCl₂(Millipore)补充的1％青霉素-链霉素-两性霉素B溶液(Biological Industries(Ab/Am,BI))、62ng/ml EGF(R&D系统)、100ng/ml IGF-1(R&D系统)、10ng/ml LIF(R&D系统)和10ng/ml bFGF(R&D系统)中培养牛卫星细胞(BSC)。BSC分化培养基包括用2％FBS和1％Ab/Am补充的DMEM/HEPES。在用10％FBS(HyClone；Thermo Fisher Scientific)、1％非必需氨基酸(BiologicalIndustries)、0.2％β-巯基乙醇(Biological Industries)、和100单位/ml的青霉素与0.1mg/ml链霉素(青霉素链霉素溶液(Penstrep Solution)，Biological Industries，以色列)补充的Dulbecco极限必需培养基(DMEM；Gibco Life Technologies)中培养表达红色荧光蛋白(RFP)的皮肤成纤维细胞(Dermal Fibroblasts)(Lonza,USA)。成肌细胞(美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection))在用10％FBS、2.5％HEPES缓冲液(Biological Industries)和1％青霉素链霉素溶液补充的DMEM中培养。成肌细胞分化培养基包括用2％FBS、2.5％HEPES缓冲液和1％青霉素链霉素溶液补充的DMEM。所有温育均在37℃下于5％(v/v)CO₂湿润气氛中进行。如表3中所描述的培养牛平滑肌细胞(SMC；CellAplications)。在商业培养基(CellApplications)中培养牛主动脉内皮细胞(BAEC；CellApplications)。在具有10％的总FBS的ECM商业培养基(ScienCell)中培养牛骨骼肌微血管EC(BSkMVEC；AngioProteomie)。在商业培养基(FM-2；ScienCell)或在补充有15％FBS的DMEM高葡萄糖培养基中培养牛皮肤成纤维细胞(BDF；Sciencell)。

免疫组织化学

支架在PBS中漂洗两次，然后在4％多聚甲醛(PFA)中于振荡器上固定20分钟。支架在振荡器上用PBS洗涤三次，每次5分钟，然后用0.3％曲拉通(Triton)X-100(Bio Lab Ltd)透化10分钟。接下来，将支架用PBS洗涤三次，5分钟，然后浸入5％牛血清白蛋白(BSA；Millipore)的PBS中中于4℃下过夜。在室温下，将支架与250μ1第一抗体(在PBS中的5％BSA中)一起温育3小时。温育后，将支架用PBS洗涤4次，每次5分钟。然后，将细胞与第二抗体(在PBS中)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，在PBS中1:1000；Vector Laboratories)一起在用锡箔覆盖的板中在振荡器上于室温下温育3小时。在振荡器上用PBS洗涤支架5分钟，并用共聚焦显微镜(LSM 700,Zeiss)成像。

牛主动脉平滑肌细胞(BAMSC)

将四种不同培养基配方对细胞增殖的影响与商业培养基(BSM)进行了比较(表3)。在实验开始时，将细胞处于第8代，并以4,000个细胞/cm²接种在六孔板中。在第3天，用胰蛋白酶处理细胞，用血细胞计数器计数，并以4,000个细胞/cm²重新接种。实验进行了两次，每次条件下使用相同的细胞。单向ANOVA用于检验统计学显著性。

细胞生长动力学

接种大约4×10³个细胞/cm²，并在六天内的每天用血细胞计数器计数。绘制计数值。

细胞染色

用具有15μl亲脂性示踪剂DiD(在无水乙醇中稀释为1mg/ml；#D7757,

USA)的3ml新鲜培养基将支持细胞(BDF或BASMC)染色。用具有5μl亲脂示踪剂DiI(在无水乙醇中稀释为3mg/ml；#D,

USA)的3ml新鲜培养基将牛内皮细胞(BEC；BAEC或BSkMVEC)染色，并在37℃下温育30分钟。在用培养基洗涤一次，然后用PBS再洗涤两次之后，用胰蛋白酶处理细胞，并准备用于下文所述的接种。

