WO2023140347A1

WO2023140347A1 - 精子処理用組成物、精子運動性改善剤、精子受精能保持剤、精子運動性改善方法及び精子受精能保持方法

Info

Publication number: WO2023140347A1
Application number: PCT/JP2023/001660
Authority: WO
Inventors: 昌之島田; 崇梅原; 格靖石川; 崇史瀧尻
Original assignee: 国立大学法人広島大学; ロート製薬株式会社
Priority date: 2022-01-24
Filing date: 2023-01-20
Publication date: 2023-07-27

Abstract

本発明は、運動性の高い精子を提供することを目的とする。　本発明は、間葉系幹細胞用培地を含む精子処理用組成物である。本発明の精子用処理組成物は、精子調整液、精子希釈液、精子保存液、人工授精溶液、体外受精溶液、精子運動性改善用溶液、又は精子受精能保持用溶液として用いられる。また、精子処理用組成物が含む間葉系幹細胞用培地は無血清培地であることが好ましい。

Description

精子処理用組成物、精子運動性改善剤、精子受精能保持剤、精子運動性改善方法及び精子受精能保持方法

　本発明は、精子処理用組成物、精子運動性改善剤、精子受精能保持剤、精子運動性改善方法及び精子受精能保持方法に関する。

　「不妊」とは、妊娠を望む健康な男女が避妊をしないで性交をしているにもかかわらず、一定期間妊娠しないものをいい、日本産科婦人科学会では、この「一定期間」を「１年というのが一般的である」と定義している。不妊のカップルは約１０組に１組と言われているが、近年、妊娠を考える年齢が上昇しており、男女とも加齢により妊娠が起こりにくくなることが知られているため、この割合はもっと高いとも言われている。

　不妊の原因は、男性側、女性側、あるいはその両方にある場合、原因不明の場合があるが、全体の約半数で男性側にも原因があると言われている。このような男性側の不妊の原因として、造精機能障害、精路通過障害、勃起障害（ＥＤ）、膣内射精障害などの性機能障害、加齢などが知られている。なお、男性は、３５歳ごろから徐々に精子の質の低下が起こると言われている。近年の晩婚化に伴い、婚前であっても約１割において精液所見に問題があると言われている。

　不妊症の治療は、原因に応じて最適な治療法を選択して行なわれている。主な治療法には、タイミング法、排卵誘発法、人工授精、さらには体外受精などの生殖補助医療がある。人工授精（ＡＩＨ）は受精の場である卵管膨大部に受精に必要十分な精子を届けるため子宮腔内に精子を注入する治療法である。乏精子症（精子濃度１，５００万／ｍｌ以下）、精子無力症（運動率４０％以下）、性交障害、精子頸管粘液不適合（フーナーテスト不良）、抗精子抗体保有症例、原因不明不妊症例がＡＩＨの適応となる。しかし、調整後の総運動精子数が１００万から５００万がＡＩＨの限界と言われており、これを満たすことが難しい場合も多数存在する。また、凍結処理をした精液を人工授精に用いる場合には、凍結により精子の運動性が低下し、妊娠率は高いとは言えない現状がある。そのため、精子の運動性をあげる方法の開発が望まれている。

　間葉系幹細胞は、Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ（１９８２）によって初めて骨髄から単離された多分化能を有する前駆細胞である（非特許文献１参照）。間葉系幹細胞は、骨髄、臍帯、脂肪等の様々な組織に存在することが明らかにされており、間葉系幹細胞移植は、様々な難治性疾患に対する新しい治療方法として、期待されている（特許文献１～２参照）。最近では、脂肪組織、胎盤、臍帯、卵膜等の間質細胞に同等の機能を有する細胞が存在することが知られている。従って、間葉系幹細胞を間質細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｒｏｍａｌ　Ｃｅｌｌ）と称することもある。

特開２０１２－１５７２６３号公報特表２０１２－５０８７３３号公報

Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ　Ｆ．　Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８４，　ｐｐ．１４３－１４７，　１９９９

