CN109897820B - 一种延缓体外培养卵子老化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种延缓体外培养卵子老化的方法，属于动物繁殖技术领域。本发明发现将卵子置于培养液中体外培养过程中添加虾青素(Astaxanthin)可以有效的改善老化卵子的早期胚胎发育、增加老化卵子膜电位、降低老化卵子凋亡率。本发明所提供的在体外培养卵子的过程中添加虾青素的方法显著延缓了体外培养卵子老化的速度，提高了老化卵子早期胚胎发育率，比常规培养液培养下老化卵子的发育率提高了15％，能够为体外受精‑胚胎移植(IVF‑ET)技术提供高质量的卵子和早期胚胎。

Description

一种延缓体外培养卵子老化的方法

技术领域

本发明涉及一种延缓体外培养卵子老化的方法，属于动物繁殖技术领域。

背景技术

哺乳动物的繁殖能力受多种因素的影响，动物个体本身的衰老和生殖细胞的老化严重影响动物的繁殖效率，而其中卵子的老化严重降低了雌性动物的繁殖能力。卵子的老化与很多因素有关，年龄、卵丘细胞、活性氧的增加、线粒体功能障碍等都可以导致卵子的老化。其中氧化应激导致活性氧的增加是一个很重要的因素。当卵子发生老化后，此时细胞内的氧化及抗氧化平衡便趋向于氧化状态，从而激发蛋白质及脂质等主要成分。同样当细胞内因为各种原因诱发氧化应激状态时又会加速细胞的老化。

卵子老化会带来诸多临床不良影响，包括体内受精率降低、胚胎质量低下、早期妊娠流产可能性增加和后代发育异常。采用辅助繁殖技术的卵子在受精前不可避免的需要在体外培养较长一段时间，这就会诱导卵子内发生氧化应激，导致卵子老化。在对受精不成功的卵子使用外在ICSI技术(卵包浆内单精注射技术)时，卵子体外培养时间增加的情况就会发生。因此，若能在体外延缓卵子老化，对于需要延长体外培养卵子时间的辅助生殖技术是极其有应用意义的。

虾青素(Astaxanthin,AX)是一种提取自微生物、藻类及海洋甲壳类动物的化合物，属酮式类胡萝卜素，为叶黄素家族中的一员。虾青素特殊的理化性质赋予了它抗氧化、抗癌、抗疲劳、抗衰老、抗炎以及增强免疫力等功能。目前已有研究表明虾青素可以延缓脑衰老和皮肤衰老。然而，国际上目前还没有虾青素改善卵子老化作用机理的研究。如果虾青素在卵子老化模型中发挥作用，这一研究将不仅使人们加深对与卵子老化相关生殖力下降分子机理的认识，还能对卵子老化所导致的生殖问题及后代发育提供新的预防与治疗措施。

