CN107173382B - 猪胎儿成纤维细胞冻存液 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞保存技术领域，具体涉及一种猪胎儿成纤维细胞冻存液。该猪胎儿成纤维细胞冻存液包括以下组分：蔗糖、乙二醇、二甲基亚砜和DMEM基础培养基。本发明的细胞冻存液质量稳定，能够很好的解决由于血清品质差异导致的冻存效果不稳定难题。该细胞冻存液能够很好的缓解冻存过程中冰晶对细胞的伤害，复苏后的细胞活力达90％，电转后细胞形态和增殖活力良好，且该细胞冻存液成本低。

Description

猪胎儿成纤维细胞冻存液

技术领域

本发明属于细胞保存技术领域，具体涉及一种猪胎儿成纤维细胞冻存液。

背景技术

猪的器官大小、生理、代谢、寿命及疾病发生机理等都与人有较大的相似性，相对于非人类灵长类动物而言，猪没有苛刻的伦理道德和动物保护方面的要求，加上繁殖力高，饲养成本低，猪已成为人类疾病研究的理想动物模型。许多疾病难以通过自发或人工定向培育的方法获得疾病研究的相关动物模型。基因编辑技术的出现，为人类精确地研究基因与疾病的相关关系提供了可能。目前，猪的胚胎干细胞一直没有建立相应的干细胞数据库，也没有国际公认的诱导性多能干细胞(IPS)用于基因操作，目前制备基因修饰猪应用最广泛的是猪胎儿成纤维细胞。正常的猪胎儿成纤维细胞在体外培养时会不停生长分裂从而导致最终衰老和凋亡。为了保护及合理有效利用细胞资源，人们需要将细胞种子资源保存起来以供日后使用。

目前，猪胎儿成纤维细胞保存普遍采用低温冷冻。低温冻存需要添加冷冻保护剂，如果直接冷冻，细胞内会产生冰晶对细胞造成伤害，从而导致细胞死亡。血清能稳定细胞膜、缓冲和保护细胞，调整细胞内渗透压，减少在冻存和长期储存过程中的活性氧自由基对细胞造成伤害，是猪胎儿成纤维细胞冻存常用的保护剂，使用血清来冻存，细胞存活率高，效果好。但血清价格昂贵，且不同来源血清所含促细胞因子、促贴附因子、激素以及其他活性物质等组份与比例不同，市场上销售的血清鱼龙混杂，不同品牌血清质量差异大，即使是同一品牌，也存在不同批次之间的差异。因此猪胎儿成纤维细胞冻存液中血清的质量常常制约着复苏后细胞的活力与增殖能力，尤其是在制备基因修饰猪过程中，复苏后的细胞必须具有稳定的增殖活力，才能经受后期的转染与筛选。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种猪胎儿成纤维细胞细胞冻存液。

除特殊说明外，所述百分比均为体积百分比。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种猪胎儿成纤维细胞冻存液，包括以下组分：蔗糖、乙二醇、二甲基亚砜和DMEM基础培养基。

所述DMEM的英文全称为dulbecco's modified eagle medium，中文译名为改良杜氏伊格尔培养基，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量。

发明人意外发现，将以上冻存液用于猪胎儿成纤维细胞冻存，能够在细胞冷冻的初始阶段使细胞脱水，从而减少冷冻降温过程中胞内冰晶形成从而保护细胞不受冷冻损害。

进一步，所述蔗糖的终浓度为0.1-0.5mol/L。

进一步，所述乙二醇的体积分数为15-25％，二甲基亚砜的体积分数为15-25％，DMEM基础培养基的体积分数为50-70％。

发明人意外发现，按照上述比例配比，冻存液能够穿过猪胎儿成纤维下拨的细胞膜渗透到细胞内，增大胞内渗透压，降低冰点，延缓冻存过程。

在依据本发明的冻存液中，本领域技术人员还可根据具体的使用要求，在本发明的冻存液中添加白蛋白、海藻糖、丙二醇、糖酐、维生素C、脯氨酸等冷冻保护剂。上述白蛋白、海藻糖、丙二醇、糖酐、维生素C、脯氨酸等冷冻保护剂于本领域普通技术人员而言是清楚的概念。