　本発明は、上述のような状況の中、運動性に優れた精子を提供することを目的とする。

　上記課題を解決するために鋭意研究した結果、本発明者らは、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ（ｓｔｒｏｍａｌ）　ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）培養用培地が、精子の運動性能を上げることを見出し、本発明を完成させた。本発明によれば、運動性が高く、精子の先体反応を抑制した精子を提供できる。すなわち本発明の要旨は、以下の通りである。

［１］間葉系幹細胞用培地を含む精子処理用組成物。
［２］精子調整液、精子希釈液、精子保存液、人工受精溶液、体外受精溶液、精子運動性改善用溶液、又は精子受精能保持用溶液である、［１］に記載の精子処理用組成物。
［３］間葉系幹細胞用培地が無血清培地である、［１］又は［２］に記載の精子処理用組成物。
［４］間葉系幹細胞用培地がＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アルブミン、トランスフェリン及びインシュリンから成る群より選択される少なくとも１種を含有する、［３］に記載の精子処理用組成物。
［５］間葉系幹細胞用培地を含む、精子運動性改善剤。
［６］間葉系幹細胞用培地を含む、精子受精能保持剤。
［７］間葉系幹細胞用培地を含む溶液中で精子を培養することを特徴とする、精子運動性改善方法。
［８］間葉系幹細胞用培地を含む溶液中で精子を培養することを特徴とする、精子受精能保持方法。

　本発明によると、運動性が高く、精子の先体反応を抑制した精子を提供できる。本発明によって調整された精子は、従来の方法で調整した精子に比べ、運動性が高く、精子の先体反応が抑制されているため、受精の成功率が顕著に高い。

図１は、各条件下でのマウス精子の運動性を示す図である。図２は、フローサイトメトリーによる各条件下での精子先体マーカー陽性細胞のカウントの結果を示す図である。図３は、各条件下での先体マーカー陽性精子の割合を示す図である。図４は、各条件下でのマウス精子の運動性を示す図である。図５は、各条件下でのマウス精子の精子先体保持率を示す図である。図６は、各条件下での卵割率を示す図である。図７は、各条件下でのウシ精子の直進運動性を示すヒストグラムである。図８は、各条件下でのウシ精子の曲線運動性を示すヒストグラムである。図９は、各条件下でのウシ精子の頭部振幅を示すヒストグラムである。図１０は、ブタ精子の直線速度の中央値の上り幅を示す図である。図１１は、各条件下でのブタ精子について、観測される全精子中の運動精子の割合を示す図である。図１２は、各条件下でのブタ精子の直線速度を示す図である。

　以下、本発明の精子処理用組成物、精子運動性改善剤、精子受精能保持剤、精子運動性改善方法及び精子受精能保持方法について詳細に説明する。

［精子処理用組成物］
　本発明の精子処理用組成物は、間葉系幹細胞用培地を含むことを特徴とする。本発明の精子処理用組成物は、間葉系幹細胞の培養のために用いられる培地を含むことで、運動性が高く、精子の先体反応を抑制した精子を提供することができる。本発明の精子処理用組成物で処理し、運動性が改善又は向上し、先体反応が抑制された精子には、例えば人工受精、体外受精における受精効率や受胎率の向上、初期発生の促進等が期待できる。

　精子の運動性は、精子運動のパラメーターにより表すことができる。このような運動パラメーターとしては、例えば、精子頭部を振る幅（頭部振幅；ＡＬＨ）、精子頭部を振る回数（頭部振幅数；ＢＣＦ）、精子が動いた全距離に対する速度（曲線速度；ＶＣＬ）、精子が動いた直線距離に対する速度（直線速度；ＶＳＬ）等が挙げられる。ＡＬＨ／ＶＣＬ（ＡＬＨをＶＣＬで除した値）は精子に特徴的なジグザク運動における運動性の程度を示す。また、ＢＣＦ／ＶＳＬ（ＢＣＦをＶＳＬで除した値）は、精子の直線運動における運動性の程度を示す。

　本発明の精子処理用組成物が含む、間葉系幹細胞用培地は、骨細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞への分化能を維持した状態で間葉系幹細胞を増殖させることができる培地であればよく、特に限定されない。

