KR20210026990A - 중간엽줄기세포의 조정 배지 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 개과 동물의 정액 동결보존용 조성물 - Google Patents

중간엽줄기세포의 조정 배지 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 개과 동물의 정액 동결보존용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중간엽줄기세포의 조정 배지 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 개과 동물의 정액 동결보존용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 동결보존용 조성물은 개과 동물의 정액에 대해 동결융해 후에 정자의 운동성, 생존율, 정자막 안정성 및 점액질 통과능을 향상시키는 효과가 우수하므로, 개과 동물의 종 개량 또는 혈통 보존 등을 위한 체외 번식기술에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

중간엽줄기세포의 조정 배지 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 개과 동물의 정액 동결보존용 조성물{Composition for cryopreservation of Canidae sperm comprising exosomes derived from conditioned media of mesenchymal stem cell as effective component}
본 발명은 중간엽줄기세포의 조정 배지 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 개과 동물의 정액 동결보존용 조성물에 관한 것이다.
정자의 동결과 저온 보관은 가축 등의 보존과 번식에 유용하며 생명공학 분야에서 활발히 연구되고 있는 분야이다. 동결보존시 정자는 세포 내 빙정(ice crystal) 형성, 삼투압의 차이 그리고 저온 스트레스에 의해 손상을 받게 되는데, 이러한 손상을 감소시키는 물질이 동결보존제이며, 대표적인 물질로는 글리세롤(glycerol)과 DMSO(dimethyl sulfoxide)가 있다. 동결과정에 쓰이는 원정액은 농도가 높기 때문에 희석액을 사용하여 희석해야 하며, 희석과정 중에 동결보존제가 희석액과 함께 투여된다. 개의 경우에는 동결정액을 이용한 인공수정이 다른 산업동물에 비해 산업적으로 잘 이루어지지 않고 있으며, 그 성공 효율도 매우 낮은 편이다. 이는 개에서 정자 채취시 동결정액의 제조를 위한 충분한 수의 정자가 채취되지 않고, 동결에는 취약하기 때문이다.
인간을 포함한 다세포 생명체 내에 존재하는 다양한 세포에서는 '엑소좀(exosome)'이라는 나노 크기의 소포체를 분비하는 것으로 알려졌다. 엑소좀은 세포막과 동일한 막 구조의 소낭체로, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질 RNA를 전달하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 줄기세포에서 분비되는 엑소좀은 줄기세포가 분비하는 다양한 성장인자와 사이토카인을 함유하고 있어, 조직 재생에 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 또한 엑소좀은 추출하는 과정에서 세포 배양액 내 세포 노폐물, 항생제, 혈청 등 불순물이 제거되므로, 세포 배양액의 효과와 동등하면서 안전하게 사용 가능한 장점이 있다.
이에 본 발명에서는 기존의 화학 약품 및 난황을 이용한 정자의 동결보존 방법이 아닌, 다양한 세포의 유익한 성분을 배출하고 분화능이 뛰어난 개 유래 지방줄기세포의 조정배지로부터 추출한 엑소좀을 이용하여 동결보존 효율이 높은 개 정액 동결보존용 조성물을 개발하였다.
한편, 한국공개특허 제2018-0119924호에는 '중간엽 줄기세포 배양액을 포함하는 세포 또는 조직의 동결보존용 조성물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2002-0085081호에는 '소형견 채취 정액 및 수정란의 동결보존 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 중간엽줄기세포의 조정 배지 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 개과 동물의 정액 동결보존용 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 개의 지방조직 유래 중간엽줄기세포를 배양하여 수득한 조정 배지로부터 엑소좀을 추출하였고, 상기 엑소좀을 다양한 농도로 함유한 개 정액 동결보존제를 사용하여 개의 정액을 동결시킨 후 다시 융해시킨 결과, 엑소좀을 포함하지 않는 동결보존제를 이용한 무처리 대조군에 비해 50 ㎍/㎖의 엑소좀을 포함하는 동결보존제를 이용한 실험군에서 동결-융해된 정자의 운동성과 생존율, 정자막 안정성 및 점액질 통과능이 증가된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)의 조정 배지 유래 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 개과(Canidae) 동물의 정액 동결보존용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 동결보존용 조성물에 개과(Canidae) 동물의 정액을 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 동결 및 보존하는 단계;를 포함하는, 개과 동물 정액의 동결보존방법을 제공한다.