在多孔支架上接种细胞

牛EC(1.25×10⁵)和支持细胞(0.25×10⁵)重悬于15mg/ml纤维蛋白原(SigmaAldrich)与20NIHu/ml凝血酶(Sigma Aldrich)的5μl的1:1混合物中。通过在40mM的甘氨酸-tris缓冲液中稀释冻干的人纤维蛋白原(Sigma Chemical)来制备纤维蛋白原溶液。通过在40mM的氯化钙中稀释凝血酶(Sigma Aldrich)来制备凝血酶溶液。然后将共培养悬浮液接种到直径为4mm的圆形PLLA-PLGA多孔支架上，并使其在培养箱(37℃,5％CO₂)中于12孔非组织板中固化30分钟。固化后，向每个孔中添加2ml的补充有另外5％FBS和2nM VEGF的内皮细胞培养基(ECM,ScienCell)。每隔一天更换一次培养基。

为了进一步调节接种在多孔支架上的细胞比例，如上所述的进行细胞接种，并进行以下修改：首先将细胞接种1:1培养基(bEBM,AngioProteomie：支持细胞的商业培养基)，然后将细胞重悬于15mg/ml纤维蛋白原(Johnson and Johnson)与2U/ml凝血酶(Johnsonand Johnson)的5μl的1:1混合物中。

二维牛卫星细胞(BSC)分化

将5×10⁴个BSC(第4代)接种于具有盖玻片底部的TC 24孔板上，重复三次。根据如下肌管形成方案使细胞生长：在生长培养基中4天，并在分化培养基中7天(t＝0是指开始使用分化培养基时的点)。然后在第-1天和第7天对细胞进行Hoechst和成肌蛋白染色。

二维BSC分化的优化

BSC(第4代)在具有不同GF的扩增培养基中生长4天(如下所述)，然后在分化培养基(DMEM-HEPES+2％HS)中生长7天。第0天被定义为将培养基更换为分化培养基的那天。扩增培养基配方包括：(1)对照-生长培养基(不添加GF)；(2)牛成纤维细胞生长因子(bFGF；10ng/ml)；(3)表皮生长因子(EGF；62ng/ml)；(3)胰岛素样生长因子1(IGF-1；100ng/ml)；(4)Pro-LIF；bFGF 10ng/ml,EGF 62ng/ml,IGF-1 100ng/ml、和ZnCl₂50μM)；(6)不依赖GF：Pro-LIF培养基3天，然后用生长培养基洗涤3次(每5分钟)，然后生长培养基1天；(7)用DiI对生长培养基中生长的细胞进行染色——以检验为了示踪细胞而添加的荧光染料DiI是否影响细胞分化。

发明人还检验了GFs:IGF-1、EGF及其组合在分化阶段期间的作用。BSC(第4代)在生长培养基中生长4天，然后在具有不同GF的分化培养基中生长7天(如下所述)。分化培养基的配方包括：(1)对照-原始分化培养基(DMEM-HEPES+2％HS)；(2)IGF-1(100ng/ml)；(3)EGF(62ng/ml)；和(4)IGF-1(100ng/ml)+EGF(62ng/ml)。对于上述所有情况，使用亮场显微镜来可视化细胞。

3D支架上BSC扩增的优化

为此目的，如下设置了重复两次的双因子实验(接种体积和扩增培养基配方)：(1)接种体积和细胞数：(a)10μl接种体积和1×10⁶个BSC；(b)10μl接种体积和2×10⁶个BSC；和(c)20μl接种体积和2×10⁶个BSC。(2)扩增培养基：(a)生长培养基；和(b)Pro-LIF培养基(生长培养基+bFGF+EGF+IGF-1+ZnCl₂)。用DiI将BSC(第4代)染色，然后根据Arcon接种方案将其接种在多孔支架(Arcon)上。

