CN111657270B - 一种家畜精液常温保存剂及其制备方法和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种家畜精液常温保存剂及其制备方法和使用方法,每100mL双蒸水中含有:三羟基氨基甲烷(Tris)5~7g,柠檬酸钠1.6~2.0g,维生素C 0.4~0.5g,谷胱甘肽0.04~0.06g,牛血清白蛋白0.16~0.18g,三磷酸腺苷0.08~0.09g,抗菌素0.1~0.14g,鸡蛋黄5~20ml,海藻糖0.5~2.5g。本发明家畜精液常温保存剂,可以使鲜精在15~25℃保存,减少携带液氮罐和冰箱等冷冻器具的成本,有效提高技术人员的工作效率,保存时间在72小时以上,72小时存活率在45%以上,连续进行两次输精受胎率为40%以上,能够保证300公里范围内的人工授精,配制工艺简单,生产成本低,便于大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明家畜精液保存剂领域,特别是涉及一种家畜精液常温保存剂。
背景技术
随着牧业产业化的发展,生产优质肉羊是适应国际市场的需要,而我国的肉羊业起步较晚,目前还没有形成肉羊的繁育体系,品种多为地方品种,产肉性能差,羊肉的品质也较低,市场的竞争力较弱。从20世纪80年代起,我国养羊业陆续引进了国外的优质肉羊品种,来改良我国地方绵羊,提高其产肉率和羊肉的品质,为我国绵羊提质增肉做了巨大的贡献。
目前我国已引入了德国肉用美利奴、南非肉用美利奴、杜泊、萨福克、特克塞尔、无角道赛特等优质肉羊品种,利用引入的肉羊品种进行当地绵羊品种的改良,取得了较好的效果。为了提高引进肉用种公羊的利用率,迅速扩大肉用羊的繁育数量,采用鲜精低温保存的方法进行人工授精是直接有效的方法。鲜精低温保存技术大大延长了肉羊精子的存活时间,提高了优良种公羊精液的利用率,扩大了配种范围。
但是采用低温保存的精液解冻之后,精子的活性以及精子的完整率都较低,对于后期受精率都有较大影响。且冷冻保存的条件较为苛刻,通常是在4℃低温保存,如果输精需要携带冰箱,很不方便,工作人员的工作强度较大,成本较高。
发明内容
本发明提供一种家畜精液常温保存剂,可以在常温下保存家畜鲜精,无需冷冻。
为解决上述问题,本发明提供了一种家畜精液常温保存剂,每100mL双蒸水中含有:Tris5~7g,柠檬酸钠1.6~2.0g,维生素C 0.4~0.5g,谷胱甘肽0.04~0.06g,牛血清白蛋白0.16~0.18g,三磷酸腺苷0.08~0.09g,抗菌素0.1~0.14g,卵黄5~20ml,海藻糖0.5~2.5g。
在现有的精液保存剂中,通常都是加入糖类、卵黄、缓冲物质、抗菌素,如专利CN107668026A,其中糖类常用的有葡萄糖、蔗糖、乳糖,主要作用是提供精子营养和补充精子能量;卵黄的主要作用是调节渗透压、降低精液中电解质浓度、保护精子膜等作用,有利于精子的存活;稀释液中加入缓冲物质的目的是保证精液适宜的pH值,以利于精子的存活,以三羟基甲氨基甲烷(Tris)效果最好。但为了延长精子的存活时间,使其可保存72h以上还可使用,目前的保存剂在使用过程中均需要在4℃左右低温保存,否则精子的有效保存时间大大缩短。
为了弥补现有技术中的缺陷,本发明发明人经过大量的试验探索,意外地发现,将本发明特定的组分按照特定的比例组合后,可实现鲜精的常温长时效的保存。本发明保存剂添加维生素C抗氧化,以三磷酸腺苷作为精子的主要能量来源,再添加谷胱甘肽、牛血清白蛋白、海藻糖,一起组合后,能够保证精子的正常活动,保护DNA,保证精子基因的完整性,将鲜精在常温下有效保存72h以上,无需冷冻,使用更方便。
进一步地,所述卵黄为鸡蛋黄。
进一步地,所述鸡蛋黄所属的鸡蛋生产时间小于等于30天。
进一步地,所述抗菌素选自青霉素和/或链霉素;
在本发明的具体实施方式中,所述抗菌素为青霉素0.05~0.07g、链霉素
0.05~0.07g。
进一步地,每100mL双蒸水中含有:Tris5~7g,柠檬酸钠1.6~2.0g,维生素C0.4~0.5g,谷胱甘肽0.04~0.06g,牛血清白蛋白0.16~0.18g,三磷酸腺苷0.08~0.09g,抗菌素0.1~0.14g,卵黄8~15ml,海藻糖1.0~2.3g。