본 발명의 동결보존용 조성물은 개과 동물의 정액을 냉각 및 동결 보존한 후에도 정자의 운동성, 생존율, 정자막 안정성 및 점액질 통과능을 향상시키는 효과가 우수하므로, 개과 동물의 종 개량 또는 혈통 보존 등을 위한 체외 번식기술에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 개의 지방조직 유래 중간엽줄기세포(Ad-MSCs) 조정 배지(conditioned medium)로부터 추출한 엑소좀의 전자현미경 관찰 사진이다.
도 2는 에오신-니그로신(eosin-nigrosin) 염색을 수행하여 생존한 정자(a)와 사멸한 정자(b)를 확인한 현미경 사진이다. 하얀색 화살표: 생존한 정자, 하얀색의 화살촉 모양: 사멸한 정자.
도 3은 FITC-PNA(fluorescein isothiocyanate-conjugated peanut agglutinin) 항체를 이용한 형광 염색을 수행하여 온전한 첨체(acrosome)를 가진 정자(a)와 손상된 첨체를 가진 정자(b)를 확인한 형광이미지이다(관찰배율 1,000×). 하얀색 화살표 : 온전한 첨체, 화살촉 모양 : 손상된 첨체.
도 4A는 CMA3(Chromomycin A3) 염색을 수행하여 프로타민(protamine)이 결여된 정자(a)와 정상 정자(b)를 확인한 형광이미지이다(관찰배율 1,000×). 도 4B는 프로타민 결여 정자를 정량화한 그래프이다(p < 0.05).
도 5는 엑소좀을 추가하지 않은 동결보존제로 동결-융해한 개 정자(control)와 50㎍/㎖의 엑소좀을 추가한 동결보존제로 동결-융해한 정자에서 세포막 복구 관련 유전자(ANX 1, FN 1, DYSF) 및 핵의 복구 기작과 관련된 유전자(H3, HMGB, ROMO 1)들의 발현 수준을 실시간 RT-qPCR로 확인한 결과이다(p < 0.05). ANX 1: annexin 1, FN 1: fibronectin, DYSF: dysferlin, H3: histone H3, HMGB: high mobility group protein B, ROMO 1: mitochondrial ROS modulator.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell) 조정 배지 유래 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 개과(Canidae) 동물의 정액 동결보존용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 용어 '동결보존(cryopreservation)'은 다양한 종류의 세포를 초저온 상태에서 보관하여 세포의 생명활동을 일시적으로 중단시킨 후 필요할 때 해동하여 사용할 수 있도록하는 방법을 의미한다.
또한, 용어 '중간엽줄기세포'는 줄기세포능(stemness)과 자기재생능(self-renewal)을 유지하고, 다양한 간엽조직으로 분화할 수 있는 능력(plasticity)이 있는 세포를 의미한다. 본 발명의 조성물에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 지방조직, 뇌, 간, 폐, 제대혈, 태아혈, 신장, 태반 또는 골수로부터 유래한 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 지방조직(adipose tissue) 유래 중간엽줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 '조정 배지(conditioned medium, CM)'란, 세포를 세포분열 최성기인 대수성장기에 도달했을 때 무혈청 배지로 교환한 후 배양액만 수거한 배지를 의미한다. 용어, '배양액(culture media)'은 체외(in vitro)에서 세포들의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하며, 세포 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 본 발명의 배양액은 개의 지방조직 유래 중간엽줄기세포의 배양에 사용한 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 목적상 상기 배양액은 무혈청 배지(serum-free media)일 수 있다. 일반적으로, 혈청은 생체 외에서 세포를 배양하는 경우 배양 배지에 필수적으로 첨가되는데, 혈청 성분은 동물 유래 바이러스 또는 감염성 프리온 등의 감염 우려가 있으므로, 본 발명의 배양액은 혈청을 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 개과 동물의 정액 동결보존용 조성물에 있어서, 상기 조정 배지는 개의 지방조직 유래 줄기세포를 세포 배양 접시 면적의 80~90%까지 배양한 후, 배양 배지를 제거하고 줄기세포를 세척한 후, 무혈청 배지로 교체하여 48시간 동안 배양하여 수득한 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 용어 '엑소좀(exosome)'은 지질-이중층으로 구성된 소포(vesicle)로, 세포가 세포 외로 분비하는 물질의 구성체를 의미한다. 엑소좀은 세포-세포 간의 커뮤니케이션(cell-cell communication) 및 세포성 면역을 중재하는 기능적인 역할을 수행하기 위해, 세포 내의 생체분자인 단백질, 생체활성 지질 및 RNA(miRNA)를 수송(운반)하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 한편, 중간엽 줄기세포로부터 분비된 엑소좀은 세포-세포 커뮤니케이션에 관여하고 줄기세포가 가지는 재생의학적인 치료 효능을 보인다고 알려져 있다. 또한 엑소좀은 추출하는 과정에서 세포 배양액 내 세포 노폐물, 항생제 등의 불순물이 제거되므로, 안전하게 사용 가능하다.
