WO2024096009A1

WO2024096009A1 - 精子処理用組成物、精子運動性改善剤、精子受精能保持剤、精子運動性改善方法及び精子受精能保持方法

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Publication number: WO2024096009A1
Application number: PCT/JP2023/039262
Authority: WO
Inventors: 昌之島田; 崇梅原; 格靖石川; 崇史瀧尻
Original assignee: 国立大学法人広島大学; ロート製薬株式会社
Priority date: 2022-11-01
Filing date: 2023-10-31
Publication date: 2024-05-10

Abstract

本発明は、運動性の高い精子を提供することを目的とする。本発明は、エクソソームを含む精子処理用組成物である。本発明の精子用処理組成物は、精子調整液、精子希釈液、精子保存液、人工授精溶液、体外受精溶液、精子運動性改善用溶液、又は精子受精能保持用溶液として用いられる。

Description

精子処理用組成物、精子運動性改善剤、精子受精能保持剤、精子運動性改善方法及び精子受精能保持方法

　本発明は、精子処理用組成物、精子運動性改善剤、精子受精能保持剤、精子運動性改善方法及び精子受精能保持方法に関する。

　「不妊」とは、妊娠を望む健康な男女が避妊をしないで性交をしているにもかかわらず、一定期間妊娠しないものをいい、日本産科婦人科学会では、この「一定期間」を「１年というのが一般的である」と定義している。不妊のカップルは約１０組に１組と言われているが、近年、妊娠を考える年齢が上昇しており、男女とも加齢により妊娠が起こりにくくなることが知られているため、この割合はもっと高いとも言われている。

　不妊の原因は、男性側、女性側、あるいはその両方にある場合、原因不明の場合があるが、全体の約半数で男性側にも原因があると言われている。このような男性側の不妊の原因として、造精機能障害、精路通過障害、勃起障害（ＥＤ）、膣内射精障害などの性機能障害、加齢などが知られている。なお、男性は、３５歳ごろから徐々に精子の質の低下が起こると言われている。近年の晩婚化に伴い、婚前であっても約１割において精液所見に問題があると言われている。

　不妊症の治療は、原因に応じて最適な治療法を選択して行なわれている。主な治療法には、タイミング法、排卵誘発法、人工授精、さらには体外受精などの生殖補助医療がある。人工授精（ＡＩＨ）は受精の場である卵管膨大部に受精に必要十分な精子を届けるため子宮腔内に精子を注入する治療法である。乏精子症（精子濃度１，５００万／ｍｌ以下）、精子無力症（運動率４０％以下）、性交障害、精子頸管粘液不適合（フーナーテスト不良）、抗精子抗体保有症例、原因不明不妊症例がＡＩＨの適応となる。しかし、調整後の総運動精子数が１００万から５００万がＡＩＨの限界と言われており、これを満たすことが難しい場合も多数存在する。また、凍結処理をした精液を人工授精に用いる場合には、凍結により精子の運動性が低下し、妊娠率は高いとは言えない現状がある。そのため、精子の運動性をあげる方法の開発が望まれている。

　間葉系幹細胞は、Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ（１９８２）によって初めて骨髄から単離された多分化能を有する前駆細胞である（非特許文献１参照）。間葉系幹細胞は、骨髄、臍帯、脂肪等の様々な組織に存在することが明らかにされており、間葉系幹細胞移植は、様々な難治性疾患に対する新しい治療方法として、期待されている（特許文献１～２参照）。最近では、脂肪組織、胎盤、臍帯、卵膜等の間質細胞に同等の機能を有する細胞が存在することが知られている。従って、間葉系幹細胞を間質細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｒｏｍａｌ　Ｃｅｌｌ）と称することもある。

特開２０１２－１５７２６３号公報特表２０１２－５０８７３３号公報

Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ　Ｆ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８４，　ｐｐ．１４３－１４７，　１９９９

　本発明は、上述のような状況の中、運動性に優れた精子を提供することを目的とする。

　上記課題を解決するために鋭意研究した結果、本発明者らは、エクソソームが、精子の運動性能を上げることを見出し、本発明を完成させた。本発明によれば、運動性が高く、精子の先体反応を抑制した精子を提供できる。すなわち本発明の要旨は、以下の通りである。

［１］エクソソームを含む精子処理用組成物。
［２］精子調整液、精子希釈液、精子保存液、人工授精溶液、体外受精溶液、精子運動性改善用溶液、又は精子受精能保持用溶液である、［１］に記載の精子処理用組成物。
［３］エクソソームが、間葉系幹細胞培養上清由来である、［１］に記載の精子処理用組成物。
［４］エクソソームが、単離されたエクソソームである、［１］に記載の精子処理用組成物。
［５］エクソソームを含む、精子運動性改善剤。
［６］エクソソームを含む、精子受精能保持剤。
［７］エクソソームを含む溶液中で精子を培養することを特徴とする、精子運動性改善方法。
［８］エクソソームを含む溶液中で精子を培養することを特徴とする、精子受精能保持方法。