在本发明的具体实施方式中,每100mL双蒸水中含有:Tris 6g,柠檬酸钠1.8g,维生素C 0.45g,谷胱甘肽0.05g,牛血清白蛋白0.17g,三磷酸腺苷0.085g,青霉素0.06g,链霉素0.06g,卵黄10ml,海藻糖2.0g。
进一步地,所述家畜选自牛、羊、猪、马。
本发明保存剂可在常温下长效保存羊鲜精,根据本领域内现有技术的有关报道和认知,羊鲜精能够使用的保存剂,对于牛、猪、马等也能够适用。
在本发明的具体实施方式中,所述家畜为羊。
本发明还提供了上述家畜精液常温保存剂的制备方法,包括如下内容:将所有原料混合均匀即得。
进一步地,包括如下内容:
(1)将Tris、柠檬酸钠、维生素C、谷胱甘肽、牛血清白蛋白、三磷酸腺苷、抗菌素、海藻糖和部分双蒸水混合,得预混液A;
(2)将鸡蛋黄与预混液A混合得预混液B;
(3)将预混液B与余量的双蒸水混合;
进一步地,所述部分双蒸水为双蒸水总量的10~50%,优选20%。
本发明还提供了上述家畜精液常温保存剂的使用方法:按照精液:家畜精液常温保存剂体积比为1:3的比例进行配置。
本明的有益效果是:
(1)本发明家畜精液常温保存剂,可以使鲜精在15~25℃保存,保存时间在72小时以上,72小时存活率在45%以上,连续进行两次输精受胎率为40%以上,能够保证300公里范围内的人工授精。
(2)本发明家畜精液常温保存剂的应用可有效减少冷冻精液和低温保存精液中对温度的限制,减少携带液氮罐和冰箱等冷冻器具的成本,从而有效提高技术人员的工作效率。
(3)本发明家畜精液常温保存剂液配制工艺简单,生产成本低及便于携带,使用方便,便于大规模推广应用。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明中使用的鸡蛋生产不应超过一个月。
实施例1卵黄用量的筛选
设立5组试验组,分别记为A1、A2、A3、A4、A5组,A1、A2、A3、A4、A5组中卵黄的用量分别为5mL、10mL、15mL、20mL、25mL,其余组分用量相同,按照如下方法制备保存剂:
(1)取三羟基氨基甲烷(Tris)6g、柠檬酸钠1.8g、维他命C 0.45g、谷胱甘肽0.05g、牛血清白蛋白0.17g、ATP0.09g、青霉素0.06g,链霉素0.06g,海藻糖1.75g加入20mL双蒸水,用玻璃棒搅拌均匀。
(2)将鸡蛋打入干净烧杯(培养皿等可以装鸡蛋的器具均可,鸡蛋切不可打浑了),用没有针头的注射器插入蛋黄内吸取蛋黄液加入上一步配制的液体中。
(3)将步骤(2)配制好的溶液加入双蒸水配制为100ml的溶液,用玻璃棒搅拌混匀,即得本发明的家畜精液常温保存剂。
将同一批刚取好的羊鲜精(活率为85%以上)分别与各组保存剂按照1:3体积比配比混合,在室温下保存,每天定点(间隔24h)测试各组中精子的活率,每组各设立两个平行试验,计算两个平行试验的平均值,测定结果见表1。
表1
上述试验结果表明,在100mL家畜精液常温保存剂中,卵黄用量为10mL时效果最佳。
实施例2海藻糖用量的筛选
设立5组试验组,分别记为B1、B2、B3、B4、B5组,B1、B2、B3、B4、B5组中海藻糖的用量分别为0.5g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g,其余组分用量相同,按照如下方法制备保存剂:
(1)取三羟基氨基甲烷(Tris)6g、柠檬酸钠1.8g、维他命C 0.45g、谷胱甘肽0.05g、牛血清白蛋白0.17g、ATP0.09g、青霉素0.06g,链霉素0.06g,海藻糖加入20mL双蒸水,用玻璃棒搅拌均匀。
(2)将鸡蛋打入干净烧杯(培养皿等可以装鸡蛋的器具均可,鸡蛋切不可打浑了),用没有针头的注射器插入蛋黄内吸取15mL蛋黄液加入上一步配制的液体中。
(3)将步骤(2)配制好的溶液加入双蒸水配制为100ml的溶液,用玻璃棒搅拌混匀,即得本发明的家畜精液常温保存剂。
将同一批刚取好的羊鲜精(活率为85%以上)分别与各组保存剂按照1:3体积比配比混合,在室温下保存,每天定点(间隔24h)测试各组中精子的活率,每组各设立两个平行试验,计算两个平行试验的平均值,测定结果见表2。