本发明的目的之二在于保护所述冻存液的制备方法，包括以下步骤：取蔗糖浓储、乙二醇、二甲基亚砜以及适量DMEM基础培养基，配制成冻存液；

其中，蔗糖浓储配制方法为：称取蔗糖，溶于DMEM基础培养基，过滤，分装，于-20℃保存。

进一步，所述冻存液包括以下步骤：取0.2-1体积份蔗糖浓储、1.5-2.5体积份乙二醇、1.5-2.5体积份二甲基亚砜以及适量DMEM基础培养基，配制成总体积为10体积份的冻存液；

其中，蔗糖浓储配制方法为：称取蔗糖，溶于10体积份DMEM基础培养基，用0.22um过滤器过滤，分装，于-20℃保存。

本发明的目的还在于保护一种猪胎儿成纤维细胞的保存方法，包括以下步骤：向猪胎儿成纤维细胞中加入所述冻存液，混匀后冻存。

进一步，所述冻存液的用量为每mL冻存液中细胞浓度为1×10⁶-5×10⁶个。

进一步，所述冻存具体为置于程序降温盒内于-80℃条件下保存。

待猪胎儿成纤维细胞生长至85-90％融合时，用0.05-0.25％的胰酶消化液消化细胞。取少量细胞用血细胞计数板计数，其余细胞经200×g离心力作用下离心3-5分钟，弃上清液，加入冻存液重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁶-5×10⁶个细胞/ml。将细胞悬液分装至冻存管内，1ml/管，拧紧盖子。在管壁上标明细胞名称，冻存液名称，冻存日期等。将细胞冻存管放入已加好异丙醇的细胞程序降温盒内，置于-80℃条件下保存。

本发明的有益效果在于：

本发明的细胞冻存液质量稳定，能够很好的解决由于血清品质差异导致的冻存效果不稳定难题。该细胞冻存液能够很好的缓解冻存过程中冰晶对细胞的伤害，该冻存液能够穿过猪胎儿成纤维细胞的细胞膜渗透到细胞内，增大胞内渗透压，降低冰点，延缓冻存过程。复苏后的细胞活力在83.33-95.33％，电转后细胞形态和增殖活力良好。采用该冻存液冻存猪胎儿成纤维细胞，复苏后的细胞转染效率高，可达90％以上，且该细胞冻存液成本低。

附图说明

图1为实施例6中的细胞生长状态图，其中，a、b、c分别为来源于冻存液1、冻存液2和冻存液7的细胞转染12小时的细胞生长状态图；

图2为实施例6中的细胞转染效率图，其中，a、b、c分别为来源于冻存液1、冻存液2和冻存液7的细胞转染12小时的细胞转染率图。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

以下实施例中的蔗糖为分析纯，来自成都市科龙化工试剂厂；DMEM基础培养基来自美国Gibco公司的DMEM基础培养基11995-065；乙二醇来自美国Sigma-Aldrich公司；二甲基亚砜来自美国Sigma-Aldrich公司的二甲基亚砜D4540；细胞程序降温盒来自美国Nalgene公司；标准胎牛血清为来自兰州百灵生物技术有限公司的Cellmax胎牛血清；特级胎牛血清为来自hyclone的SH30070.03。

实施例1猪胎儿成纤维细胞冻存液的配制

冻存液1(对照)：9ml标准胎牛血清加1ml二甲基亚砜，配制总体积为10ml的对照冻存液，现用现配，4℃存放备用。

冻存液2(对照)：9ml特级胎牛血清加1ml二甲基亚砜，配制总体积为10ml的对照冻存液，现用现配，4℃存放备用。

本发明所用冻存液(冻存液3-11)：0.2-1ml蔗糖浓储、1.5-2.5ml乙二醇、1.5-2.5ml二甲基亚砜以及适量DMEM基础培养基，配制总体积为10ml的冻存液，现用现配。具体配制如表1所示。