发明内容

本发明目的是提供一种延缓体外培养卵子老化的方法。

本发明首先提高一种体外培养卵子的培养液，该培养液为本领域公知的用于体外培养卵子的培养液作为母液，在该培养液母液中加入虾青素得到本发明提供的上述培养液。

优选地，虾青素在上述培养液中的终浓度为1.0-3.0μg/mL；

更优选地，虾青素在培养液中的终浓度为2.0μg/mL。

所述培养液母液为CZB培养液、CZB、KSOM、HTF、M16、M2、TYH、M199、蔗糖溶液、MEMalpha。

进一步地，本发明提供一种延缓体外培养卵子老化的方法，采用上述含虾青素的培养液于体外培养卵子。

优选地，体外培养卵子的条件为：培养液pH值7.2-7.4、二氧化碳浓度2％-5％、湿度70％-100％、温度30-39℃的条件下体外培养6-24h。

更优选地，体外培养卵子的条件为：二氧化碳浓度5％、湿度100％、温度37℃的条件下体外培养12h。

本发明上述方法适用的卵子为哺乳动物MII期卵子卵丘-卵母细胞复合体(COCs)。所述哺乳动物为牛、羊、猪、鼠。

本发明提供了虾青素或上述含虾青素的培养液在延缓体外培养卵子的老化、或提高体外培养后卵子的受精率中的应用。

本发明还提供了虾青素或上述含虾青素的培养液在改善老化卵子的早期胚胎发育中的应用，所述早期胚胎为受精卵期至囊胚期阶段的早期胚胎。

进一步地，上述改善老化卵子的早期胚胎发育中的应用是将含虾青素的培养液培养后的老化卵子受精后，将受精卵在pH值7.2-7.4、二氧化碳浓度5％、湿度100％、温度37℃的条件下培养，到4-cell时换到加有葡萄糖的培养液中培养直到囊胚期。

本发明所述的MII期是指卵子静止于第二次减数分裂中期，也是卵子成熟时期。所述的受精卵是指成熟的卵子与精子结合形成合子。所述囊胚期是指受精卵经过4-5天的发育，形成内细胞团、滋养层细胞和囊胚腔的胚胎发育时期。

上述应用的具体应用方式为：在卵子的体外培养过程中，虾青素在卵子培养液中的工作浓度为1.0-3.0μg/mL。优选地，虾青素在卵子培养液中的工作浓度为2.0μg/mL。并且，体外培养卵子的条件为：培养液pH值7.2-7.4、二氧化碳浓度2％-5％、湿度70％-100％、温度30-39℃的条件下体外培养6-24h。优选条件为：培养液pH值7.2-7.4、二氧化碳浓度5％、湿度100％、温度37℃的条件下体外培养12h。

本发明的优点在于：

1、本发明方法能够显著提高体外培养12h过程中卵子老化的线粒体膜电位。卵子在体外培养12h的平均线粒体膜电位为0.71，而12h+2.0μg/mL Astaxanthin的平均线粒体膜电位则为1.41，恢复到了接近对照组0h的平均线粒体膜电位1.47。说明虾青素的添加能够改善由体外培养卵子老化导致的线粒体膜电位下降的情况。同时本发明方法也可以显著降低体外培养12h过程中卵子老化的早期凋亡率。卵子在体外培养12h的平均早期凋亡率为50％，而12h+2.0μg/mLAstaxanthin的平均早期凋亡率则为13.33％，恢复到了接近对照组0h的平均早期凋亡率5.26％。说明虾青素的添加确实可以改善由体外培养卵子老化导致的早期凋亡率增加的情况。

2、提高受精率的囊胚率：本发明将小鼠成熟卵子放入正常培养液中进行体外培养12h后受精观察囊胚率为10％-15％，而将小鼠成熟卵子置于添加2.0μg/mL虾青素的培养液中进行体外培养，培养12h后受精观察囊胚率为25％-30％；比常规培养液体外培养卵子的囊胚率提高了15％。

3、本发明所提供的技术方法操作简便，只需要在体外培养过程中添加一定浓度的虾青素，同时可应用于小型实验动物的体外受精、细胞核移植、单精子注射等胚胎体外生产技术，也可用于人的辅助生殖。

总之本发明显著延缓了体外培养卵子老化的速度，同时保证了卵子的体外发育能力，从而为延缓或逆转卵子老化提供新的途径，为改进辅助生殖技术提供了参考。

附图说明

图1为线粒体膜电位荧光图。其中纵坐标分别为高膜电位图(HighΔΨm)、低膜电位图(LowΔΨm)和总膜电位合并图(Merge)。

图2为线粒体膜电位数据统计图。纵坐标显示红/绿的荧光强度比值。从图中可以看出12h的线粒体膜电位荧光强度比值显著低于0h和12h+2.0μg/mL Astaxanthin。0h的荧光强度比值与12h相比显著升高，有明显的统计学差异(P＜0.05)，12h的荧光强度比值与12h+2.0μg/mL Astaxanthin相比显著降低，也有明显的统计学差异(P＜0.05)，而0h的荧光强度比值与12h+2.0μg/mL Astaxanthin相比无统计学差异(P＞0.05)。其中横坐标下面括号里的数字表示每组检测的卵子数。