　本発明によると、運動性が高く、精子の先体反応を抑制した精子を提供できる。本発明によって調整された精子は、従来の方法で調整した精子に比べ、運動性が高く、精子の先体反応が抑制されているため、受精の成功率が顕著に高い。

図１は、各条件下でのマウス精子の運動性（直線速度）を示す図である。図２は、各条件下でのマウス精子の運動性を示す図である。図３は、各条件下でのマウス精子の運動性（直進性）を示す図である。図４は、マウス精子について、各条件下での先体マーカー陽性精子の割合を示す図である。図５は、ウシ精子について、各条件下での先体マーカー陽性精子の割合を示す図である。図６は、各条件下でのマウス精子の酸素消費量の経時的変化を示す図である。図７は、蛍光標識したエクソソームで処理したマウス精子の蛍光染色画像を示す図である。図８は、蛍光標識したエクソソームで処理したマウス精子の蛍光染色画像を示す図である（クエンチ処理後）。

　以下、本発明の精子処理用組成物、精子運動性改善剤、精子受精能保持剤、精子運動性改善方法及び精子受精能保持方法について詳細に説明する。

［精子処理用組成物］
　本発明の精子処理用組成物は、エクソソーム（エキソソーム、ｅｘｏｓｏｍｅ）を含むことを特徴とする。本発明の精子処理用組成物は、エクソソームを含むことで、運動性が高く、精子の先体反応を抑制した精子を提供することができる。本発明の精子処理用組成物で処理し、運動性が改善又は向上し、先体反応が抑制された精子には、例えば人工受精、体外受精における受精効率や受胎率の向上、初期発生の促進等が期待できる。

　精子の運動性は、精子運動のパラメーターにより表すことができる。このような運動パラメーターとしては、例えば、精子頭部を振る幅（頭部振幅；ＡＬＨ）、精子頭部を振る回数（頭部振幅数；ＢＣＦ）、精子が動いた全距離に対する速度（曲線速度；ＶＣＬ）、精子が動いた直線距離に対する速度（直線速度；ＶＳＬ）等が挙げられる。ＡＬＨ／ＶＣＬ（ＡＬＨをＶＣＬで除した値）は精子に特徴的なジグザク運動における運動性の程度を示す。また、ＢＣＦ／ＶＳＬ（ＢＣＦをＶＳＬで除した値）は、精子の直線運動における運動性の程度を示す。

〈エクソソーム〉
　本発明におけるエクソソームは、細胞のエンドソーム由来の小胞体であり、細胞から放出される、電子顕微鏡で確認することができるサイズの小胞である。エクソソームの具体的なサイズとしては、平均粒子径が１ｎｍ～１，０００ｎｍであり、１０ｎｍ～５００ｎｍであることが好ましく、３０ｎｍ～２００ｎｍであることがより好ましい。ここで、平均粒子径とは、動的光散乱法又は電子顕微鏡での測定による各粒子の直径の平均値である。上記エクソソームは、生体分子を囲む脂質二重層を有することができる。また、上記エクソソームは、例えば、膜粒子、膜小胞、微小胞、ナノ小胞、微小小胞体（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ、平均粒子径３０～１，０００ｎｍ）、エクソソーム様小胞、エクトソーム様小胞、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）及び／又はエキソベシクルと呼ばれるものを含んでいてもよい。異なる種類の細胞由来のエクソソームは、細胞内起源、スクロース中でのエクソソームの密度、形状、沈降速度、脂質組成、タンパク質マーカー及び分泌の様式（即ち、シグナル（誘導性）後又は自発的（構成的））に基づいても区別され得る。エクソソームは、例えば、密度勾配遠心法では、１．０～１．５ｇ／ｍＬ、好ましくは１．１～１．３ｇ／ｍＬに分画される。さらに、エクソソームはその構成脂質としてフォスファチジルセリン、コレステロール、スフィンゴミエリン及びセラミドのいずれかを含有する。

　本発明におけるエクソソームには、エンドソーム由来の蛋白質や細胞内輸送に関与する蛋白質、細胞膜由来の蛋白質をはじめとする様々な分泌細胞由来の蛋白質やＲＮＡが含まれているとともに、分泌細胞の細胞膜やエンドソーム膜由来の脂質が含まれている。エンドソーム由来の蛋白質としては、ＥＳＣＲＴｓ及びＴＳＧ１０１、細胞内輸送に関与する蛋白質としては、Ｒａｂ及びＧＴＰａｓｅ、細胞膜由来の蛋白質としては、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１、エンドソーム膜由来の脂質としては、コレステロールやスフィンゴミエリンが例示される。

