CN107922922A - 培养基 - Google Patents

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Abstract

胚胎、配子或干细胞培养基，其包含a)浓度为约5至约50μM的乙酰肉碱；和b)浓度为约2.5至约40μM的硫辛酸或其衍生物。所述培养基可以任选地进一步包含浓度为约5至约50μM的乙酰半胱氨酸。

Description

培养基
发明领域
本发明涉及用于胚胎、配子或干细胞的培养基。
发明背景
全世界有超过8000万人受不孕症影响。据估计，所有夫妻中有10％经历过原发性或继发性不孕症。辅助生殖治疗(ART)是一种选择性的医学治疗，其可以向其它情况下无法怀孕的夫妻提供建立怀孕的机会。它是这样的过程，其中从女性的卵巢中取出卵子(卵母细胞)，然后在实验室中用精子受精。然后将在该过程中创建的胚胎置于子宫内进行潜在的植入。
尽管ART有所进步，每次植入的活产的成功率仍然较低，约为30％。许多因素影响成功的ART结果，特别是因为胚胎的体外培养不能准确模拟体内的生理条件。例如，通过在体外环境中对配子的处理、操作和培养所产生的活性氧类别(ROS)可导致氧化应激的发展，这会对胚胎质量和生存力丧失产生不利影响。体外ROS的主要贡献者是培养胚胎的氧浓度。胚胎在大气氧气(～20％)下收集和培养造成与增加外源ROS的产生相关的高氧环境条件，这随后导致氧化应激。氧化应激对在20％氧气下收集和培养的胚胎的影响已经显示出对它们的基因表达产生负面影响，改变所得到的蛋白质组和扰乱代谢。即使短暂暴露于大气氧气也会对胚胎发育产生不利影响，导致卵裂分裂延迟。然而，尽管有越来越多的证据表明，高氧浓度对胚胎发育和存活力是有害的，但全世界相当数量的IVF周期仍然在大气氧中进行。
尽管在5％的氧气下进行胚胎培养可能会减轻氧化应激的一些破坏性影响，5％的氧浓度仍然导致氧化应激。此外，所有配子在其收集和加工过程中都暴露于大气氧。尽管有证据表明高氧浓度对人类胚胎发育和存活力有害，但是据报道，全世界只有25％的IVF周期仅在5％的氧气中完成，其中34％的诊所报告在胚胎培养的特定阶段使用5％的氧气，并且其余的诊所仅使用20％的氧气(Christianson,et al.,2014J.Assist Reprod.Genet.31:1029-1036)。
此外，由于体外培养物严重缺乏维持对ROS水平的严密调节所必需的生理学机制，由高水平的外源性ROS引起的氧化应激对胚胎的影响可能是复杂的。当然，内源性ROS是由配子和胚胎在体内产生的，并且低水平是适当调节配子功能和发育所必需的。然而，与体外条件不同，体内多余的ROS由提供针对氧化损伤的修复和保护的简洁的(elegant)抗氧化防御系统所淬灭。因此，在生理条件下，系统性ROS与抗氧化能力之间保持良好的平衡/稳态。这一平衡在体外被破坏，并且如在20％氧气时培养胚胎的情况下，外源性ROS的积聚和缺乏保护机制不可避免地导致氧化应激。
体内的ROS被由酶和非酶构成的固有抗氧化系统所中和。包含过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶/还原酶和超氧化物歧化酶(SOD)的酶促抗氧化剂存在于细胞质，子宫内膜腺细胞和线粒体中，并且通过清除ROS来赋予保护。非酶促抗氧化剂，诸如维生素(A,B,C和E)、丙酮酸、谷胱甘肽(GSH)和牛磺酸存在于卵巢、精浆、子宫内膜上皮和滤泡以及输卵管液中，并且通过终止氧化链式反应来阻止ROS形成。由于体外培养物缺乏这些固有抗氧化剂，向培养基中补充各种抗氧化剂已经用作处理以保持检查的ROS水平并防止对配子和胚胎的氧化损伤。
干细胞培养中的氧化应激也是一个记录的问题。
尽管个别抗氧化剂对胚胎发育的影响已有报道，但是关于培养基中以组存在的抗氧化剂对胚胎发育的作用的研究相对有限。关于抗氧化剂在培养基中的有益效果存在矛盾的报道(Legge and Sellens,Hum Reprod 1991；6:867-871；Nasr-Esfahani and Johnson,Hum Reprod 1992；7:1281-1290；Noda,et al.,Mol Reprod Dev 1991；28:356-360；Payne,et al.,Reprod Fertil Develop 1992；4:167-174)。