　本発明において用いる間葉系幹細胞用培地は、基礎培地に、血清を添加する、及び／又は、アルブミン、トランスフェリン、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、コレステロール、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロール等の１つ以上の血清代替物を添加して作製してもよい。また、本発明において用いる間葉系幹細胞用培地には、必要に応じて、さらに、グルタミンなどのアミノ酸類、グルコース等の糖類、塩化ナトリウムや硫酸マグネシウムなどの金属塩類、セレンなどの微量金属類、パントテン酸などのビタミン類、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、成長因子、増殖因子、サイトカインなどのタンパク質、多糖、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等の物質を添加してもよい。

　上記基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＭＣＤＢ２０１培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。

　間葉系幹細胞用培地は、精子の処理に用いるという観点から、血清等の異種由来成分を含まない（ゼノフリー）培地であることが好ましい。このような培地としては、例えば、間葉系幹細胞増殖培地２（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　２　（Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ）ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）、間葉系幹細胞増殖培地ＸＦ（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　ＸＦ　（Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ）、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）、ＭＳＣＧＭ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔｔｍ、ＭＳＣＧＭｔｍ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔｔｍ（Ｌｏｎｚａ社製）、ヒト間葉系幹細胞用ゼノフリー培地（ＭＳＣ　ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）　ＸＦ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ　Ｐｌｕｓ（Ｖｅｒｉｔａｓ社製）、ＳｔｅｍＸＶｉｖｏｔｍ　Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ　Ｈｕｍａｎ　ＭＳＣ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉａ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）、脂肪由来幹細胞用無血清培地（ＫＢＭ　ＡＤＳＣ－４、コージンバイオ社製）及び間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒ：ＳＴＥＭ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｈＭＳＣ　Ｈｉｇｈ　Ｇｒｏｗｔｈ、Ｒｏｈｔｏ社製）など、間葉系幹細胞（間質細胞）用として予め調製された培地として提供されている培地が挙げられる。

　上記血清としては、例えば、ヒト血清、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清、仔ウシ血清、ヤギ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ラット血清等が挙げられるがこれらに限定されない。血清を用いる場合、基礎培地に対して、５ｖ／ｖ％から１５ｖ／ｖ％、好ましくは、１０ｖ／ｖ％を添加してもよい。

　上記アミノ酸は、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシンなどを含むがこれらに限定されない。タンパク質は、例えば、エコチン、還元型グルタチオン、フィブロネクチン及びβ２－ミクログロブリン等が例示されるが、これらに限定されない。多糖は、グリコサミノグリカンが例示され、グリコサミノグリカンのうち特に、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸等が例示されるが、これらに限定されない。増殖因子は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等が例示されるが、これらに限定されない。

　本発明の精子処理用組成物は、基礎培地に加えてＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アルブミン、トランスフェリン及びインシュリンからなる群より選択される少なくとも１種を含む間葉系幹細胞用培地を含有することが好ましく、少なくとも２種を含む間葉系幹細胞用培地を含有することがより好ましく、少なくとも３種を含む間葉系幹細胞用培地を含有することが更に好ましく、少なくとも４種を含む間葉系幹細胞用培地を含有することが特に好ましく、基礎培地に加えてＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アルブミン、トランスフェリン及びインシュリンを含む間葉系幹細胞用培地を含有することが最も好ましい。

　本発明の精子処理用組成物が含有する間葉系幹細胞用培地は、界面活性剤を含まないことが好ましい。上記界面活性剤としては、特に限定されないが、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（Ｔｗｅｅｎ　８０）等が挙げられる。本発明の精子処理用組成物が含有する間葉系幹細胞用培地が界面活性剤を含むと、運動性が高く、精子の先体反応を抑制した精子を提供できるという本発明の効果が得られ難くなる。なお、脂質成分を間葉系幹細胞用培地に溶解させるためには、界面活性剤を添加する必要があるため、本発明の精子処理用組成物が含有する間葉系幹細胞用培地としては、コレステロール、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂質成分を含まないものであることが好ましい。

　本発明の精子処理用組成物が含む間葉系幹細胞用培地の量としては、精子処理用組成物全体の０．１重量％～１００重量％であり、０．５重量％～９５重量％であることが好ましく、１重量％～９０重量％であることがより好ましく、３重量％～８０重量％であることがさらに好ましく、５重量％～５０重量％であることが特に好ましい。本発明の精子処理用組成物が含む間葉系幹細胞用培地の量の上記数値範囲内とすることで、精子へのダメージを抑えた上で、精子の運動性を向上させ、精子の先体反応を抑制する効果に優れる。