3D支架上BSC分化的优化

为此目的，如下设置了双因子实验(第一周扩增培养基，并且第二周分化培养基)：(1)扩增培养基：(a)对照(生长培养基)；(b)Pro-LIF；和(c)Pro-LIF-bFGF。(2)单独的分化培养基或使分化培养基按如下补充：(a)对照(具有2％马血清的分化培养基)；(b)+IGF-1；(c)+EGF；和(d)+IGF-1+EGF。用DiI将BSC(第4代)染色。用5μl纤维蛋白中的0.5×10⁶个BSC(第4代)接种四(4)mm的多孔支架。在接种后第2、7和14天使细胞成像。然后对支架进行结蛋白染色。根据整装制片染色方案，用第一多克隆抗体1:100山羊α结蛋白(Santa Cruz Cat.编号sc-7559)和第二抗体Alexa 1:200 488驴α山羊(Invitrogen Cat.编号A11055)进行染色。

接种前对牛卫星细胞(BSC)染色

用具有5μl亲脂性示踪剂DiI(在无水乙醇中稀释为3mg/ml，Molecular

USA)的1ml新鲜培养基对BSC染色，并在37℃下温育30分钟。在用培养基洗涤1次，然后用PBS洗涤2次，之后将细胞用胰蛋白酶处理，并准备如所述进行接种。

在PLLA-PLGA上接种细胞

将在有或无牛EC(BEC)以及在有或无支持细胞的情况下的牛卫星细胞(BSC)重悬于15mg/ml纤维蛋白原(Sigma Aldrich)与20NIHU/ml凝血酶(Sigma Aldrich)的6μl的1:1混合物中。通过在40mM的甘氨酸-tris缓冲液中稀释冻干的人纤维蛋白原(SigmaChemical)来制备纤维蛋白原溶液。通过在40mM氯化钙中稀释凝血酶(Sigma Aldrich)来制备凝血酶溶液。然后将细胞的悬浮液接种到直径为4mm的圆形PLLA-PLGA支架上，并使其在培养箱(37℃,5％CO₂)中于12孔非组织板中固化30分钟。固化后，将1ml内皮细胞培养基与BSC生长培养基(Pro-LIF)的1:1混合物添加到每个孔中。每隔一天更换一次培养基。一周后，将培养基更换为BSC分化培养基(用IGF-1和EGF补充)再培养一周。

在组织化大豆蛋白支架上接种细胞

将在有或无牛EC以及有或无支持细胞的情况下的牛卫星细胞(BSC)重悬浮于15mg/ml纤维蛋白原(Sigma Aldrich)与20NIHU/ml凝血酶(Sigma Aldrich)的15μl的1:1混合物中。通过在40mM的甘氨酸-tris缓冲液中稀释冻干的人纤维蛋白原(Sigma Chemical)来制备纤维蛋白原溶液。通过在40mM氯化钙中稀释凝血酶(Sigma Aldrich)来制备凝血酶溶液。然后将细胞的悬浮液接种在直径为6mm的圆形组织化大豆蛋白支架的两侧，并使其在培养箱(37℃,5％CO₂)中于12孔非组织板中固化45分钟。固化后，将1ml内皮细胞培养基与BSC生长培养基(Pro-LIF)的1:1混合物添加到每个孔中。每隔一天更换一次培养基。一周后，将培养基更换为BSC分化培养基(用IGF-1和EGF补充)再培养一周。

如下表所述的测试了两种接种比例和两种类型的内皮细胞(及其适合的培养基)：

表1–在PLLA\PLGA支架上接种

表2–在组织化大豆蛋白支架上接种

将牛卫星细胞(BSC)重悬于15μl的BSC生长培养基中。然后将细胞的悬浮液接种在直径为6mm的圆柱形

支架的两侧，并使其在培养箱(37℃,5％CO₂)中于12孔非组织板中固化30分钟。固化后，将1ml BSC生长培养基(Pro-LIF)添加到每个孔中。每隔一天更换一次培养基。一周后，将培养基更换为BSC分化培养基(用IGF-1和EGF补充)再培养一周。