寻找增强胚胎发育，和干细胞增殖与分化或维持或增强配子存活力的培养基已成为一项挑战。
发明概述
根据第一方面，本发明提供了胚胎、配子或干细胞培养基，其包含：
a)浓度为约5至约50μM的乙酰肉碱；和
b)浓度为约2.5至约40μM的硫辛酸或其衍生物。
另一方面，本发明提供了胚胎、配子或干细胞培养基，其包含：
a)浓度为约5至约50μM的乙酰肉碱；
b)浓度为约2.5至约40μM的硫辛酸或其衍生物；和
c)浓度为约5至约50μM的乙酰半胱氨酸。
另一方面，本发明提供了处理和/或操作和/或培养胚胎、配子或干细胞的方法，所述方法包括在根据本发明的培养基中处理和/或操作和/或培养所述胚胎或配子或干细胞。
另一方面，本发明提供了在体外培养的胚胎、配子或干细胞中减少或防止氧化应激和/或减少或防止自由基形成(如活性氧类别(ROS)形成)，和/或增加抗氧化能力水平的方法，和/或改善体外培养的胚胎发育的方法，或改善体外培养的干细胞增殖和分化的方法，或改善配子健康和/或存活力的方法，所述方法包括在根据本发明的培养基中处理和/或操作和/或培养所述胚胎和/或配子或干细胞。
另一方面，本发明提供了体外受精的方法，其包括在根据本发明的培养基中培养配子，用精子对卵母细胞受精，和/或培养胚胎。在一个实施方案中，优选地，所述体外受精的方法不包括将胚胎植入人体或动物体内。
本发明还提供了乙酰肉碱和硫辛酸或其衍生物的组合在胚胎培养基、配子培养基或干细胞培养基中的用途。
另一方面，本发明提供了乙酰肉碱、硫辛酸或其衍生物和乙酰半胱氨酸的组合在胚胎培养基、配子培养基或干细胞培养基中的用途。
本发明还提供了根据本发明的胚胎培养基和/或配子培养基或干细胞培养基在体外培养的胚胎或干细胞中减少或防止氧化应激和/或自由基形成和/或增加抗氧化能力水平用途，和/或改善体外培养的胚胎发育的用途，或改善体外培养的干细胞增殖和分化，或改善配子健康和/或存活力的用途。
在本发明的又一方面，提供了根据本发明的胚胎培养基和/或配子培养基在改善体外受精成功率中的用途。在一个实施方案中，根据本发明的胚胎培养基和/或配子培养基在改善体外受精成功率中的用途不包括将胚胎植入人体或动物体内。
在另一方面，本发明提供了根据本发明的培养基，其在培养胚胎、配子或干细胞中的用途。
附图简述
现在将参照附图仅以举例的方式描述本发明的实施方案，其中：
图1a显示了在20％的氧气中用不同剂量的乙酰肉碱的组胚胎发育；
图1b显示了在20％的氧气中用不同剂量的乙酰半胱氨酸的组胚胎发育；
图1c显示了在20％的氧气中用不同剂量的硫辛酸的组胚胎发育；
图2显示了20％O2培养的胚胎的细胞谱系分配。数据表示为平均值±SEM。亮条和暗条部分分别代表平均TE和ICM细胞。对照(n＝35)，10μM肉碱-10uM半胱氨酸(n＝42)，10μM肉碱-5uM硫辛酸(n＝53)，10μM半胱氨酸-5uM硫辛酸(n＝48)，三重(triple)(10μM肉碱-10μM半胱氨酸-5μM硫辛酸)(n＝44)。3个生物学重复。**P<0.01,****P<0.0001；
图3显示了5％O2中的胚胎培养组的细胞谱系分配。混合物(cocktail)包含10μM肉碱、10μM半胱氨酸和5μM硫辛酸。数据表示为平均值±SEM。亮条和暗条部分分别代表平均TE和ICM细胞。3个生物学重复。对照(n＝154)，混合物(n＝168)。***P<0.005,*P<0.05；
图4显示了20％O2单独培养的胚胎的细胞谱系分配。数据表示为平均值±SEM。亮条和暗条部分分别代表平均TE和ICM细胞。6个生物学重复。对照(n＝116)，混合物(n＝145)。***P<0.005,*P<0.05；