　本発明の精子処理用組成物は、間葉系幹細胞用培地以外に、本発明の効果を妨げない範囲でその他の成分を含有してもよい。その他の成分としては、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等の保護剤、抗生物質、ビタミン類、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水等が挙げられる。また、卵子、精子用緩衝液（洗浄液）等として市販されている緩衝液を使用してもよい。このような緩衝液としてはＮａＣｌ，　ＫＣｌ，　ＫＨ_２ＰＯ_４，　ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，　ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ，　ＮａＨＣＯ_３，　Ｇｌｕｃｏｓｅ，　Ｎａ－ｐｙｒｕｖａｔｅ，　Ｎａ－ｌａｃｔａｔｅ，　Ｐｈｅｎｏｌ　Ｒｅｄ，　Ｈｅｐｅｓ，　Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ　Ｓｕｌｆａｔｅ　ｓａｌｔ等を含有するＨＴＦメディウム（富士フィルム和光純薬社製）等が好ましい例として挙げられる。

　本発明の精子処理用組成物の対象となる精子の種として、哺乳動物であればよいが、例えばヒト、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラビット、マウス、ラット、希少動物等が挙げられる。

　本発明の精子処理用組成物は、精子調整液、精子希釈液、精子保存液、人工授精溶液、体外受精溶液、精子運動性改善用溶液、精子受精能保持用溶液等として用いられる。

　精子調整液とは、人工授精、体外受精等を目的として精子を準備する際に、精子を洗浄する、さらに良好な運動性を示す精子を回収するために懸濁しておくための溶液である。精子希釈液は、人工授精の際に、精子を適切な濃度に希釈し、子宮内に注入するために使用する溶液である。精子保存液は、精子を冷蔵保存、冷凍保存する際に使用できる溶液である。人工授精溶液は、人工授精における受精率を向上させるために使用される溶液である。体外受精溶液は、体外受精における受精率を向上させるために使用される溶液である。精子運動性改善用溶液は、精子の運動性を改善するために使用される溶液である。精子受精能保持用溶液は、精子の受精能力を保持するために使用される溶液である。

　本発明の精子処理用組成物は、上述の間葉系幹細胞用培地に、必要なその他の成分を混合し、常法により調製することができる。

［精子運動性改善剤、精子受精能保持剤］
　本発明の精子運動性改善剤及び精子受精能保持剤は、間葉系幹細胞用培地を含むことを特徴とする。本発明の精子運動性改善剤及び受精能保持剤は、間葉系幹細胞の培養のために用いられる培地を含むことで、精子の運動性を向上させ、先体反応を抑制した精子を提供することができる。本発明の精子運動性改善剤又は精子受精能保持剤で処理した精子には、例えば人工授精、体外受精における受精効率や受胎率の向上、初期発生の促進等が期待できる。

　本発明の精子運動性改善剤及び精子受精能保持剤は、上述の精子処理用組成物と実質的に同じものであるから、具体的な説明は精子処理用組成物の項の説明を、精子処理用組成物を精子運動性改善剤又は精子受精能保持剤に読み替えてそのまま適用できる。

　本発明の精子運動性改善剤又は受精能保持剤によって処理される方法としては、精子運動性改善剤又は精子受精能保持剤が精子と接触する状態を生体内又は生体外で形成する。生体内の場合、精子の貯留器官である精嚢に精子の運動性改善剤又は受精能保持剤を投与することが考えられる。投与後に本発明の精子運動性改善剤又は精子受精能保持剤と精子が接触する状態が形成される限りにおいて、投与部位や投与方法は特に限定されない。一方、本発明の精子運動性改善剤又は精子受精能保持剤と精子との接触状態を生体外で形成させるためには、例えば、予め用意しておいた精子と本発明の精子運動性改善剤又は精子受精能保持剤とを、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで適当な容器に入れて混合し、一定時間処理する。処理温度は４℃～４０℃であり、１５℃～４０℃が好ましく、２５℃～３９℃がより好ましく、体温程度の温度である３６℃～３８℃がさらに好ましい。処理時間は、１０分～４８時間であり、２０分～２４時間であることが好ましく、３０分～４時間であることがより好ましく、１時間～２時間であることがさらに好ましい。