其中，蔗糖浓储配制方法为：称取17.12g蔗糖，充分溶于10ml DMEM基础培养基，用0.22um过滤器过滤，1ml/管分装，-20℃保存。

表1冻存液3-11

实施例2猪胎儿成纤维细胞的制备

在传统制备猪胎儿成纤维细胞的基础上，进行改良，具体方法如下：

1)麻醉妊娠33天荣昌母猪，剖腹取出子宫，放入含双抗生理盐水(38℃)送往试验室；

2)用体积分数为75％的酒精乳液浸泡清洗子宫1min，将子宫置于托盘，送往超净台；

3)在超净台无菌取出胎儿置于100mm培养皿(含双抗PBS)；

4)用PBS清洗胎儿3次；

5)去除胎儿头、四肢、尾及内脏；

6)再次用PBS清洗胎儿数次至无血；

7)加入少许PBS(保证组织块湿润即可)用眼科剪将胎儿剪碎至1mm³；

8)将剪碎的组织收集到15ml离心管；

9)加入4ml(组织体积的4-5倍)0.05％胰酶，放入38℃恒温箱消化30min；

10)加入含10％FBS培养基终止消化；

11)用20ml注射器吹打细胞辅助消化；

12)200g离心5min，去上清液；

13)加入1ml含10％FBS培养基重悬细胞；

14)将细胞接种到0.01％明胶处理过的100mm培养皿中，38℃，5％CO₂培养。

实施例3猪胎儿成纤维细胞冻存

实施例1中猪胎儿成纤维细胞融合度达85％时，弃培养基，PBS洗涤细胞2遍，用0.05％胰酶消化液消化，加入等体积完全培养基终止消化，将细胞收集至15ml离心管内，取20ul进行细胞计数，其余细胞经200×g离心力下离心5分钟，弃上清液，分别加入对应体积的本发明冻存液和对照冻存液重悬细胞。冻存体系为2.5×10⁶cell/ml冻存液，1ml/管，分别使用11种冻存液各冻存3管细胞。迅速将细胞冻存管放入已加好异丙醇的细胞程序降温盒内，置于-80℃超低温冰箱过夜保存，第二天将细胞转移至液氮中长期保存。

实施例4猪胎儿成纤维细胞复苏及活力检测

实施例3冻存的猪胎儿成纤维细胞在液氮中保存30天后，每种冻存液取出3管冻存细胞，在37℃水浴中迅速解冻，将细胞转入37℃预温的5ml完全培养基中，200×g离心力下离心5分钟,弃上清液，加入1ml预温的培养基重悬细胞，分别取重悬细胞20ul进行台盼蓝染色,显微镜下数100个细胞，统计染色细胞数并计算细胞活力。每支冻存细胞接种1孔96孔板，5000个细胞/孔，其余细胞接种至0.1％明胶处理过的培养皿中，38.5℃，5％CO₂进行培养。