图3为早期凋亡荧光图。其中纵坐标分别为凋亡指示剂图(Annexiv-V)、明场图(BF)和合并图(Merge)。

图4为早期凋亡数据统计图。纵坐标显示MII期卵子的早期凋亡比率。Annexiv-V指示剂会在发生早期凋亡的卵子周围形成一圈明显的绿色荧光，因此从图中可以看出12h的早期凋亡比例显著高于0h和12h+2.0μg/mL Astaxanthin。0h的早期凋亡比率与12h相比显著降低，有明显的统计学差异(P＜0.05)，12h的早期凋亡比率与12h+2.0μg/mLAstaxanthin相比显著升高，也有明显的统计学差异(P＜0.05)，而0h的早期凋亡比率与12h+2.0μg/mL Astaxanthin相比无统计学差异(P＞0.05)。其中横坐标下面括号里的数字表示每组检测的卵子数。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1小鼠卵子的采集

本实验所用的ICR小鼠均购买自内蒙古大学实验动物研究中心SPF级实验动物繁育室，每只小鼠采用皮下注射10IU PMSG，46-48h后腹腔注射10IU hCG的方法，在hCG注射14-16h后采用颈椎脱臼方法处死小鼠，剪开背部剪下输卵管，将输卵管置于小鼠体外操作液M2中，在体外操作液M2中用镊子撕开输卵管膨大部取出MII期卵子的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)待用，小鼠体外操作液的配方如表1所示。

表1小鼠体外操作液M2

实施例2小鼠卵母细胞体外培养

将取出的MII期卵子的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)放到CZB培养液中(如表2所示)体外培养(6h、12h、18h、24h，每个微滴放20-25枚卵子)，在pH值7.2-7.4、二氧化碳浓度5％、湿度100％、温度37℃的条件下体外培养。体外培养不同时间后，进行体外受精实验。

表2 CZB培养液(Chatot-Ziomet-Bavister)

实施例3小鼠卵母细胞体外受精

精子的准备：选取性成熟(＞8周)的雄鼠，已通过交配实验证明其有受精能力，颈椎脱臼处死雄鼠，剪开腹腔，将附睾尾部剪下，剔除脂肪，用镊子和针头配合，针头刺破附睾尾部上皮，挤压出附睾尾的精子。

精子获能：马上收集精子团块，置于已经平衡好的获能滴中(T6+10)，轻微震荡几次，使精子团分散开，置于pH值7.2-7.4、二氧化碳浓度5％、湿度100％、温度37℃的培养箱内孵育1.5h。

体外受精：将体外培养的卵子COCs移入已经过夜平衡的受精滴中(T6+20)，加入适量体积的获能精子，使精子密度在1×10⁶左右，置于pH值7.2-7.4、二氧化碳浓度5％、湿度100％、温度37℃的培养箱中孵育6h。

胚胎的体外培养：洗去受精后卵子上附着的精子，将胚胎移到不加葡萄糖的CZB培养液中继续培养，培养24h后观察2-cell，计算受精率。胚胎过阻断之后(大约在受精后36h-48h之间，在有1/3的胚胎到达4-cell)换为加葡萄糖的CZB中,在受精后24h、48h、72h、96h各观察一次，记录2-cell、4-cell、桑葚胚、囊胚的发育情况。

表3小鼠精子获能及受精液T6

将在体外培养液中培养6h、12h、18h、24h的卵子进行体外受精实验，0h的卵子为对照组，实验重复三次。各时期的发育率见表4。

表4体外培养卵子不同时间后的早期胚胎发育情况

统计并比较各组间比率和差异(以0h为标准，其余各组均与0h相比，在同一行里，标有不同上角标^a、b的两组数字之间有显著性差异，P<0.05)。

在辅助生殖等相关实验研究中，卵子需要进行体外培养，但是体外培养卵子就会导致卵子出现老化状态。为避免这种情况出现，或者延缓体外培养卵子老化的时间，或者在固定体外培养时间下，降低卵子老化率，本发明在体外培养卵子过程中添加虾青素可以有效的改善卵子老化这一情况。由上表可以看出，在体外分别培养卵子6h、12h、18h、24h后，体外受精获得的小鼠早期胚胎发育率，与对照组卵子体外培养0h后，体外受精获得的小鼠早期胚胎发育率相比，有明显的差异，其中体外培养卵子6h、12h、18h、24h的早期胚胎发育率均明显低于对照组0h。