　また、本発明におけるエクソソームに含まれるその他のタンパク質、脂肪酸としては、例えば、ＩＬ－１０、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ）、ペラルゴン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、イソペンタデカン酸、パルミチン酸、イソパルミチン酸、マルガリン酸、Ｉｓｏｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、ノナデシル酸、イソノナデシル酸、アラキジン酸、１１Ｚ－ｅｉｃｏｓｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、Ｄｉｈｏｍｏ－γ－ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ　ａｃｉｄ、アラキドン酸、エルカ酸、１３Ｚ，　１６Ｚ－Ｄｏｃｏｓａｄｉｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、１３Ｚ，　１６Ｚ，１９Ｚ－Ｄｏｃｏｓａｄｉｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、アドレン酸、Ｃｌｕｐａｎｏｄｏｎｉｃ　ａｃｉｄ等、好ましくはＩＬ－１０、ＨＧＦ、ペラルゴン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、イソペンタデカン酸、パルミチン酸、イソパルミチン酸、マルガリン酸、Ｉｓｏｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、アラキジン酸、１１Ｚ－ｅｉｃｏｓｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、アラキドン酸、エルカ酸、１３Ｚ，　１６Ｚ－Ｄｏｃｏｓａｄｉｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、更に好ましくはＩＬ－１０、ＨＧＦ、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、Ｉｓｏｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、ノナデシル酸、エルカ酸、１３Ｚ，　１６Ｚ－Ｄｏｃｏｓａｄｉｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、特に好ましくはＩＬ－１０、ＨＧＦ、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、１３Ｚ，１６Ｚ－Ｄｏｃｏｓａｄｉｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ等が挙げられ、本発明におけるエクソソームはこれらを含むことが好ましい。

　本発明においてパルミチン酸（Ｐａｌｍｉｔｉｃ　Ａｃｉｄ）とは、Ｃ_１６Ｈ_３２Ｏ_２炭素で表される数と二重結合の数が１６：０で構成された飽和脂肪酸である。本発明においてステアリン酸（Ｓｔｅａｒｉｃ　Ａｃｉｄ）とは、Ｃ_１８Ｈ_３６Ｏ_２で表される炭素数と二重結合の数が１８：０で構成された飽和脂肪酸である。本発明においてオレイン酸（Ｏｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）とは、Ｃ_１８Ｈ_３４Ｏ_２で表される不飽和脂肪酸の一つであり、シスモノエン脂肪酸である。

　本発明におけるエクソソームは、細胞中に含まれるものでもよく、細胞培養上清中に含まれるものでもよく、細胞中もしくは細胞培養上清から単離されたエクソソームでもよい。エクソソームの単離方法としては、超遠心法、精密濾過法、抗体による捕捉、マイクロ流体システムの利用等が挙げられる。単離されたエクソソームは、間質細胞（間葉系幹細胞）等の細胞を含んでいてもよく、また、間質細胞（間葉系幹細胞）用培養培地等の培地を含んでいてもよい。

　本発明におけるエクソソームの由来は、特に限定されず、ヒト、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラビット、マウス、ラット等の哺乳動物の細胞であってもよいし、微生物であってもよいし、コメ等の植物であってもよい。間葉系幹細胞を培養して得られる培養上清、エクソソームを含むコメなどの植物や微生物から回収することができる。さらに、本発明におけるエクソソームは生物によって作られるものに限定されずリポソームなどの人工小胞体であっても構わない。

　本発明におけるエクソソームの由来が上記哺乳類である場合、由来細胞としては、例えば間葉系幹細胞、肝臓由来細胞、線維芽細胞、上皮細胞、筋芽細胞、多能性幹細胞、植物幹細胞、が挙げられ、中でも間葉系幹細胞、多能性幹細胞が好ましく、間葉系幹細胞がより好ましい。

　以下、本発明におけるエクソソームの由来が間葉系幹細胞である場合について説明する。

　本発明の精子処理用組成物が含むエクソソームは、上記細胞が間葉系幹細胞である場合には、間葉系幹細胞を培養して得られる培養上清から回収することができる。例えば、間葉系幹細胞を培養容器中でサブコンフルエント又はコンフルエントの状態にし、新しい培地へと交換してから、更に１～５日間培養を行って、その培養上清を回収する。エクソソームは間葉系幹細胞の培養上清を超遠心分離法、密度勾配遠心法、各種エクソソーム分離キット等により分離することにより取得することができる。