支架上的细胞生长

接种后一周和两周，使用共聚焦显微镜对接种在PLLA/PLGA和Arcon支架上的DiI标记的BSC进行成像以评估细胞生长。

整装制片免疫荧光染色

接种后两周，将支架用4％多聚甲醛(PFA；Electron Microscopy Sciences)固定20分钟，然后用PBS(

Life Technologies)洗涤3次。透化是通过将支架在室温(RT)下于0.3％Triton X-100(Bio Lab Ltd)中温育15分钟实现的。用PBS洗涤3次后，将支架在封闭缓冲液(PBS中10％FBS、1％(w/v)甘氨酸和0.01％triton)中于4℃下温育过夜。然后将支架与在封闭缓冲液中稀释的第一抗体：1:50山羊抗CD31(Santa Cruz)(在有或无1:50小鼠抗MYH(Santa Cruz)的情况下)在4℃下温育过夜。在用PBS洗涤几次后，在有或无1:300Alexa Flour 647抗小鼠的情况下，将样品与1:400驴抗山羊Alexa

488(JacksonImmunoResearch)、1:50Alexa Flour 647缀合的小鼠抗成肌蛋白(Santa Cruz)和1:1,000DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，Sigma-Aldrich)在室温下温育3小时。在用PBS洗涤几次后，立即使用Zen软件，用Zeiss LSM700共聚焦显微镜(Carl Zeiss)对支架进行成像。使用FIJI软件进行图像处理和进一步分析。PLLA/PLGA支架在接种后一周还进行整装制片免疫荧光染色。

冷冻切片和三色染色

在每个实验结束时，在4℃下使支架于30％(w/v)蔗糖溶液中温育过夜。然后将支架包埋在最佳切割温度(OCT)化合物(Tissue-Tec,USA)中，并将其冷冻以进行随后的冷冻切片。将OCT包埋的支架冷冻切片成5和10μm厚的切片。然后根据三色标准染色方案将5μm厚的切片染色。

实施例1

TSP多孔支架的三维结构分析

使用扫描电子显微镜(SEM)检查了TSP支架，从而分析它们在微米和纳米尺度(级别，scale)两者上的三维(3D)结构。100×图像显示TSP是多孔的，具有100-1,000μm的孔径，其可用于细胞培养。显示出与中型来源的TSP相比，大型TSP中的壁更厚(图3A和3B)。大型TSP的SEM图像(2×10⁵放大率)显示TSP包含30nm球形蛋白簇。对中型TSP的分析显示，这些簇之间有更多无定形胶状物质(图4A和4B)。

实施例2

多孔支架上培养的成纤维细胞的生长和增殖

检查了TSP支架上成纤维细胞的附着和增殖。首先，将50,000个用RFP标记的皮肤成纤维细胞接种到TSP支架上，并进行培养。温育14天后，将用皮肤成纤维细胞填充的TSP支架再接种200,000个内皮细胞，并再温育7天。在成纤维细胞接种后的第8、18和21天，将用细胞填充的TSP样品进行免疫染色并使用共聚焦显微镜成像。结果表明，甚至当以50,000个细胞的低细胞数接种时，成纤维细胞仍增殖并覆盖TSP支架(图5A)。接种内皮细胞后(图5B)，内皮细胞聚集成簇(图5C)。接下来，检查来自每种支架来源的支架和从相对于TSP的表面方向90°切下的支架。用200,000个成纤维细胞接种每种支架，并温育14天。结果表明，成纤维细胞在大型和中型TSP支架上生长和增殖(图6)。这些结果表明，细胞可在培养14天后充满支架。

实施例3

多孔支架上培养的成肌细胞的生长

为评估产生肌肉组织的实用性，进行实验以研究肌肉细胞是否能在TSP支架上生长。

为此目的，将0.5×10⁶个成肌细胞接种在TSP支架上，并在低血清的分化培养基的存在下进行培养，从而使其更适合培养肉的生产。第14天的成肌细胞图像(图7)显示，成肌细胞在TSP支架上增殖，表明细胞可在培养14天后充满支架。

实施例4

TSP上培养的牛骨骼肌细胞的增殖

为评估人类食用的实用性，将牛骨骼肌细胞(bSkMC)接种在TSP支架上。具体地，将0.5×10⁶个bSkMC细胞接种在每种支架上，并在分化培养基的存在下培养。在第14天，使用共聚焦显微镜对细胞成像。图像(图8)显示bSkMC在TSP支架上增殖，表明TSP可适用于培养肉的生产。