实施例4虾青素在延缓体外培养卵子老化中的应用

将取出的成熟MII期卵子卵丘-卵母细胞复合体(COCs)体外培养在CZB和CZB+0.5μg/mL虾青素、CZB+1.0μg/mL虾青素、CZB+1.5μg/mL虾青素、CZB+2.0μg/mL虾青素、CZB+2.5μg/mL虾青素的培养液中培养12h，然后进行体外受精实验，0h且不添加任何浓度虾青素的卵子作为对照组，在CZB培养液中培养12h的卵子作为老化组，在CZB+0.5μg/mL虾青素、CZB+1.0μg/mL虾青素、CZB+1.5μg/mL虾青素、CZB+2.0μg/mL虾青素、CZB+2.5μg/mL虾青素的培养液中培养12h的卵子作为虾青素组，实验重复三次。各时期的发育率见表5。

表5体外培养卵子12h过程中添加不同浓度虾青素对早期胚胎发育的影响

统计并比较各组间比率和差异(以12h为标准，其余各组均与12h相比，在同一行里，标有不同上角标a、b的两组数字之间有显著性差异，P<0.05)。

由上表可以看出，体外培养卵子12h过程中添加不同浓度虾青素对早期胚胎发育有明显影响，其中对照组0h、体外培养卵子12h+1.0μg/mL虾青素组、12h+2.0μg/mL虾青素组的2-细胞率明显高于体外培养卵子12h组，有显著性差异(P<0.05)。

对于4-细胞来说各组均与体外培养卵子12h有显著性差异(P<0.05)。对照组0h、体外培养卵子12h+1.5μg/mL虾青素组、12h+2.0μg/mL虾青素组、12h+2.5μg/mL虾青素组的桑椹胚率明显高于体外培养卵子12h组，具有显著性差异(P<0.05)。

囊胚率则是对照组0h、体外培养卵子12h+2.0μg/mL虾青素组、12h+2.5μg/mL虾青素组与体外培养卵子12h相比具有显著性差异(P<0.05)。

考虑到12h+0.5μg/mL虾青素的4-细胞虽与12h相比有显著差异(P<0.05)，但其2-细胞、桑椹胚、囊胚率与12h相比均无明显统计学差异(P＞0.05)，且总体效率均低于12h+2.0μg/mL虾青素组。另外12h+2.5μg/mL虾青素组的4-细胞、桑椹胚、囊胚率与12h相比有显著差异(P<0.05)，但也均低于12h+2.0μg/mL虾青素组。所以确定体外培养卵子12h过程中添加2.0μg/mL虾青素组为最佳老化改善组。

由上表可以看出体外培养卵子12h过程中添加2.0μg/mL虾青素组与体外培养卵子老化12h过程中不添加虾青素组相比囊胚率提高了15％，说明2.0μg/mL虾青素的添加对于体外培养卵子老化确实改善作用，可能延缓了卵子的老化速度。

实施例5体外培养卵子12h过程中添加浓度为2.0μg/mL虾青素膜电位的情况

将取出成熟的MII期卵子体外培养在CZB和CZB+2.0μg/mL虾青素的培养液中体外培养12h，体外培养0h的卵子作为对照组，在CZB培养液中体外培养12h的卵子作为老化组，在CZB+2.0μg/mL虾青素中体外培养12h的卵子作为虾青素组，将处理后的卵子加入到JC-10微滴中，每个滴20-25枚卵子于pH值7.2-7.4、二氧化碳浓度5％、湿度100％、温度37℃条件下的培养箱中孵育20min。用激光共聚焦显微镜下拍照观察，见图1，并用Image J软件分析卵子线粒体膜电位情况。各组卵子膜电位变化如图2所示。