본 명세서에서, 용어 '정액'은 수컷 동물의 생식 기관을 통해 배출된 액체를 의미하는 것으로, 정자를 비롯하여 정자의 운동성을 위한 영양물질과 완충물질을 포함하고 있다.
본 발명의 동결보존용 조성물에 있어서, 상기 개과 동물은 개, 늑대, 여우, 재칼, 코요테, 승냥이 또는 너구리일 수 있고, 바람직하게는 개일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 동결보존용 조성물은 중간엽줄기세포의 조정배지 유래 엑소좀을 동결보존용 조성물의 단위부피 ㎖ 당 25 내지 100 ㎍ 농도로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 단위부피 ㎖ 당 40 내지 60 ㎍ 농도로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 단위부피 ㎖ 당 50 ㎍ 농도로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 동결보존용 조성물은 트리스하이드록시메틸아미노메탄[Tris(hydroxymethyl)aminomethane], 시트르산, 프럭토스, 카나마이신, 난황 및 글리세롤로 이루어진 희석액을 추가로 포함할 수 있으며, 특별히 이에 제한되지 않고, 당류, 유기산, 난황, 항생제 등을 포함하는 희석액(완충액)을 사용할 수 있다. 예를 들어, 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 덱스트란 등의 당류; 시트르산, 아세트산, 부티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산 등의 유기산; 스트렙토마이신, 페니실린, 앰피실린, 카나마이신 등의 항생제; 및 난황을 포함하는 희석액(완충액)을 사용할 수 있으며, 이들 각 성분은 당업자가 필요에 따라 조합하여 사용할 수 있다. 상기 희석액은 원 정액의 농도를 저하시키고 동결보존시 정자간의 충돌로 인하여 발생할 수도 있는 손상을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명에 따른 동결보존용 조성물은 개과 동물의 정액을 동결하는 과정에서 발생하는 정자세포의 손상을 최소화함으로써, 동결 및 융해된 정액 내 정자의 운동성, 생존율 및 정자막 안정성을 향상시키고, 점액질 통과능을 향상시키는 효과가 있다.
본 발명은 또한,
(1) 상기 동결보존용 조성물에 개과 동물의 정액을 혼합하는 단계; 및
(2) 상기 혼합물을 동결 및 보존하는 단계;를 포함하는, 개과 동물 정액의 동결보존방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 동결보존용 조성물은 전술한 것과 같다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 동결보존방법은 더욱 구체적으로는,
개과 동물의 정액을 채취하는 단계;
상기 채취된 정액을 원심분리하여 상층액을 제거하고, 트리스하이드록시메틸아미노메탄, 시트르산, 프럭토스, 카나마이신 및 증류수를 포함하는 1차 희석액(완충액)을 첨가한 후 재원심분리하여 상층액을 제거하고 침전물을 수득하는 단계;
상기 수득된 침전물을 1차 희석액으로 재현탁시켜 정자의 수가 단위부피 ㎖ 당 1.8×108 내지 2.2×108개가 되도록 희석시키는 단계;
상기 희석액에 중간엽줄기세포 조정 배지 유래 엑소좀, 난황 및 글리세롤을 포함하는 2차 희석액을 첨가하여 정자의 수가 단위부피 ㎖ 당 0.8×108 내지 1.2×108개가 되도록 희석한 후 냉각하여 동결된 정액을 수득하는 단계;를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 동결 및 보존 방법은 정액을 동결보존할 수 있는 한 공지된 모든 수단에 의해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 액체질소를 사용하여 초저온에서 동결 및 보존될 수 있고, 상기 동결된 정액은 반영구적으로 보존될 수 있다. 상기 동결보존된 개과 동물의 정액을 융해시키는 방법은 동결보존된 정액을 정상상태로 회복시킬 수 있다면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 개 지방줄기세포 배양 및 엑소좀 분리
개의 지방조직 유래 중간엽줄기세포(adipose tissue derived mesenchymal stem cells, 이하 Ad-MSCs)와 상기 줄기세포 배양용 배지(AMSC 배지)는 ㈜네이처셀로부터 공급받아 사용하였다. 동결된 Ad-MSCs를 37℃의 항온수조 안에서 해동시킨 후 AMSC 배지에서 재부유시키고 세척하였다. 세척 후 Ad-MSCs의 증식이 배양 플레이트 면적의 80~90% 정도 도달할 때까지 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 그 후, 상기 배양배지를 제거하고 phosphate buffered saline (PBS)으로 세척한 후, 혈청이 포함되어 있지 않은 Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM) 배지로 교체한 후 48시간 동안 배양하였다. 상기 DMEM 배지를 회수하여 원심분리하고 Total Exosome Isolation Reagent(catalog no. 4478359, Invitrogen, 미국)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 상층액에서 엑소좀(exsome)을 추출하였다. 추출한 엑소좀은 1% aqueous uranyl acetate로 염색하여 전자현미경으로 관찰하여 확인하였다(도 1).