　本発明の精子処理用組成物は、上記エクソソームに加えて、上記エクソソームを包含する、又は分泌する能力を有する間葉系幹細胞自体を含んでいてもよい。なお、精子処理用組成物が上記エクソソームを包含する、又は分泌する能力を有する間葉系幹細胞を含む場合には、上記間葉系幹細胞を含むことで、同時に上記エクソソームを含むという要件を満たすこととなるとも解釈できる。本発明の精子処理用組成物が含むエクソソームとしては、間葉系幹細胞等の培養上清から単離したエクソソームであることが好ましい。

（間葉系幹細胞）
　本発明において間葉系幹細胞とは、間葉系に属する一種以上の細胞（骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞など）への分化能を有し、当該能力を維持したまま増殖できる細胞を意味する。本発明において用いる間葉系幹細胞なる用語は、間質細胞と同じ細胞を意味し、両者を特に区別するものではない。また、単に間葉系細胞と表記される場合もある。間葉系幹細胞を含む組織としては、例えば、脂肪組織、臍帯、骨髄、臍帯血、子宮内膜、胎盤、羊膜、絨毛膜、脱落膜、真皮、骨格筋、骨膜、歯小嚢、歯根膜、歯髄、歯胚等が挙げられる。本発明における間葉系幹細胞としては、脂肪組織、臍帯、骨髄、臍帯血、子宮内膜、胎盤、羊膜、絨毛膜、脱落膜、真皮、骨格筋、骨膜、歯小嚢、歯根膜、歯髄、歯胚等由来のものが挙げられるが、中でも、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞が好ましく、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞がより好ましい。

　本発明における間葉系幹細胞の種として、ヒト、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラビット、マウス、ラットが挙げられる。本発明における間葉系幹細胞は、処置される対象（被検体）と同種由来であってもよいし、異種由来であってもよい。

　間葉系幹細胞は、例えば、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社、Ｌｏｎｚａ社、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、Ｖｅｒｉｔａｓ社、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社及びＣｏｒｎｉｎｇ社などから提供されている細胞であってもよく、当業者に周知の方法により調製した細胞であってもよい。また、間葉系幹細胞は、ドナーの組織から分離したプライマリーの細胞であってもよいし、株化された細胞であってもよい。

　本発明において間葉系幹細胞を培養するために用いる培地は、間葉系幹細胞の状態を良好に保って培養することができる培地であれば特に限定されないが、例えば、骨細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞への分化能を維持した状態でヒト間葉系幹細胞を増殖させることができる培地であることが好ましい。

　本発明において用いる培地は、基礎培地に、血清を添加する、及び／又は、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、コレステロール、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロール等の１つ以上の血清代替物を添加して作製してもよい。また、これらの培地には、必要に応じて、さらに、グルタミンなどのアミノ酸類、グルコース等の糖類、塩化ナトリウムや硫酸マグネシウムなどの金属塩類、セレンなどの微量金属類、コレステロールや不飽和脂肪酸などの脂質類、パントテン酸などのビタミン類、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、成長因子、増殖因子、サイトカインなどのタンパク質、多糖、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等の物質を添加してもよい。

　上記基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＭＣＤＢ２０１培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。

　本発明において用いる間葉系幹細胞を培養するために用いる培地は、精子の処理に用いるという観点から、血清等の異種由来成分を含まない（ゼノフリー）培地であることが好ましい。このような培地としては、例えば、間葉系幹細胞増殖培地２（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　２　（Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ）ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）、間葉系幹細胞増殖培地ＸＦ（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　ＸＦ　（Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ）、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）、ＭＳＣＧＭ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔｔｍ、ＭＳＣＧＭｔｍ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔｔｍ（Ｌｏｎｚａ社製）、ヒト間葉系幹細胞用ゼノフリー培地（ＭＳＣ　ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）　ＸＦ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ　Ｐｌｕｓ（Ｖｅｒｉｔａｓ社製）、ＳｔｅｍＸＶｉｖｏｔｍ　Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ　Ｈｕｍａｎ　ＭＳＣ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉａ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）脂肪由来幹細胞用無血清培地（ＫＢＭ　ＡＤＳＣ－４、コージンバイオ社製）及び間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒ：ＳＴＥＭ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｈＭＳＣ　Ｈｉｇｈ　Ｇｒｏｗｔｈ、Ｒｏｈｔｏ社製）など、間葉系幹細胞（間質細胞）用として予め調製された培地として提供されている培地が挙げられる。