　本発明の精子運動性改善剤又は精子受精能保持剤で処理した精子は、人工受精・体外受精（成功率や効率の向上）、家畜の繁殖（人工授精の成功率や効率の向上、育種・種の維持（例えば絶滅危惧種の維持、ペットの系統の維持又は交雑）、精子障害を伴う又は精子障害が主因又は副因の各種疾患（例えば、精索静脈瘤、男子不妊症、停留精巣、Ｘ線照射、悪性腫瘍術後又は化学療法後の精子障害）の治療・改善、精子の保存、未成熟精子の運動性改善・受精能保持・保存等に利用され得る。

　本発明の精子運動性改善剤又は受精能保持剤で処理した精子を用いて人工授精を実施する場合（家畜の繁殖や育種・種の維持を目的とした人工授精も含む）、生体内又は生体外で運動性改善及び／又は受精能保持した精子と、卵子（卵細胞、卵）とが共存する状態を形成させることになる。生体内で共存状態を形成させるためには、運動性が改善した精子、及び／又は受精能を保持した精子を、卵子が存在する生体の部位に投与（移植）する。例えば、哺乳動物であれば子宮内に本剤で処理した精子を注入する。他方、生体外で共存状態を形成させるのであれば、生体からの単離や細胞バンクなどから分譲などによって用意した卵子と本剤で処理した精子を同一の容器内に入れ、インキュベートしたり、マイクロマニピュレーターなどを用いて運動性が改善した精子および／又は受精能を保持した精子を卵子に差し入れるなどをすればよい。本発明に特徴的な条件、即ち、本発明の精子運動性改善剤又は精子受精能保持剤を用いて処理した精子を使用すること以外は常法に従うことができる。

［精子運動性改善方法、精子受精能保持方法］
　本発明は、間葉系幹細胞用培地を含む溶液中で精子を培養することを特徴とする、精子運動性改善方法及び精子受精能保持方法も含む。本発明の精子運動性改善方法及び精子受精能保持方法は、間葉系幹細胞の培養のために用いられる培地を含む溶液中で精子を培養することで、先体を維持したまま精子の運動性を改善及び／若しくは向上させること、又は精子の受精能を保持することができる。本発明の精子運動性改善方法又は精子受精能保持方法で、運動性が向上し、先体反応が抑制された精子には、例えば人工受精、体外受精における受精効率や受胎率の向上、初期発生の促進等が期待できる。

　本発明の精子運動性改善方法及び精子受精能保持方法は、上述の本発明の精子運動性改善剤又は精子受精能保持剤によって精子を処理する方法であるため、具体的な説明は、精子運動性改善剤、精子受精能保持剤の項を参照できる。

　以下に、実施例及び試験例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等によって限定されるものではない。

［実施例１：精子の運動性］
　３７℃のウォーターバスにて、最終濃度が１０％となるようにＲＩＭ培地（間葉系幹細胞用無血清培地、Ｒｏｈｔｏ社、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アルブミン、トランスフェリン及びインシュリンを含む）又はＲＳ培地（間葉系幹細胞用無血清培地、Ｒｏｈｔｏ社、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アルブミン、トランスフェリン及びインシュリンを含む）を添加したＨＴＦメディウム（富士フィルム和光純薬社製）（以下、それぞれ１０％ＲＩＭ培地、１０％ＲＳ培地ともいう）、培地を添加していない陰性コントロールとしてのＨＴＦメディウム（コントロール）にマウス精子（Ｃ５７／ＢＬ６、１２週齢）を懸濁させ、サンプルとした。続いて該サンプルを３７℃で１時間培養した。次に該サンプル３μＬを精子運動性解析装置（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｓｐｅｒｍ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＡＳＡ）　ｓｙｓｔｅｍ）を用いて解析した。観測される全精子の直線速度（Ｓｔｒａｉｇｈｔ－ｌｉｎｅ　Ｖｅｌｏｃｉｔｙ（ＶＳＬ））を解析した。コントロールの中央値を１００として、１０％ＲＩＭ培地（ＲＩＭ）及び１０％ＲＳ培地（ＲＳ）の中央値を図１に示した。