2. 정액 채취 및 동결보존 준비
비글(Beagle) 품종에서 수지마찰법을 이용하여 주 2회 빈도로 정액을 채취하였다. ㎖ 당 1억 개 이상의 정자가 포함되어 있으면서 70% 이상의 운동능과 80% 이상의 생존능을 가지고 정상적인 형태를 가진 정자가 포함되어 있는 정액만 모아서 실험에 사용하였다. 모은 정액을 상온에서 100 xg로 1분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 1차 희석액(4 g/L Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 14 g/L citric acid, 8 g/L fructose 및 0.15 g/L kanamycin sulfate in distilled water(pH 6.6, 290 mOsm))를 상기 정액과 동일한 양으로 정액에 첨가 후 700 xg로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 버린 후 ㎖ 당 정자의 수가 2억 개(2×108)가 되도록 1차 희석액을 첨가하였고, 2차 희석액(54%(v/v) 1차 희석액, 40%(v/v) 난황 및 6% 글리세롤)를 동량으로 첨가하여 ㎖ 당 정자의 수가 1억 개(1×108)가 되도록 하여 펠렛을 풀어주었다. 이때, 2차 희석액에 엑소좀을 첨가하지 않은 군을 대조군, 2차 희석액에 25, 50 또는 100 ㎍/㎖의 엑소좀이 첨가된 군을 실험군으로 설정하였다. 2차 희석액은 30초 간격으로 최종 볼륨의 14%, 19%, 27%, 40%의 양으로 나누어 첨가하였다. 엑소좀 첨가를 제외하고 상기 1차 및 2차 희석액이 혼합된 상태의 용액을 이하 '정액 동결보존제'로 지칭한다.
3. 정액 동결 및 융해
상기 대조군 및 실험군을 동결 보존용기인 straw 0.25 ㎖에 각각 로딩한 후 straw를 4℃에서 1시간 동안 정치시키고, 액체질소 위 2cm 지점에서 15분 동안 정치시켜서 평형상태를 만든 후 액체질소에 넣어서 보관하였다. 일주일 후 동결 정액을 37℃의 항온수조기에 30초 동안 넣어 융해하였다. 1차 희석액으로 1:5로 희석하였는데, 이 때 1차 희석액은 최종 볼륨의 14%, 19%, 27%, 40%의 양으로 나누어 첨가하였다.
4. 정자 운동능 분석
회수한 정액 10 ㎕를 따뜻한 정액 분석용 유리 챔버에 올리고 유리 덮개로 덮었다. 유리 챔버를 컴퓨터와 연결된 현미경에 올린 후 정액자동분석기(sperm analysis imaging system; FSA2011 premium edition version 2011)를 사용하여 5개의 영역에서 200개의 움직이는 정자를 스크리닝하는 방법으로 운동능을 분석하였다.
5. 정자 생존능 분석
따뜻한 슬라이드 글라스 위에서 5~10 ㎕의 회수한 정액과 동량의 에오신-니그로신(eosin-nigrosin) 염색 시약을 혼합하고 상기 혼합물을 새로운 슬라이드 글라스에 얇게 펴서 공기 중에서 건조시킨 후 슬라이드 글라스마다 200개의 정자를 세어 정자막이 온전한 정자(도 2a)와 정자막이 온전하지 않은 정자(도 2b)로 분류하였다.