台盼蓝染色步骤：

1)取出的20ul重悬细胞，加入180ul PBS,混匀；

2)加入20ul 0.4％台盼蓝,混匀；

3)在计数板上盖玻片一侧加细胞悬液；

4)显微镜下，计总的细胞数和染色细胞数(死亡细胞)；

5)数据统计，采用SPSS10.0软件进行处理，结果以平均数±标准误表示，采用方差分析和LSD多重比较，不同字母表示P<0.05有统计学意义。

注意：在三分钟内完成细胞计数，否则活细胞也会被染色；每组冻存液的细胞平行测定三次。检测结果如表2所示。

表2细胞活率检测结果

组别	冻存细胞数	染色细胞数	细胞活力(％)
				对照冻存液1	2.5×10<sup>6</sup>	23.67±2.60a	76.33±2.60a
对照冻存液2	2.5×10<sup>6</sup>	6.67±1.20be	93.33±1.20be
				试验冻存液3	2.5×10<sup>6</sup>	16.67±1.76c	83.33±1.76c
试验冻存液4	2.5×10<sup>6</sup>	16.33±1.76c	83.67±1.76c
				试验冻存液5	2.5×10<sup>6</sup>	6.33±0.88be	93.67±0.88be
试验冻存液6	2.5×10<sup>6</sup>	8.67±1.20bde	91.33±1.20bde
				试验冻存液7	2.5×10<sup>6</sup>	4.67±0.88b	95.33±0.88b
试验冻存液8	2.5×10<sup>6</sup>	12.33±1.76cdf	87.67±1.76cdf
				试验冻存液9	2.5×10<sup>6</sup>	9.33±0.88ef	90.67±0.88ef
试验冻存液10	2.5×10<sup>6</sup>	9.67±1.67ef	90.33±1.67ef
				试验冻存液11	2.5×10<sup>6</sup>	10±1.73ef	90±1.73ef

备注：以上结果采用统计学分析方法得到的数据，a、be、c、bde、b、cdf、ef均为本领域常用统计学术语，不含有相同字母的结果数据表示在5％水平差异显著，如76.33±2.60a与95.33±0.88b不含有相同字母，表示二者差异显著。

由表2可知，冻存液3-11冻存复苏的细胞活力在83.33-95.33％，与对照冻存液2效果相当，均显著高于对照冻存液1的细胞活力76.33％。由此可知本发明提供的猪胎儿成纤维细胞冻存液及其使用方法，能很好的保证细胞活力。

实施例5复苏后猪胎儿成纤维细胞增殖活性检测

CCK-8试剂盒中含有WST-8，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被细胞线粒体中的脱氢酶还原生成具有高度水溶性的橙黄色甲臜(Formazan)。甲臜的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖分析。在实施例4中，接种至96孔板的细胞，用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性，具体方法如下：

1)实施例4中培养的96孔细胞，在培养24h、48h和72h时向每个孔内加入10μl的CCK-8试剂；

2)把培养板放在培养箱内孵育2小时；

3)用酶标仪测定450nm波长处的吸光度；

4)数据统计，采用SPSS10.0软件进行处理，结果以平均数±标准误表示，采用方差分析和LSD多重比较，不同字母表示P<0.05有统计学意义。

每组冻存液的细胞平行测定三次，细胞增值活性检测结果如表3所示。

表3细胞增值活率检测表

组别	24小时吸光值	48小时吸光值	72小时吸光值
				对照冻存液1	0.64±0.07bc	0.80±0.04ad	0.88±0.01b
对照冻存液2	0.58±0.02bc	0.91±0.04ac	1.46±0.27ac
				试验冻存液3	0.80±0.11a	0.86±0.05ac	1.06±0.08bd
试验冻存液4	0.61±0.03bc	0.72±0.04a	1.16±0.2bcd
				试验冻存液5	0.56±0.02bd	1.06±0.09cef	1.28±0.03cd
试验冻存液6	0.56±0.03bd	1.01±0.03dcf	1.35±0.05acd
				试验冻存液7	0.70±0.02ac	1.49±0.22b	1.78±0.18a
试验冻存液8	0.52±0.01b	1.18±0.12ef	1.16±0.09bcd
				试验冻存液9	0.54±0.01b	1.26±0.09bf	1.24±0.05bcd
试验冻存液10	0.68±0.01acd	0.85±0.01ac	1.19±0.03bcd
				试验冻存液11	0.63±0.02bc	0.99±0.03dce	1.22±0.03bcd

备注：以上结果采用统计学分析方法得到的数据，bc、ad、b、ac、a、bcd、bd、cef、cd、dcf、acd、ef、bf、dce均为本领域常用统计学术语，不含有相同字母的结果数据表示在5％水平差异显著，如0.80±0.04ad与1.49±0.22b不含有相同字母，表示二者差异显著。

从表3可知，随着培养时间的延长,细胞在450nm处的吸光值逐渐渐增加，说明复苏的细胞在不断的增殖；冻存液1的吸光值，增加缓慢，且显著低于其他组，说明冻存液1的细胞较少且增殖缓慢，这与实施例4中冻存液1复苏细胞活力低结果一致；在实施例4中冻存液7复苏活力最高，在CCK-8的检测中，我们也同样发现冻存液7的吸光值显著较高，且随着培养时间的延长增殖迅速。