　図１に示すとおり、間葉系幹細胞培地を添加することにより（ＲＩＭ：１０％ＲＩＭ培地、ＲＳ：１０％ＲＳ培地）、中央値が向上し、精子の運動性が向上していることが確認できた。

［実施例２：精子の先体反応抑制］
　雄マウス（Ｃ５７／ＢＬ６、１２週齢）の精巣上体から精子を回収し、最終濃度が１０％となるようにＲＩＭ培地（間葉系幹細胞用無血清培地、Ｒｏｈｔｏ社）又はＲＳ培地（間葉系幹細胞用無血清培地、Ｒｏｈｔｏ社）を添加したＨＴＦメディウム（富士フィルム和光純薬社製）、培地を添加していない陰性コントロールとしてのＨＴＦメディウムに精子を懸濁させ、６０分間培養後に先体を保持している精子の割合を、フローサイトメトリーによる陽性精子数のカウントによって解析した。先体を保持している陽性精子数のヒストグラムを図２に、陽性精子の割合を図３に示した（ＲＩＭ：１０％ＲＩＭ培地、ＲＳ：１０％ＲＳ培地）。

　図２及び図３に示すとおり、間葉系幹細胞用培地を添加することにより、先体反応の抑制が確認できた（ＲＩＭ、ＲＳ）。従って、ＨＴＦメディウム等の精子培地に、ＲＩＭ培地、ＲＳ培地等の間葉系幹細胞用培地を添加することにより、精子の受精能喪失を抑制できることが明らかとなった。

［実施例３：精子の運動性］
　３７℃のウォーターバスにて、最終濃度が１０％、２５％及び５０％となるようにＬｉｐｉｄ　Ｆｒｅｅ　ＲＩＭ培地（間葉系幹細胞用無血清培地、Ｒｏｈｔｏ社、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アルブミン、トランスフェリン及びインシュリンを含み、コレステロール、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂肪成分、及びＰｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（Ｔｗｅｅｎ　８０）等の界面活性剤を含まない）を添加したＨＴＦメディウム（富士フィルム和光純薬社製）（以下、それぞれ１０％、２５％、５０％Ｌｉｐｉｄ　Ｆｒｅｅ　ＲＩＭ培地ともいう）、培地を添加していない陰性コントロールとしてのＨＴＦメディウム（コントロール）に、マウス精子（Ｃ５７／ＢＬ６、１２週齢）を懸濁させ、サンプルとした。続いて該サンプルを３７℃で１時間培養した。次に該サンプル３μＬを精子運動性解析装置（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｓｐｅｒｍ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＡＳＡ）　ｓｙｓｔｅｍ）を用いて解析した。観測される全精子の直線速度（Ｓｔｒａｉｇｈｔ－ｌｉｎｅ　Ｖｅｌｏｃｉｔｙ（ＶＳＬ））を解析した。コントロールの中央値を１００として、１０％、２５％及び５０％Ｌｉｐｉｄ　Ｆｒｅｅ　ＲＩＭ培地の中央値を図４に示した。

　図４に示すとおり、間葉系幹細胞培地（Ｌｉｐｉｄ　Ｆｒｅｅ　ＲＩＭ培地）を添加することにより、中央値が向上し、精子の運動性が向上していることが確認できた。

［実施例４：精子の先体反応抑制］
　雄マウス（Ｃ５７／ＢＬ６、１２週齢）の精巣上体から精子を回収した。最終濃度が１０％及び９０％となるようにＬｉｐｉｄ　Ｆｒｅｅ　ＲＩＭ培地（間葉系幹細胞用無血清培地、Ｒｏｈｔｏ社）を添加したＨＴＦメディウム（富士フィルム和光純薬社製）（以下、それぞれ１０％、９０％Ｌｉｐｉｄ　Ｆｒｅｅ　ＲＩＭ培地ともいう）、培地を添加していない陰性コントロールとしてのＨＴＦメディウム（コントロール）に、上記精子を懸濁させたもの、及び、陽性対象としての精嚢腺液（精嚢腺をＨＴＦメディウム内ですり潰した液でありタンパク質を１０ｍｇ／ｍＬ含む（以下、「ｓｖ」ともいう））に上記精子を懸濁させたものを６０分間培養後、先体を保持している精子の割合を、フローサイトメトリーによる陽性精子数のカウントによって解析した。先体を保持している陽性精子数のヒストグラムを図５に示した。