实施例5

牛主动脉平滑肌细胞(SMC)的增殖

发明人检查了与商业培养基(BSM；表3)相比的四种不同培养基配方对在下述培养基中接种的SMC的增殖的影响(图9A-9E)。

表3.针对SMC测试的不同培养基的配方

在第3天，在五种不同的培养基中均未能检测到细胞数量的显著差异(图10A)。在随后的实验的第3天(图10B)，观察到四种不同处理之间的显著差异(P<0.01)，并且事后分析揭示，与补充NEAA的培养基和补充15％FBS的培养基相比，暴露于补充丙酮酸盐的培养基的细胞数量明显更高(其中P值分别<0.05和<0.01)。商业培养基与补充丙酮酸钠的培养基之间的差异异略微具有显著性(P＝0.052)。因此，发明人进行了补充丙酮酸钠的培养基(1mM)的BAOSMC培养。

实施例6

在定义条件下BDF和SMC的生长表征

在定义了定制培养基配方后，发明人已经研究了它们在这些条件下的生长动力学(实施例5)。发现BDF(图11A)与BAOSMC(图11B)的生长率高度相似。

实施例7

EC和支持细胞对血管形成的影响

为了测试接种与支持细胞共培养的牛内皮细胞(EC；BAEC——牛主动脉内皮细胞或BSkMVEC——牛骨骼肌微血管内皮细胞)是否增强血管形成和支架覆盖，将BAEC与BDF或BASMC共同接种。确实，将成纤维细胞与成肌细胞和内皮细胞一起共培养已显示提高了工程化肌肉构造的血管形成并促进血管结构随时间的稳定性。发现细胞覆盖了整个支架(图12)。此外，当BAEC被接种与BASMC共培养时(图12A)，发明人注意到EC的染色随时间减少。另外，在此组合的第2天，血管样结构明显。当BAEC被接种与BDF共培养时(图12B)，发明人注意到没有血管样结构。当BSkMVEC被接种与BASMC共培养时(图13A)，发明人注意到BASMC比BSkMVEC多得多。另外，在整个实验期间，在BASMC的存在下(图13A)以及在BDF的存在下(图13B)血管样结构明显。

实施例8

特异性(比，specific)细胞比例提高血管网络形成

为了进一步改进血管网络，发明人用不同比例的牛BAEC与支持细胞(BDF或BASMC)接种。发明人研究了3种不同的比例：1:3、1:1和5:1的EC与支持细胞。发明人清楚地观察到，在BASMC存在的情况下，早在第2天，产生血管的BAEC细胞的自组装(图14-16)。发明人还注意到，到第6天，与第2天相比，EC更少，并且BAEC以1:1的BAEC与BASMC比例产生了血管网络区域。在BDF存在的情况下，BAEC似乎不产生血管(图15)。

实施例9

细胞培养中的牛卫星细胞(BSC)分化

然后，本发明人研究了由BSC形成肌管之前和之后成肌蛋白的表达，并进一步评估了使用DAPI-成肌蛋白进行融合指数(FI)测量的能力。发明人几乎未发现未分化的BSC中成肌蛋白表达的证据(图17)。成肌蛋白的表达主要发生在肌管的核中和肌管周围的某些核中。其显示融合指数(FI)可通过成肌蛋白/Hoechst核计数之比经自动计算得出，融合指数(FI)与手动FI计算相当。此方案还用于肌管形成的定量。

实施例10

细胞培养中的BSC分化的优化

然后，发明人想要优化2D中的BSC分化。发明人核实了在(1)不会在分化阶段期间抑制肌管形成的扩增阶段和(2)在将增加肌管尺寸和FI的分化阶段结束时的过程中，哪些生长因子(GF)可以添加。

在扩增阶段之后和在分化阶段之前，自发的肌管出现在不含bFGF的样品中(图18)，表明bFGF抑制了肌管的形成。EGF、IGF-1和DiI似乎不影响肌管形成。在IGF-1、Pro-LIF和无依赖时，出现细胞密度增加。在分化的第4天，发明人观察到在bFGF和Pro-LIF培养条件下总肌管的增加。bFGF维持了BSC的干细胞特性(stemness)，并且一旦去除，细胞就突然分化(图19)。在分化的第7天，发明人观察到与其他测试条件相比，在对照、无依赖和DiI中的高肌管面积(图20)。发明人得出结论，在肌管形成和细胞死亡之间存在细微的界限。因此，细胞应在含有bFGF(单独或与Pro-LIF一起)的扩增培养基中生长，直至达到汇合(confluency)，然后转移至分化培养基中持续2-5天时间的短时期。当将IGF-1或IGF-1和EGF添加到细胞培养基中时，进一步显示了出肌管的高丰度。