　上記血清としては、例えば、ヒト血清、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清、仔ウシ血清、ヤギ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ラット血清等が挙げられるがこれらに限定されない。血清を用いる場合、基礎培地に対して、５ｖ／ｖ％から１５ｖ／ｖ％、好ましくは、１０ｖ／ｖ％を添加してもよい。

（間葉系幹細胞培養上清の調製）
　以下の方法によって得られる間葉系幹細胞の上清を、本発明における間葉系幹細胞培養上清とすることができる。また、該上清から透析・限外濾過等の手段により不要な成分を除去したもの、該上清をカラム等で分画して得られる画分、特定の分子に対する抗体等を用いて選択した画分、遠心操作により取得した画分等を本発明における間葉系幹細胞培養上清としてもよい。

　培養上清を取得する際に用いる培地としては、間葉系幹細胞を培養するための培地と同様の培地を使用することができる。培養上清の取得方法は、それぞれの間葉系幹細胞の培養に適した方法であれば特に限定されないが、例えば、２０℃～３７℃の温度、２％～７％ＣＯ_２環境下、５％～２１％Ｏ_２環境下、好ましくは室温～３７℃、５％ＣＯ_２環境下で間葉系幹細胞を培養し、その培養上清を取得する方法である。

　本発明の間葉系幹細胞培養上清は、間葉系幹細胞と培地が接触すればよく、間葉系幹細胞を培地で洗浄することによって得られる洗浄液も、本発明における培養上清とすることができる。間葉系幹細胞と培地の接触時間は例えば、１４日間以内、好ましくは１０日間以内、さらに好ましくは７日間以内、より好ましくは５日間以内である。具体的に好ましくは、例えば、間葉系幹細胞を培養容器中でサブコンフルエント又はコンフルエントの状態にし、新しい培地へと交換してから、更に１～５日間培養を行って、その培養上清を回収する。培養上清を取得するための培養は、フラスコに付着させて行われる平面培養であってもよいし、マイクロビーズ等に付着させた浮遊・撹拌培養であってもよい。

（エクソソームの単離）
　エクソソームを単離する場合は、上述の方法で回収された間葉系幹細胞の培養上清を、超遠心分離法、密度勾配遠心法、アフィニティー精製法、サイズ排除クロマトグラフィー法、各種エクソソーム分離キット等により分離する方法等、従来公知の方法により取得することができる。エクソソームの分離方法は、超遠心分離法やアフィニティー精製法、サイズ排除クロマトグラフィー法が好ましい。

　本発明の精子処理用組成物が含むエクソソームの量としては、精子処理用組成物におけるエクソソームの濃度として、０．００１ｐｇ／ｍＬ以上１００ｕｇ／ｍＬであり、０．００５ｐｇ／ｍＬ以上１００ｕｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、０．０１ｐｇ／ｍＬ以上１０ｕｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、０．１ｐｇ／ｍＬ以上１００ｐｇ／ｍＬ以下であることが特に好ましい。本発明の精子処理用組成物が含むエクソソームの量を上記数値範囲内とすることで、精子処理用組成物は、精子へのダメージを抑えた上で、精子の運動性を向上させ、精子の先体反応を抑制する優れた効果を奏する。

　本発明の精子処理用組成物は、エクソソーム以外に、本発明の効果を妨げない範囲でその他の成分を含有してもよい。その他の成分としては、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）やアルブミン等の保護剤、抗生物質、糖類、アミノ酸類、ビタミン類、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水等が挙げられる。また、卵子、精子用緩衝液（洗浄液）等として市販されている緩衝液を使用してもよい。このような緩衝液としてはＮａＣｌ，　ＫＣｌ，　ＫＨ_２ＰＯ_４，　ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，　ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ，　ＮａＨＣＯ_３，　Ｇｌｕｃｏｓｅ，　Ｎａ－ｐｙｒｕｖａｔｅ，　Ｎａ－ｌａｃｔａｔｅ，　Ｐｈｅｎｏｌ　Ｒｅｄ，　Ｈｅｐｅｓ，　Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ　Ｓｕｌｆａｔｅ　ｓａｌｔ等を含有するＨＴＦメディウム（富士フィルム和光純薬社製）等が挙げられる。

　本発明の精子処理用組成物の対象となる精子の種として、哺乳動物であればよいが、例えばヒト、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラビット、マウス、ラット、希少動物等が挙げられる。