6. 정자의 세포막 완전성(integrity) 분석
회수한 정액 50 ㎕를 500 ㎕의 저삼투성 팽창(hypo-osmotic swelling) 용액(190 mOsmol/kg)과 혼합하고 37℃에서 30분간 정치시켰으며, 그 중 5 ㎕를 위상차현미경(phase-contrast microscope)을 사용하여 200개의 정자를 세었고, 세포막이 온전하고 꼬리가 말린 정자와 그렇지 않은 정자로 분류하였다. 또한, FITC-PNA(fluorescein isothiocyanate-conjugated peanut agglutinin) 항체를 이용한 형광 염색을 통해 정자의 첨체(acrosome) 형태를 확인하였고, CMA3(Chromomycin A3) 염색을 수행하여 정자의 핵 단백질인 프로타민(protamine)의 결여 유무를 확인하였다.
7. 점액질 통과능 분석
대리모 점액질(합성 난관액)을 편평한 모세혈관 튜브(80 ± 0.5 mm 길이, 1.25 ± 0.05 mm 너비)에 넣고 이를 수직으로 15분간 정치하여 안에 있는 기포를 제거한다. 이후 이 모세혈관 튜브를 100 ㎕의 정액이 들어있는 에펜도프 튜브에 담고 수직으로 2시간 동안 정치한 후 1-3 cm 높이까지 도달한 정자의 수를 구하여 비교하였다.
8. 유전자 발현 분석
동결-융해된 정자에 Trizol reagent를 사용하여 총 RNA를 추출하였고, Maxime RT PreMix를 사용하여 cDNA를 합성하였다. RT-qPCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction)은 액틴(ACTB) 유전자 대비 세포막 회복 관련 유전자(ANX1, FN 1 및 DYSF)와 염색질 회복 관련 유전자(H3, HMGB 및 ROMO 1)의 발현을 Step One Plus Real-Time PCR System을 사용하여 분석하였다. 상기 유전자들의 프라이머 서열 정보는 하기 표 1과 같다.
프라이머 서열 정보
유전자명 프라이머 서열(5'→3') (서열번호)
ANX1 F: GAAGCTCTGAAGAAAGCCC (1)
R: GTGTCTTCATCAGTTCCAAGG (2)
FN1 F: ATAGCTGGCTGTTACGAC (3)
R: GCATTTCCCAGGTAGGTG (4)
DYSF F: TGGATCAGAGTGGCGTCC (5)
R: GACAGCAGCTTTCTGGCT (6)
H3 F: CGGTGACTGACACGCGAC (7)
R: GTTGGAGCAGGCCTTGAACC (8)
HMGB F: ATATTGCTGCGTACCGAG (9)
R: TCAGCCTTGACAACTCCC (10)
ROMO 1 F: CTACGTGCTCCCGGAAGT (11)
R: TCGCTCAGTTCTACGTCTCAC (12)
9. 통계 분석
모든 값은 평균±표준편차로 표기하였고, p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다. ANOVA(One-way analysis of variance)와 Tukey's Multiple Comparison Test를 사용하여 대조군과 실험군을 비교하였다. One sample t-test를 사용하여 대조군과 실험군 간의 단백질 발현 분석을 비교하였다. 모든 결과는 SPSS 21.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
실시예 1. 개 정자 동결보존을 위한 최적의 엑소좀 농도
동결-융해된 개 정자의 운동성 및 생존성을 향상시기 위한 최적의 엑소좀 농도를 확인하기 위해, 정액 동결보존제의 단위부피(㎖) 당 개 지방조직 유래 중간엽줄기세포 조정 배지로부터 수득한 엑소좀을 25, 50 또는 100 ㎍/㎖의 농도로 각각 첨가하여 개 정자 세포를 4℃에서 4시간 정치한 후, 정자의 운동성(motility, %), 직진성(linearity, %), 선형성(straightness, %), 머리진폭(ALM, ㎛) 및 생존율(live sperm, %)을 분석하였다. 그 결과, 동결보존제의 ㎖ 당 엑소좀을 50 ㎍/㎖의 농도로 첨가한 경우 정자의 운동성 및 생존율이 가장 우수함을 확인하였다(표 2).