图5显示了以hCG注射后小时表示的主要发育事件的时机。tPNB＝原核破裂的时机，t2＝2-细胞分裂的时机，t3＝3-细胞的时机，t4＝4-细胞分裂的时机，t5＝5-细胞的时机，t6＝6细胞分裂的时机，t8＝8细胞分裂的时机，tCA＝成腔(cavitation)时间(囊胚腔开始形成)，tB＝胚泡形成时间，tE＝胚泡完全展开的时间，tH＝胚泡孵化时间。实线条表示对照；孵化的灰条显示三重混合物处理组**,P<0.01；***,P<0.001；****,P<0.0005。数据表示为平均值±SEM。
图6显示了暴露于三重混合物(triple cocktail)的时间对20％氧气中的胚胎培养组的细胞谱系分配的影响。混合物包含10μM肉碱,10μM半胱氨酸和5μM硫辛酸，其在前2天(G1)或最后3天(G2)中的培养基中或两种培养基(G1&G2)中补充。数据表示为平均值±SEM。亮条和暗条部分分别代表平均TE和ICM细胞。3个生物学重复。对照(n＝92)，G1(n＝84),G2(n＝97),G1&G2(n＝80)。*P<0.05,**P<0.01；
图7显示了BSO对MCB荧光的影响--三个生物学重复(n＝6-12)。**P＝0.004,*P＝0.011；
图8显示了用10uM MCB对胚胎进行荧光标记。混合物包含10μM肉碱、10μM半胱氨酸和5μM硫辛酸。数据表示为平均值±SEM。六个生物学重复(n＝60)。荧光值以任意单位显示。**P<0.01；
图9显示了组合的抗氧化剂对20％氧气单独培养的IVF胚胎的胚泡细胞数目的影响。数据表示为平均值±SEM。亮条和暗条部分分别代表平均TE和ICM细胞。对在20％氧气下单独培养的胚胎进行细胞谱系分配。抗氧化剂(A3)在配子处理/收集培养基和/或培养基中。对照(Con)在配子和/或无抗氧化剂的培养基中：4个生物学重复。Con/Con(n＝34),Con/A3(n＝34),A3/Con(n＝38),A3/A3(n＝48).*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001；
图10显示了组合的抗氧化剂对在20％氧气中单独培养的IVF衍生胚泡的作用--数据表示为平均值±SEM。抗氧化剂(A3)在配子处理/收集培养基和/或培养基中。对照(Con)在配子处理培养基和/或无抗氧化剂的培养基中。3个生物学重复，Con/Con(n＝34),Con/A3(n＝34),A3/Con(n＝38),A3/A3(n＝48).**P<0.01。
图11显示了人类胚泡利用率占受精卵母细胞总数的百分比。在对照组中，选择44个受精卵母细胞中的12个用于进一步临床应用，在补充有10μM乙酰肉碱、10μM乙酰半胱氨酸和5μM硫辛酸的培养基中培养的组中选择49个中的26个用于进一步的临床治疗应用。不选择并丢弃没有达到质量要求的胚泡。使用市售可获得的软件(GraphPad Prism)进行双尾t检验，两组之间的差异是显著的，其中p值为0.0112。
图12显示了人类胚泡利用率占胚泡总数的百分比。在对照组中，选择28个胚泡中的12个用于进一步临床应用，在补充有10μM乙酰肉碱、10μM乙酰半胱氨酸和5μM硫辛酸的培养基中培养的组中选择36个中的26个用于进一步的临床治疗应用。不选择并丢弃没有达到质量要求的胚泡。使用市售可获得的软件(GraphPad Prism)进行双尾t检验，两组之间的差异是显著的，其中p值为0.0173。
图13显示了按胚泡总数，达到良好质量胚泡(GQB)得分的百分比中的人类胚泡比例，所述得分等于根据加德纳(Gardner)胚泡分级系统的3AB或更高得分。在对照组中，30个胚泡中的8个评级为GQB，在补充有10μM乙酰肉碱、10μM乙酰半胱氨酸和5μM硫辛酸的培养基中培养的组中，36个胚泡中的18个评级为GQB。。使用市售可获得的软件(GraphPad Prism)进行双尾t检验，两个组之间的巨大差异由0.0545的p值来说明。
发明详述
本发明基于令人惊讶的发现预测，即浓度为约5至约50μM的乙酰肉碱和浓度为约2.5至约40μM的硫辛酸或其衍生物的特定组合，以及特别地当与浓度为约5至约50μM的乙酰半胱氨酸组合时，显著地改善了体外培养的胚胎发育或体外培养的干细胞的增殖和分化或配子的健康和存活力和/或通过精子对卵母细胞的受精。