由图1、图2可以看出，体外培养卵子12h过程中添加浓度为2.0μg/mL的虾青素对膜电位有明显影响，体外培养卵子12h组的膜电位明显低于对照组0h,具有显著性差异(P<0.05)，而对于体外培养卵子12h过程中添加2.0μg/mL虾青素组来说其膜电位则明显高于体外培养卵子老化12h过程中未添加虾青素组，具有显著性差异(P<0.05)，并且虾青素组与对照组相比膜电位没有显著性差异(P＝0.46)。说明体外培养卵子12h过程中添加浓度为2.0μg/mL的虾青素对卵子膜电位有明显改善作用，升高了常规体外培养卵子由老化所导致的低膜电位情况。

实验例6添加浓度为2.0μg/mL虾青素的体外培养卵子12h过程中卵子凋亡的情况

将取出成熟的MII期卵子体外培养在CZB和CZB+2.0μg/mL虾青素的培养液中体外培养12h，体外培养0h的卵子作为对照组，在CZB培养液中体外培养12h的卵子作为老化组，在CZB+2.0μg/mL虾青素中体外培养12h的卵子作为虾青素组，将处理后的卵子加入到比例为10:1的binding buffer和Annexin-V-FITC的混合液微滴中，每个滴20-25枚卵子置于pH值7.2-7.4、二氧化碳浓度5％、湿度100％、温度37℃条件下的培养箱中避光孵育10min。在激光共聚焦显微镜下拍照，统计凋亡数目，分析卵子凋亡情况。各组卵子凋亡情况如图3，图4所示。

由图3，图4可以看出，体外培养卵子12h过程中添加浓度为2.0μg/mL的虾青素对卵子凋亡有明显影响，体外培养12h组(未加虾青素)的凋亡率为50％，明显高于对照组0h的凋亡率5.26％，具有显著性差异(P<0.05)，而对于体外培养卵子12h过程中添加2.0μg/mL虾青素组来说其凋亡率(13.33％)则明显低于体外培养卵子12h过程中未添加虾青素组，具有显著性差异(P<0.05)，并且虾青素组与对照组相比凋亡率没有显著性差异(P＝0.24)。说明体外培养卵子12h过程中添加浓度为2.0μg/mL的虾青素对卵子凋亡有明显改善作用，降低了常规体外培养卵子由老化所导致的高凋亡率。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种延缓体外培养卵子老化的培养液，其特征在于，其为含有虾青素的培养液，所述虾青素在培养液中的终浓度为1.0-3.0μg/mL。

2.如权利要求1所述延缓体外培养卵子老化的培养液，其特征在于，虾青素在培养液中的终浓度为2.0μg/mL。

3.如权利要求1-2任一所述延缓体外培养卵子老化的培养液，其特征在于，所述培养液为CZB、KSOM、HTF、M16、M2、TYH、M199、蔗糖溶液、MEM alpha。

4.一种延缓体外培养卵子老化的方法，其特征在于，采用权利要求1-3任一所述的培养液体外培养卵子。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，体外培养卵子的条件为：培养液pH值7.2-7.4、二氧化碳浓度2％-5％、湿度70％-100％、温度30-39℃的条件下体外培养6-24h。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，体外培养卵子的条件为：二氧化碳浓度5％、湿度100％、温度37℃的条件下体外培养12h。

7.如权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于，所述卵子为哺乳动物MII期卵子卵丘-卵母细胞复合体。

8.虾青素在制备延缓体外培养卵子的老化或提高体外培养后卵子的受精率的培养液中的应用，其特征在于，所述培养液为权利要求1-3任一所述的培养液。

9.虾青素在制备改善老化卵子的早期胚胎发育的培养液中的应用，所述培养液为权利要求1-3任一所述的培养液，所述早期胚胎为受精卵期至囊胚期阶段的早期胚胎。

10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，在卵子体外培养过程中，虾青素在卵子培养液中的工作浓度为1.0-3.0μg/mL。

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