　本発明の精子処理用組成物は、精子調整液、精子希釈液、精子保存液、人工授精溶液、体外受精溶液、精子運動性改善用溶液、精子受精能保持用溶液等として用いられる。

　精子調整液とは、人工授精、体外受精等を目的として精子を準備する際に、精子を洗浄する、さらに良好な運動性を示す精子を回収するために懸濁しておくための溶液である。精子希釈液は、人工授精の際に、精子を適切な濃度に希釈し、子宮内に注入するために使用する溶液である。精子保存液は、精子を冷蔵保存、冷凍保存する際に使用できる溶液である。人工授精溶液は、人工授精における受精率を向上させるために使用される溶液である。体外受精溶液は、体外受精における受精率を向上させるために使用される溶液である。精子運動性改善用溶液は、精子の運動性を改善するために使用される溶液である。精子受精能保持用溶液は、精子の受精能力を保持するために使用される溶液である。

　本発明の精子処理用組成物は、上述のエクソソームに、必要なその他の成分を混合し、常法により調製することができる。

［精子運動性改善剤、精子受精能保持剤］
　本発明の精子運動性改善剤及び精子受精能保持剤は、エクソソームを含むことを特徴とする。本発明の精子運動性改善剤及び受精能保持剤は、エクソソームを含むことで、精子の運動性を向上させ、先体反応を抑制した精子を提供することができる。本発明の精子運動性改善剤又は精子受精能保持剤で処理した精子には、例えば人工授精、体外受精における受精効率や受胎率の向上、初期発生の促進等が期待できる。

　本発明の精子運動性改善剤及び精子受精能保持剤は、上述の精子処理用組成物と実質的に同じものであるから、具体的な説明は精子処理用組成物の項の説明を、精子処理用組成物を精子運動性改善剤又は精子受精能保持剤に読み替えてそのまま適用できる。

　本発明の精子運動性改善剤又は受精能保持剤によって処理される方法としては、精子運動性改善剤又は精子受精能保持剤が精子と接触する状態を生体内又は生体外で形成する。生体内の場合、精子の貯留器官である精嚢に精子の運動性改善剤又は受精能保持剤を投与することが考えられる。投与後に本発明の精子運動性改善剤又は精子受精能保持剤と精子が接触する状態が形成される限りにおいて、投与部位や投与方法は特に限定されない。一方、本発明の精子運動性改善剤又は精子受精能保持剤と精子との接触状態を生体外で形成させるためには、例えば、予め用意しておいた精子と本発明の精子運動性改善剤又は精子受精能保持剤とを、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで適当な容器に入れて混合し、一定時間処理する。処理温度は４℃～４０℃であり、１５℃～４０℃が好ましく、２５℃～３９℃がより好ましく、体温程度の温度である３６℃～３８℃がさらに好ましい。処理時間は、１０分～４８時間であり、２０分～２４時間であることが好ましく、３０分～４時間であることがより好ましく、１時間～２時間であることがさらに好ましい。

　本発明の精子運動性改善剤又は精子受精能保持剤で処理した精子は、人工受精・体外受精（成功率や効率の向上）、家畜の繁殖（人工授精の成功率や効率の向上、育種・種の維持（例えば絶滅危惧種の維持、ペットの系統の維持又は交雑）、精子障害を伴う又は精子障害が主因又は副因の各種疾患（例えば、精索静脈瘤、男子不妊症、停留精巣、Ｘ線照射、悪性腫瘍術後又は化学療法後の精子障害）の治療・改善、精子の保存、未成熟精子の運動性改善・受精能保持・保存等に利用され得る。

　本発明の精子運動性改善剤又は受精能保持剤で処理した精子を用いて人工授精を実施する場合（家畜の繁殖や育種・種の維持を目的とした人工授精も含む）、生体内又は生体外で運動性改善及び／又は受精能保持した精子と、卵子（卵細胞、卵）とが共存する状態を形成させることになる。生体内で共存状態を形成させるためには、運動性が改善した精子、及び／又は受精能を保持した精子を、卵子が存在する生体の部位に投与（移植）する。例えば、哺乳動物であれば子宮内に本剤で処理した精子を注入する。他方、生体外で共存状態を形成させるのであれば、生体からの単離や細胞バンクなどから分譲などによって用意した卵子と本剤で処理した精子を同一の容器内に入れ、インキュベートしたり、マイクロマニピュレーターなどを用いて運動性が改善した精子および／又は受精能を保持した精子を卵子に差し入れるなどをすればよい。本発明に特徴的な条件、即ち、本発明の精子運動性改善剤又は精子受精能保持剤を用いて処理した精子を使用すること以外は常法に従うことができる。