　図５に示すとおり、Ｌｉｐｉｄ　Ｆｒｅｅ間葉系幹細胞用培地を添加することにより、先体反応の抑制が確認できた。従って、ＨＴＦメディウム等の精子培地に、Ｌｉｐｉｄ　Ｆｒｅｅ間葉系幹細胞用培地を添加することにより、精子の受精能喪失を抑制できることが明らかとなった。

［実施例５：受精卵獲得率］
　最終濃度が１０％となるようにＲＩＭ培地（間葉系幹細胞用無血清培地、Ｒｏｈｔｏ社、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アルブミン、トランスフェリン及びインシュリンを含む）、Ｌｉｐｉｄ　Ｆｒｅｅ　ＲＩＭ培地（間葉系幹細胞用無血清培地、Ｒｏｈｔｏ社、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アルブミン、トランスフェリン及びインシュリンを含み、コレステロール、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂肪成分、及びＰｌｕｒｏｎｉｃ　Ｆ－６８、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（Ｔｗｅｅｎ　８０）等の界面活性剤を含まない）又はＲＳ培地（間葉系幹細胞用無血清培地、Ｒｏｈｔｏ社、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アルブミン、トランスフェリン及びインシュリンを含む）を添加したＨＴＦメディウム（富士フィルム和光純薬社製）（以下、それぞれ１０％ＲＩＭ培地、１０％Ｌｉｐｉｄ　Ｆｒｅｅ　ＲＩＭ培地、１０％ＲＳ培地ともいう）、培地を添加していない陰性コントロールとしてのＨＴＦメディウム（コントロール）に、マウス精子（Ｃ５７／ＢＬ６、１２週齢、１．０×１０^６　ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を懸濁させ、サンプルとして、溶液調整後３０分以上インキュベーター（３７℃）内で、静置した。また、陽性対象として精嚢腺液（精嚢腺をＨＴＦメディウム内ですり潰した液でありタンパク質を１０ｍｇ／ｍＬ含む）に、マウス精子を懸濁させ、サンプルとして、溶液調整後３０分以上インキュベーター（３７℃）内で静置した。これら培養した精子懸濁液４０μＬを、外因性のホルモン投与によって発情を誘起した７週齢の雌マウスの子宮内に、ゲルローディングチップを用いて注入した。精子懸濁液を注入した２４時間後に、雌マウスの卵管から受精胚を回収し、その２細胞期胚の割合を測定した。

　図６に示すとおり、間葉系幹細胞培地（１０％ＲＩＭ培地、Ｌｉｐｉｄ　Ｆｒｅｅ　ＲＩＭ培地、１０％ＲＳ培地）で処理することにより、卵割率が向上していることが確認できた。精子の直進運動性や先体の保持率が向上したことにより受精卵の獲得率が向上したものと考えられる。

［実施例６：ウシ精子の運動性］
　卵黄クエン酸ソーダ液で希釈したウシ新鮮精子を、ＨＴＦメディウム（富士フィルム和光純薬社製）で２回洗浄した。洗浄精子を、最終濃度が１０％となるようにＲＩＭ培地（間葉系幹細胞用無血清培地、Ｒｏｈｔｏ社、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アルブミン、トランスフェリン及びインシュリンを含む）を添加したＨＴＦメディウム（１０％ＲＩＭ培地）、培地を添加していない陰性コントロールとしてのＨＴＦメディウム（コントロール）で懸濁し、サンプルとした。続いて各サンプルを３７℃で１時間培養した。次に各サンプル３μＬを精子運動性解析装置（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｓｐｅｒｍ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＡＳＡ）　ｓｙｓｔｅｍ）を用いて解析した。観測される全精子中の運動精子の割合（Ｍｏｔｉｌｉｔｙ）、直線速度（Ｓｔｒａｉｇｈｔ－ｌｉｎｅ　Ｖｅｌｏｃｉｔｙ（ＶＳＬ））、曲線速度（Ｃｕｒｖｉｌｉｎｅａｒ　Ｖｅｌｏｃｉｔｙ（ＶＣＬ））、頭部振幅（Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ　ｏｆ　ｌａｔｅｒａｌ　ｈｅａｄ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＡＬＨ））を解析した（図７、図８、図９）。