Figure pat00001
실시예 2. 엑소좀의 개 정자 동결보존 효과 분석
최적 농도의 엑소좀을 동결보존제에 추가한 후 개 정자를 동결시키고, 다시 융해한 후 정자의 운동성(motility, %), 직진성(linearity, %), 선형성(straightness, %), 머리진폭(ALM, ㎛), 생존율(live sperm, %) 및 세포막 완전성(membrane integrity, %)을 측정하였다. 그 결과, 엑소좀을 추가하지 않은 동결보존제를 이용한 대조군에 비해, 엑소좀을 추가한 동결보존제를 이용한 실험군에서 정자의 운동성, 머리진폭(ALM), 생존율 및 세포막 완전성이 유의성있게 높은 것을 확인하였다(표 3).
Figure pat00002
정자에는 프로마틴(protamine)이라고 하는 독특한 염기성 핵단백질이 존재한다. 본 발명자는 CMA3(Chromomycin A3) 염색을 수행하여 엑소좀 첨가 유무에 따른 동결-융해된 정자의 세포막 완전성을 분석하였다. 세포막이 완전하지 않은 즉, 손상된 정자는 CMA3가 프로타민과 결합하여 형광을 나타내며, 세포막이 완전한 정상의 정자는 CMA3 결합에 따른 형광이 확인되지 않는 원리를 이용한 것이다. CMA3 염색 결과, 최적 농도의 엑소좀을 첨가한 동결보존제를 사용한 실험군에서 대조군(엑소좀 무첨가)에 비해 CMA3에 염색되는 정자의 수가 적은 것을 확인할 수 있었다(도 4).
또한, 최적 농도의 엑소좀을 동결보존제에 추가한 후 개 정자를 동결시키고 다시 융해한 후 정자의 점액질 통과 능력을 분석한 결과, 엑소좀을 추가한 동결보존제를 이용하여 동결융해한 실험군의 정자가 대조군의 정자와 비교하여 점액질 통과 능력이 우수한 것으로 확인되었다(표 4).
Figure pat00003
상기 결과를 통해, 본 발명의 개의 지방조직 유래 중간엽줄기세포의 조정 배지로부터 유래한 엑소좀은 개의 정액을 위한 효과적인 동결보호제(cryoprotectant)로서 기능할 수 있음을 알 수 있었고, 개 인공수정 산업 분야에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단되었다.
실시예 3. 동결-융해된 정자의 세포막과 염색질 회복에 관한 기전 분석
최적 농도의 엑소좀이 첨가된 정액 동결보존제를 사용하여 동결-융해된 정자의 세포막과 염색질 회복에 관한 기전 분석을 분석하기 위해, 동결보존제에 엑소좀이 첨가되지 않은 무처리 대조군과 동결보존제 ㎖ 당 50 ㎍/㎖의 엑소좀을 추가한 실험군에서 세포막 회복 관련 유전자(ANX 1, FN 1, DYSF) 및 염색질 회복 기작과 관련된 유전자(H3, HMGB, ROMO 1)의 발현 수준을 RT-qPCR로 확인한 결과, 엑소좀이 첨가된 동결보존제를 사용한 실험군은 대조군에 비해 ROMO 1 유전자를 제외한 모든 유전자의 발현이 유의적으로 높을 것을 확인하였다(도 5).
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Claims (7)

  1. 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)의 조정 배지 유래 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 개과(Canidae) 동물의 정액 동결보존용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 개의 지방조직 유래 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 개과 동물의 정액 동결보존용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 개과 동물은 개, 늑대, 여우, 재칼, 코요테, 승냥이 및 너구리로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 개과 동물의 정액 동결보존용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 동결보존용 조성물의 단위부피 ㎖ 당 25 내지 100 ㎍으로 포함되는 것을 특징으로 하는 개과 동물의 정액 동결보존용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 동결보존용 조성물은 트리스하이드록시메틸아미노메탄, 시트르산, 프럭토스, 카나마이신, 난황 및 글리세롤을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 개과 동물의 정액 동결보존용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 동결보존용 조성물은 개과 동물 정자의 운동성, 생존율, 정자막 안정성 및 점액질 통과능을 향상시키는 것을 특징으로 하는 개과 동물의 정액 동결보존용 조성물.
  7. (1) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 동결보존용 조성물에 개과(Canidae) 동물의 정액을 혼합하는 단계; 및
    (2) 상기 혼합물을 동결 및 보존하는 단계;를 포함하는, 개과 동물 정액의 동결보존방법.
KR1020190136934A 2019-08-29 2019-10-30 중간엽줄기세포의 조정 배지 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 개과 동물의 정액 동결보존용 조성물 KR102235332B1 (ko)

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