［精子運動性改善方法、精子受精能保持方法］
　本発明はエクソソームを含む溶液中で精子を培養することを特徴とする、精子運動性改善方法及び精子受精能保持方法も含む。本発明の精子運動性改善方法及び精子受精能保持方法は、エクソソームを含む溶液中で精子を培養することで、先体を維持したまま精子の運動性を改善及び／若しくは向上させること、又は精子の受精能を保持することができる。本発明の精子運動性改善方法又は精子受精能保持方法で、運動性が向上し、先体反応が抑制された精子には、例えば人工受精、体外受精における受精効率や受胎率の向上、初期発生の促進等が期待できる。

　本発明の精子運動性改善方法及び精子受精能保持方法は、上述の本発明の精子運動性改善剤又は精子受精能保持剤によって精子を処理する方法であるため、具体的な説明は、精子運動性改善剤、精子受精能保持剤の項を参照できる。

　以下に、実施例及び試験例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等によって限定されるものではない。

［実施例１：エクソソームの調製１］
　臍帯間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７１　Ｈｕｍａｎ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　Ｃｏｒｄ　Ｍａｔｒｉｘ　（ｈＭＳＣ－ＵＣ）、プロモセル社製）をＲＩＭ培地（間葉系幹細胞用無血清培地、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アルブミン、トランスフェリン及びインシュリンを含む、Ｒｏｈｔｏ社製）で３日間培養し、培養上清（以下「３Ｄ　ＲＩＭ培養上清」という）を得た。また、その後培地交換を行いさらに、ＲＩＭ培地で１日間培養し、培養上清（以下「１Ｄ　ＲＩＭ培養上清」という）を得た。１Ｄ　ＲＩＭ培養上清及び３Ｄ　ＲＩＭ培養上清から、ＥｘｏＴｒａｐ　Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎを用いてそれぞれエクソソーム（以下「１Ｄエクソソーム」及び「３Ｄエクソソーム」という）を得た。

［実施例２：エクソソームの調製２］
　脂肪由来幹細胞（ＰＴ－５００６　ＨＡＤＳＣ　－　Ｈｕｍａｎ　Ａｄｉｐｏｓｅ－Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ、ＬＯＮＺＡ社製）をＲＩＭ培地（間葉系幹細胞用無血清培地、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アルブミン、トランスフェリン及びインシュリンを含む、Ｒｏｈｔｏ社製）で３日間培養し、培養上清（以下「ＡＤＳＣ培養上清」という）を得た。ＥｘｏＴｒａｐ　Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎを用いてエクソソーム（以下「ＡＤＳＣエクソソーム」という）を得た。

［実施例３：リピドーム解析］
　実施例１と同様に臍帯間葉系幹細胞（Ｃ－１２９７１　Ｈｕｍａｎ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　ｆｒｏｍ　Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ　Ｃｏｒｄ　Ｍａｔｒｉｘ　（ｈＭＳＣ－ＵＣ）、プロモセル社製）をＲＩＭ培地（間葉系幹細胞用無血清培地、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アルブミン、トランスフェリン及びインシュリンを含む、Ｒｏｈｔｏ社製）で１日もしくは３日間培養し、培養上清（以下それぞれ「１Ｄ　ＲＩＭ培養上清」及び「２Ｄ　ＲＩＭ培養上清」という）を得た。１Ｄ　ＲＩＭ培養上清及び３Ｄ　ＲＩＭ培養上清から、ＥｘｏＴｒａｐ　Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎを用いてそれぞれエクソソーム（以下「１Ｄエクソソーム」及び「３Ｄエクソソーム」という）を得た。また、これらのエクソソーム中に含まれる脂肪酸をＧＣ－ＭＳで測定した。結果を表１に示す。

［実施例４：精子の運動性］
　３７℃のウォーターバスにて、各濃度の３Ｄエクソソームを添加したＨＴＦメディウム（富士フィルム和光純薬社製）（３Ｄエクソソーム濃度：０．６ｐｇ／ｍＬ、６．０ｐｇ／ｍＬ、６０ｐｇ／ｍＬ）、エクソソームを添加していない陰性コントロールとしてのＨＴＦメディウム（コントロール）及びＡＤＳＣ培養上清（エクソソーム６０ｐｇ／ｍＬ含有）にマウス精子（Ｃ５７／ＢＬ６、１２週齢）を懸濁させ、サンプルとした。続いて該サンプルを３７℃で６０分培養した。次に該サンプル３μＬを精子運動性解析装置（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｓｐｅｒｍ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＡＳＡ）　ｓｙｓｔｅｍ）を用いて解析した。観測される全精子の直線速度（Ｓｔｒａｉｇｈｔ－ｌｉｎｅ　Ｖｅｌｏｃｉｔｙ（ＶＳＬ））、直進性（Ｌｉｎｅａｒｉｔｙ　（ＬＩＮ））、運動性（Ｍｏｔｉｌｉｔｙ）を解析した。コントロールの６０分培養における中央値を１００として、６０分培養における３Ｄエクソソームを添加した培地のＶＳＬの中央値（図１）、Ｍｏｔｉｌｉｔｙ及びＬＩＮの平均値を図２及び図３に示した。