本发明涉及配子培养基、胚胎培养基或干细胞培养基，其包含：
a)浓度为约5至约50μM的乙酰肉碱；和
b)浓度为约2.5至约40μM的硫辛酸或其衍生物。
在一个实施方案中，根据本发明的配子培养基、胚胎培养基或干细胞培养基还包含浓度为约5至约50μM的乙酰半胱氨酸。
在一个实施方案中，乙酰肉碱以约5μM至约20μM的浓度存在于本发明的培养基中。
在另一个实施方案中，乙酰肉碱以约5μM至约15μM的浓度存在于本发明的培养基中。
在优选的实施方案中，乙酰肉碱以约10μM的浓度存在于本发明的培养基中。
在另一个实施方案中，硫辛酸或其衍生物以约2.5μM至约20μM(例如5μM至约20μM)的浓度存在于本发明的培养基中。
在另一个实施方案中，硫辛酸或其衍生物以约2.5μM至约10μM(例如5μM至约10μM)的浓度存在于本发明的培养基中。
在优选的实施方案中，硫辛酸或其衍生物以约5μM的浓度存在于本发明的培养基中。
在一个实施方案中，乙酰半胱氨酸以约5μM至约20μM的浓度存在于本发明的培养基中。
在另一个实施方案中，乙酰半胱氨酸以约5μM至约15μM的浓度存在于本发明的培养基中。
在一个实施方案中，乙酰半胱氨酸以约10μM的浓度存在于本发明的培养基中。
合适地，根据本发明的培养基还可以包括一种或多种另外的化合物，例如无机盐、能量源、氨基酸、蛋白质、细胞因子、螯合剂、抗生素、透明质酸、生长因子、激素、维生素和/或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在一个实施方案中，培养基可以包含无机盐。在一个实施方案中，无机盐可以是在水溶液中解离成无机离子的无机盐。合适地，无机盐可以是包含一种或多种以下无机离子的无机盐：Na(+)、K(+)、Cl(-)、Ca(2+)、Mg(2+)、SO(4)(2-)、或PO(4)(2-)。
在一个实施方案中，培养基可以包含能量源。取决于胚胎的发育阶段，能量源可以是丙酮酸、乳酸或葡萄糖。能量源需求从直至8-细胞阶段为止的胚胎在母体遗传控制之下时的丙酮酸-乳酸偏好演化为在支持其从8-细胞发育到胚泡的胚胎基因组激活之后的基于葡萄糖的代谢。
合适地，一种或多种另外的化合物可以是或可以包括乳酸碳水化合物和丙酮酸作为能量源。
在一个实施方案中，一种或多种另外的化合物可以是透明质酸。在一个实施方案中，培养基可以包含氨基酸。氨基酸可以是必需氨基酸。适当地，必须氨基酸包括半胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸和/或色氨酸。在可选的实施方案中，氨基酸可以是非必需氨基酸，如脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸和/或谷氨酸。支持合子发育至8-细胞的培养基通常可以补充有非必需氨基酸，如脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸和/或谷氨酸。支持8-细胞胚胎发育至胚泡阶段的培养基通常补充有必需氨基酸，如半胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸和/或色氨酸。
在一个实施方案中，培养基可以包含蛋白质来源。蛋白质来源可以是白蛋白或合成血清(例如浓度分别为5至20％w/v或v/v)。用于蛋白质补充的合适的来源包括人血清、人脐带血清(HCS)、人血清白蛋白(HSA)、胎牛血清(FCS)或牛血清白蛋白(BSA)。
在一个实施方案中，培养基可以包含生长因子。
在一个实施方案中，一种或多种另外的化合物可以是存在于适于培养胚胎、配子或干细胞的培养基中的任何化合物。
合适地，所述一种或多种另外的化合物包括蛋白质来源，例如人血清白蛋白。
在一个实施方案中，一种或多种另外的化合物可以包括水。
在一个实施方案中，一种或多种另外的化合物可以包括缓冲溶液。
合适的缓冲溶液例如包括HEPES缓冲液或MOPS缓冲液。