实施例6猪胎儿成纤维细胞电转检测

电穿孔转染简称电转，是一种高效、简便的基因转移系统，其操作简便、快捷、转染率高而被广泛应用。在电场的作用下，细胞膜上会暂时形成小孔以便导入基因，因此细胞自身的生长状态对转染效率，尤其是转染后细胞增殖活力有巨大影响。我们将实施例4中来源于冻存液1，冻存液2以及冻存液7的细胞，进行电转检测，具体操作如下：

1)实施例4中，细胞长至85-90％融合时进行转染，转染前4小时换液一次；

2)参照LONZA转染试剂说明书进行，先将转染液放置室温30分钟，将81ulsolution与19ul supplement混匀，然后加入10ul绿色荧光蛋白载体质粒DNA溶液(共计10ug)，混匀，室温20分钟；

3)PBS洗涤细胞2次，0.05％胰酶消化收集细胞，取10ul进行细胞计数；

4)每组分别取1×10⁶个细胞，PBS洗涤细胞2次，彻底吸干净上清，用110ul的转染混合液重悬细胞；

5)将细胞转入电穿孔杯，LONZA电转(条件U-023)；

6)电转后的细胞用预温的培养基稀释，接种至100mm培养皿(0.1％明胶处理)；

7)培养12小时后，荧光倒置显微镜下观察细胞生长状态和转染效率。

细胞生长状态如图1所示，其中，图1中a、b、c分别为来源于冻存液1、冻存液2和冻存液7的细胞转染12小时的细胞生长状态图。细胞转染效率图如图2所示，图2中a、b、c分别为来源于冻存液1、冻存液2和冻存液7的细胞转染12小时的细胞转染率图。

从图1可以看出，来源于冻存液7与冻存液2的细胞转染后贴壁细胞数以及细胞生长状态均显著优于冻存液1，这与表2中来源于冻存液7、冻存液2和冻存液1的细胞染色细胞数和细胞活力数相互印证。

从图2可以看出，来源于冻存液1，冻存液2以及冻存液7的细胞的转染效率较高，均在90％以上。

由此证明，本发明能很好的保证电转后细胞的活力与增殖能力，其效果与含特级胎牛血清的冻存液不相上下。

按照以上方法，将冻存液3-6和冻存液8-11进行电转检测，转染效率在90％以上。

按照以上方法，将冻存液3-11分别按照用量为每mL冻存液中细胞浓度为1×10⁶和5×10⁶个进行猪胎儿成纤维细胞冻存，也能够实现冻存复苏的细胞活力为83.33-95.33％，转染效率在90％以上。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (5)

1.一种猪胎儿成纤维细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：向猪胎儿成纤维细胞中加入冻存液，混匀后冻存；

所述冻存液，包括以下组分：蔗糖、乙二醇、二甲基亚砜和DMEM基础培养基；

所述冻存液的制备方法包括以下步骤：

取0.2-1体积份蔗糖浓储、1.5-2.5体积份乙二醇、1.5-2.5体积份二甲基亚砜以及适量DMEM基础培养基，配制成总体积为10体积份的冻存液；

其中，蔗糖浓储配制方法为：称取蔗糖，溶于10体积份DMEM基础培养基，用0.22um过滤器过滤，分装，于-20℃保存。

2.根据权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，所述冻存液的用量为每mL冻存液中细胞浓度为1×10⁶-5×10⁶个。

3.根据权利要求2所述的冻存方法，其特征在于，所述冻存具体为置于程序降温盒内于-80℃条件下保存。

4.根据权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，所述蔗糖的终浓度为0.1-0.5mol/L。

5.根据权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，所述乙二醇的体积分数为15-25％，二甲基亚砜的体积分数为15-25％，DMEM基础培养基的体积分数为50-70％。

Images