　図１から３に示すとおり、エクソソームを添加することにより、中央値が向上し、精子の運動性が向上していることが確認できた。また、単離したエクソソームの方が、同じ量のエクソソームを含有するＡＤＳＣ培養上清よりも、精子の運動性の向上効果に優れることも確認できた。

［実施例５：精子の先体反応抑制］
　雄マウス（Ｃ５７／ＢＬ６、１２週齢）の精巣上体から精子を回収し、６０ｐｇ／ｍＬの３Ｄエクソソームを添加したＨＴＦメディウム（富士フィルム和光純薬社製）、エクソソームを添加していない陰性コントロールとしてのＨＴＦメディウムに精子を懸濁させ、６０分間培養後に先体を保持している精子の割合を、目視による陽性精子数のカウントによって解析した。先体を保持している陽性精子の割合を図４に示した。

　図４に示すとおり、エクソソームを添加することにより、精子の先体反応の抑制が起こることが確認できた。

［実施例６：ウシ精子の運動性］
　凍結ウシ精液（一般社団法人　家畜改良事業団から購入）を３７℃のウォーターバスで１５秒加温することで融解した後、ＨＴＦメディウム（富士フィルム和光純薬社製）で２回洗浄した。６０ｐｇ／ｍＬの３Ｄエクソソームを添加したＨＴＦメディウム（富士フィルム和光純薬社製）、エクソソームを添加していない陰性コントロールとしてのＨＴＦメディウムに精子を懸濁させ、６０分間培養後に先体を保持している精子の割合を、目視による陽性精子数のカウントによって解析した。先体を保持している陽性精子の割合を図５に示した。

　図５に示すとおり、ウシ精子においてもエクソソームを添加することにより、先体反応の抑制が確認できた。

［実施例７：好気呼吸］
　雄マウス（Ｃ５７／ＢＬ６、１２週齢）の精巣上体から精子を回収し、ＨＴＦメディウム（富士フィルム和光純薬社製）に精子を懸濁させ、細胞の酸素消費量をリアルタイムに測定するフラックスアナライザー解析に供試した。培養開始６分後に、６０ｐｇ／ｍＬの３Ｄエクソソームあるいは飽和脂肪酸であるステアリン酸（８ｎｇ）／パルミチン酸（３６ｎｇ）を含むＨＴＦメディウムを２０μＬ添加した後、６分毎に６０分間、精子の酸素消費量の変化を検討した。コントロールの初回測定値を１００％として、その酸素消費量の経時的変化を図６に示した。

　図６に示すとおり、エクソソームを添加することにより、精子の好気呼吸を持続的に促進することが確認できた。

［実施例８：精子染色］
　雄マウス（Ｃ５７／ＢＬ６、１２週齢）の精巣上体から精子を回収し、Ｅｘｏｓｐａｒｋｌｅｒ　Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ　（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いて蛍光標識をつけたＤ３エクソソームを添加したＨＴＦメディウム（富士フィルム和光純薬社製）に精子を懸濁させ、３７℃で３０分間培養した（Ｅｘｏｓｏｍｅ；エクソソーム）。また、細胞内に取り込まれた蛍光標識を選別するため、細胞外の蛍光標識を失活させるクエンチング処理（０．４％　トリパンブルー液で５分間培養）をした（Ｅｘｏｓｏｍｅ　ａｆｔｅｒ　ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ；クエンチング処理後のエクソソーム）。以上の染色精子をサイトスピンによってスライドガラスに塗布し、蛍光顕微鏡によって観察した。この蛍光染色画像を図７及び８に示した。

　図７及び８に示すとおり、染色したエクソソームが精子に取り込まれて膜融合を起こしていることが確認できた。

Claims

　エクソソームを含む精子処理用組成物。
　精子調整液、精子希釈液、精子保存液、人工授精溶液、体外受精溶液、精子運動性改善用溶液、又は精子受精能保持用溶液である、請求項１に記載の精子処理用組成物。
　エクソソームが間葉系幹細胞培養上清由来である、請求項１に記載の精子処理用組成物。
　エクソソームが単離されたエクソソームである、請求項１に記載の精子処理用組成物。
　エクソソームを含む、精子運動性改善剤。
　エクソソームを含む、精子受精能保持剤。
　エクソソームを含む溶液中で精子を培養することを特徴とする、精子運動性改善方法。
　エクソソームを含む溶液中で精子を培養することを特徴とする、精子受精能保持方法。