表2
上述试验结果表明,在100mL家畜精液常温保存剂中,海藻糖用量为2.0g时效果最佳。
实施例3
(1)取三羟基氨基甲烷(Tris)6g、柠檬酸钠1.8g、维他命C 0.45g、谷胱甘肽0.05g、牛血清白蛋白0.17g、ATP0.09g、青霉素0.06g,链霉素0.06g,海藻糖2g加入20mL双蒸水,用玻璃棒搅拌均匀。
(2)将鸡蛋打入赶干净烧杯(培养皿等可以装鸡蛋的器具,鸡蛋切不可打诨了),用没有针头的注射器(容量大于10ml)插入蛋黄内吸取10ml蛋黄液加入上一步配制的液体中。
(3)将步骤(2)配制好的溶液加入双蒸水配制为100ml的溶液,用玻璃棒搅拌混匀,即得本发明的家畜精液常温保存剂。
需要使用时,提前按照要求配好保存剂,保存剂未使用时应放在冰箱4℃保存,保存时间不应超过三天以上(即72小时)。保存剂在使用前应用37℃水浴或气浴加热。采集采精过程中要保证全程不要受到污染,并且不能使用酒精等对精子有损伤的物质。采好的精液使用移液器进行分装,分装前要保证保存剂的温度在37℃。将分装好的保存剂常温放置,72小时之内进行人工授精。
下面通过试验例验证本发明家畜精液常温保存剂的有益效果:
试验例1
采用假阴道法分别采集31只无角多赛特种公羊(1~3岁)精液,在37℃下对精液的表观活率,活率及密度进行评定。利用实施例3制备的保存剂及上述操作方法分别将精液保存至72h,精液:保存剂体积比1:3。对本发明保存剂保存的每只公羊精液进行质量测定,测定刚采集时的鲜精密度、鲜精活率、使用保存剂室温保存72h后的活率,结果表明所采集种公羊样品鲜精密度在2.4~3.6×109个/mL范围内变化,平均密度为3.0×109个/mL,31组的活率(鲜精)在85%以上,72h后测定31组的精子活率在0.43~0.67范围内变化,平均值为0.55,连续进行两次输精受胎率为40%以上。
本发明家畜精液常温保存剂要可以补充精子的营养消耗,维持精子的渗透压,降低异物对精子的影响,降低精子代谢产物的危害,能够降低精子受低温打击所致使精子质膜结构的损坏。
在本领域内,精液的活率大于40%即可用于授精,试验结果表明,本发明家畜精液常温保存剂可将鲜精在室温下保存72h以上,能有效保持精子活率,降低精子畸形率,在运输、使用的过程中无需携带冷藏设备,使用方便,有效降低了操作人员的劳动强度,能有效提高人工授精受胎率及体外授精效率,提高人工授精生产效率,连续进行两次输精受胎率为40%以上。同时该稀释液配制工艺简单,生产成本低及便于携带,便于大规模推广应用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (8)
1.一种家畜精液常温保存剂,其特征在于,每100mL双蒸水中含有:Tris 6g,柠檬酸钠1.8g,维生素C 0.45g,谷胱甘肽0.05g,牛血清白蛋白0.17g,三磷酸腺苷0.085g,青霉素0.06g,链霉素0.06g,卵黄10ml,海藻糖2.0g。
2.根据权利要求1所述的家畜精液常温保存剂,其特征在于,所述卵黄为鸡蛋黄。
3.根据权利要求2所述的家畜精液常温保存剂,其特征在于,所述鸡蛋黄所属的鸡蛋生产时间小于等于30天。
4.根据权利要求1所述的家畜精液常温保存剂,其特征在于,所述家畜选自牛、羊、猪、马中的一种。
5.根据权利要求1所述的家畜精液常温保存剂,其特征在于,所述家畜选自为羊。
6.权利要求1~5任一项所述的家畜精液常温保存剂的制备方法,其特征在于,包括如下内容:将所有原料混合均匀即得。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,包括如下内容:
(1)将Tris、柠檬酸钠、维生素C、谷胱甘肽、牛血清白蛋白、三磷酸腺苷、抗菌素、海藻糖和部分双蒸水混合,得预混液A;
(2)将鸡蛋黄与预混液A混合得预混液B;
(3)将预混液B与余量的双蒸水混合;
所述部分双蒸水为双蒸水总量的10~50%。
8.权利要求1~5任一项所述的家畜精液常温保存剂的使用方法:按照精液:家畜精液常温保存剂体积比为1∶3的比例进行配置。
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