实施例11

多孔支架上的BSC扩增的优化

由于先前实验显示多孔支架上细胞覆盖率低，因此发明人然后试图将TSP支架上的BSC覆盖率提高60％以上。因此，将GF添加到扩增阶段，并增加了接种时的初始细胞数。细胞覆盖面积的定量显示，用补充有GF(即，Pro-LIF)的生长培养基培养的细胞覆盖了72±15％的支架，而仅在生长培养基上培养的细胞覆盖了大约18％的支架(图21)。发现两种处理之间的差异在统计学上具有显著性(P值＝0.0009)。

实施例12

多孔支架上BSC分化的优化

为了找到在3D支架上形成肌管的最佳条件，发明人扫描了扩增培养基与随后分化培养基的多种组合。在无GF的分化培养基中形成的肌管(图22A、E和I)小且圆。向分化培养基中添加IGF-1导致肌管——这在生长培养基中很少见到(图22B)，常见于Pro-LIF-bFGF(图22J)并且在Pro-LIF培养基中产生丰富的肌管(图22F)。将EGF添加到分化培养基在所有扩增培养基中导致肌管(图22C、G和K)。添加IGF-1+EGF在生长培养基(图22D)和Pro-LIF-bFGF(图22L)中导致肌管，并且在Pro-LIF(图22H)中产生丰富的肌管。

实施例13

三培养提高BSC的增殖、伸长、和在多孔支架上的覆盖率

然后，发明人想要研究BSC与恒定量的平滑肌细胞(SMC)和不同量的骨骼微血管内皮细胞(SkMVEC)(分别为2:1:1和2:1:5)的三培养对BSC存活、增殖和肌管分化(分化标志物——成肌蛋白呈阳性)的影响。发明人观察到，与在以较高浓度的SkMVEC(2:1:5；图28)温育时的BSC外观相比，在低SkMVEC浓度(2:1:1)下，BSC看起来更伸长。发明人还观察到，与包含BSC的单一培养物或共培养物(对照)相比，BSC增加了其在多孔支架上的覆盖率，并且看起来更加分化。发明人得出的结论是，与其他测试组相比，三培养物在两种温育比例方面均更好地支持了BSC的增殖和分化，并将BSC的分化潜力进行如下总结：单独的BSC<BSC+EC<BSC+SMC<BSC+EC+SMC(图23-26和28)。发明人还在BSC+SMC+SkMVEC(2:1:1)的三培养物中观察到了细胞外基质(ECM)的分泌(图27A-27B)。

实施例14

三培养提高了组织化大豆蛋白支架上的BSC分化

然后，发明人想要研究BSC与恒定量的平滑肌细胞(SMC)和骨骼微血管内皮细胞(SkMVEC)(分别为2:1:1)的三培养对BSC存活、增殖和肌管分化(分化标志物——成肌蛋白呈阳性)的影响。发明人观察到，BSC不仅在被接种与SMC共培养或与SMC和BEC三培养时提高了其在TSP支架上的覆盖率，而且与单一培养(仅BSC)或共培养(BSC与BEC一起；图29)相比看起来也更加分化。

实施例15

在不添加固化凝胶的情况下接种BSC

然后，发明人想要研究在不添加固化剂(例如，血纤蛋白)的情况下，将BSC接种在FDA批准的基于胶原的支架

上的效果。发明人观察到成功的BSC分化——正如肌管形成所证明的(图30)。

尽管已经在本文中示例和描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将想到许多修改、替换、改变、以及等同物。因此，应理解，所附权利要求旨在涵盖落入本发明的真实精神内的所有此类修改和改变。