　ウシにおいてもマウスと同様に、間葉系幹細胞培地を添加することにより、精子の運動性が向上していることが確認できた。

［実施例７：ブタ精子の運動性１］
　ヒロスワインＢ液で希釈した射出翌日のブタ新鮮精子を、ＨＴＦメディウム（富士フィルム和光純薬社製）で２回洗浄した。洗浄精子を、最終濃度が１０％となるようにＲＩＭ培地（間葉系幹細胞用無血清培地、Ｒｏｈｔｏ社、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アルブミン、トランスフェリン及びインシュリンを含む）を添加したＨＴＦメディウム（１０％ＲＩＭ培地）、培地を添加していない陰性コントロールとしてのＨＴＦメディウム（コントロール）で懸濁し、サンプルとした。続いて該サンプルを３７℃で１時間培養した。次に該サンプル３μＬを精子運動性解析装置（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｓｐｅｒｍ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＡＳＡ）　ｓｙｓｔｅｍ）を用いて直線速度（Ｓｔｒａｉｇｈｔ－ｌｉｎｅ　Ｖｅｌｏｃｉｔｙ（ＶＳＬ））を解析し、コントロールの中央値を基準として、１０％ＲＩＭ培地の中央値の上り幅を図１０に示した。

　ブタにおいても、間葉系幹細胞培地を添加することにより、精子の運動性が向上していることが確認できた。
［実施例８：ブタ精子の運動性２］
　射出５日目のヒロスワインＢ液で希釈したブタ新鮮精子を、ＨＴＦメディウム（富士フィルム和光純薬社製）で２回洗浄した。洗浄精子を、最終濃度が１０％となるようにＲＩＭ培地（間葉系幹細胞用無血清培地、Ｒｏｈｔｏ社、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アルブミン、トランスフェリン及びインシュリンを含む）を添加したＨＴＦメディウム（１０％ＲＩＭ培地）、添加していない陰性コントロールとしてのＨＴＦメディウム（コントロール）で懸濁し、サンプルとした。続いて該サンプルを３７℃で１時間培養した。次に該サンプル３μＬを精子運動性解析装置（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｓｐｅｒｍ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＡＳＡ）　ｓｙｓｔｅｍ）を用いて解析した。観測される全精子中の運動精子の割合（Ｍｏｔｉｌｉｔｙ、図１１）、直線速度（Ｓｔｒａｉｇｈｔ－ｌｉｎｅ　Ｖｅｌｏｃｉｔｙ（ＶＳＬ、図１２））を解析した。ブタにおいて間葉系幹細胞培地を添加することにより、精子の運動性が向上していることが確認できた。

Claims

　間葉系幹細胞用培地を含む精子処理用組成物。
　精子調整液、精子希釈液、精子保存液、人工授精溶液、体外受精溶液、精子運動性改善用溶液、又は精子受精能保持用溶液である、請求項１に記載の精子処理用組成物。
　間葉系幹細胞用培地が無血清培地である、請求項１又は２に記載の精子処理用組成物。
　間葉系幹細胞用培地がＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アルブミン、トランスフェリン及びインシュリンから成る群より選択される少なくとも１種を含有する、請求項３に記載の精子処理用組成物。
　間葉系幹細胞用培地を含む、精子運動性改善剤。
　間葉系幹細胞用培地を含む、精子受精能保持剤。
　間葉系幹細胞用培地を含む溶液中で精子を培養することを特徴とする、精子運動性改善方法。
　間葉系幹細胞用培地を含む溶液中で精子を培養することを特徴とする、精子受精能保持方法。