Claims

1.生产可食用组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a.温育三维多孔支架和多种细胞类型，所述多种细胞类型包括：(i)成肌细胞或其祖细胞；和以下中的至少一种：(ii)至少一种类型的分泌细胞外基质(ECM)的细胞；或(iii)内皮细胞或其祖细胞，其中所述成肌细胞或其祖细胞与所述内皮细胞或其祖细胞以范围在10:1至1:10之间的比例温育；和

b.诱导成肌细胞或其祖细胞分化成肌管，

从而产生所述可食用组合物。

2.权利要求1所述的方法，其中所述多种细胞类型包括成肌细胞或其祖细胞、至少一种类型的分泌细胞外基质(ECM)的细胞、和内皮细胞或其祖细胞。

3.权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述分泌ECM的细胞选自：基质细胞、成纤维细胞、周细胞、平滑肌细胞及其祖细胞。

4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述多种细胞类型包括成肌细胞、分泌ECM的细胞和内皮细胞。

5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述成肌细胞的祖细胞是卫星细胞。

6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述内皮细胞选自骨骼微血管内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、或其组合。

7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述多种细胞类型包括卫星细胞、分泌ECM的细胞、和内皮细胞。

8.权利要求7所述的方法，其中所述成肌细胞或其祖细胞与分泌ECM的细胞以范围在10:1至1:1之间的比例温育。

9.权利要求7所述的方法，其中所述分泌ECM的细胞与内皮细胞以范围在1:10至1:1之间的比例温育。

10.权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述卫星细胞、所述分泌ECM的细胞、和所述内皮细胞以范围在10:1:1至2:1:10之间的比例温育。

11.权利要求7至10中任一项所述的方法，其中所述分泌ECM的细胞是成纤维细胞、其祖细胞、或其组合。

12.权利要求1所述的方法，其中所述三维多孔支架选自：组织化蛋白质、非组织化蛋白质、和多糖。

13.权利要求12所述的方法，其中所述组织化蛋白质是组织化大豆蛋白。

14.权利要求12或13中任一项所述的方法，其中所述三维多孔支架包含平均直径范围在20至1,000微米的孔。

15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述多种细胞类型是非人类细胞。

16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述多种细胞来源于牲畜哺乳动物。

17.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述成肌细胞或其祖细胞与所述三维多孔支架以范围在10³至10⁷个所述成肌细胞或其祖细胞与10mg所述三维多孔支架的比例进行温育。

18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述三维多孔支架还包含细胞外基质。

19.组合物，其包含：

a.三维多孔支架；

b.每mm³所述三维多孔支架包含100,000-250,000个肌管核的肌管；和

c.选自以下的多种细胞类型：(i)成肌细胞或其祖细胞；和以下中的至少一种：(ii)至少一种类型的分泌ECM的细胞；或(iii)内皮细胞或其祖细胞，其中所述内皮细胞或其祖细胞占所述多种细胞的少于15％。

20.权利要求19所述的组合物，其中所述多种细胞类型包括成肌细胞或其祖细胞、至少一种类型的分泌细胞外基质(ECM)的细胞、和内皮细胞或其祖细胞。

21.权利要求19或20中任一项所述的组合物，其中所述成肌细胞的祖细胞是卫星细胞。

22.权利要求19至21中任一项所述的组合物，其中所述多种细胞类型包括卫星细胞、分泌ECM的细胞、和内皮细胞。

23.权利要求19至22中任一项所述的组合物，其中所述分泌ECM的细胞是成纤维细胞、其祖细胞、或其组合。

24.权利要求19至23中任一项所述的组合物，其中所述三维多孔支架选自：组织化蛋白质、非组织化蛋白质、和多糖。

25.权利要求24所述的组合物，其中所述组织化蛋白质是组织化大豆蛋白。

26.权利要求19或25中任一项所述的组合物，其中所述三维多孔支架包含平均直径范围在20至1,000微米的孔。

27.权利要求19至26中任一项所述的组合物，其中所述多种细胞类型是非人类细胞。

28.权利要求19至27中任一项所述的组合物，其中所述多种细胞来源于牲畜哺乳动物。

29.权利要求19至28中任一项所述的组合物，其中所述三维多孔支架还包含细胞外基质。

30.权利要求19至29中任一项所述的组合物，其中所述组合物是可食用的。