在一个实施方案中，一种或多种另外的化合物可以包括水，无机盐和至少一种能量源。
在一个实施方案中，一种或多种另外的化合物可以包括水，无机盐，至少一种能量源和一种或多种氨基酸。
在一个实施方案中，一种或多种另外的化合物可以是或可以包含至少一种能量源(例如碳水化合物，如乳酸/盐，丙酮酸/盐)、蛋白质源(例如人血清白蛋白)，和水或缓冲溶液。
在一个实施方案中，一种或多种另外的化合物可以是或可以包含能量源(例如碳水化合物，如乳酸/盐，丙酮酸/盐)、氨基酸、透明质酸和水或缓冲溶液。
一种或多种另外的化合物可以是适合于培养配子、胚胎或干细胞的培养基的形式，所述培养基可以称为背景培养基。
如本文所用，术语“培养基”不限于培养(例如在适合生长的条件下)的培养基，还包括使用处理或收集或操作配子、胚胎和/或干细胞的培养基。
适当地，一种或多种另外的化合物可以形成缓冲介质(如碳酸氢盐缓冲介质)。
一种或多种另外的化合物可以是设计为支持直至4-细胞阶段的胚胎(例如哺乳动物胚胎)的培养基的形式，该培养基可以称为背景培养基。
一种或多种另外的化合物可以是设计为支持直至8-细胞阶段的胚胎(例如哺乳动物胚胎)的培养基的形式，该培养基可以称为背景培养基。
一种或多种另外的化合物可以是设计为支持直至胚泡阶段的胚胎(例如哺乳动物胚胎)的培养基的形式，该培养基可以称为背景培养基。
所述(背景)培养基可以是任何适合培养胚胎、配子或干细胞的培养基。
在一个实施方案中，(背景)培养基可以是胚胎转移特异性培养基。
在一个实施方案中，(背景)培养基可以是由以下组成的组中的一个或多个：配子处理培养基(包含配子收集培养基)、用于胞质内精子注射(ICSI)的培养基、受精培养基、单一步骤胚胎培养基、胚胎转移培养基、卵母细胞成熟培养基、精子制备和受精培养基，或用于配子或胚胎的任何其它合适的培养基。
在一个实施方案中，根据本发明的胚胎培养基或配子培养基可以是由以下组成的组中的一个或多个：配子处理培养基(包含配子收集培养基)、用于胞质内精子注射(ICSI)的培养基、受精培养基、单一步骤胚胎培养基、胚胎转移培养基、卵母细胞成熟培养基、精子制备和受精培养基，或用于配子或胚胎的任何其它合适的培养基。
在一个实施方案中，(背景)培养基任何商业上可用的简单培养基，如人类输卵管液(HTF)、Whittingham氏T6培养基和Earle氏平衡盐溶液(EBSS)(可从Irvine Scientific获得)。
在一个实施方案中，(背景)培养基可以是基本培养基，如来自Vitrolife的IVFTM。可认为IVFTM是受精培养基。
在一个实施方案中，认为IVF培养基是受精培养基。
或者或另外，培养基可以是以下一种或多种培养基：G-1TM、G-2TM、HSA-solutionTM、G-MOPSTMPlus、G-MOPSTM、Embryo GlueTM、ICSITM或G-TLTM或其组合。这些产品可从VitrolifeAB,瑞典获得。这些可以称为背景培养基。
在一个实施方案中，合适的处理介质(如配子处理介质)可以是G-MOPSTM。
在一个实施方案中，合适的单一步骤培养介质可以是G-TLTM。
在一个实施方案中，胚胎转移介质可以是胚胎GlueTM。在一些实施方案中，胚胎转移介质可以称为促进植入的转移培养基。
在一个实施方案中，(背景)培养基可以是诸如卵母细胞成熟培养基或精子制备和受精培养基或其组合的培养基。
已经设计了卵母细胞成熟培养基以提供培养的卵母细胞的改善的发育和存活。下表提供了合适的卵母细胞成熟培养基的完整配方：
除非另有说明，本表中的浓度均以mM计；培养基是含水的。
下表提供了合适的精子制备和受精培养基的完整配方：
除非另有说明，本表中的浓度均以mM计；培养基是含水的。
设计了用于胞质内精子注射(ICSI)的培养基(例如ICSITM)以帮助精子处理、促进精子固定并在受精期间注射入卵母细胞。下表提供了用于ICSI的合适的培养基的配方：
设计了G-1TM培养基以支持将卵裂阶段胚胎发育至8-细胞阶段左右。此类培养基含有碳水化合物，氨基酸和螯合剂以支持早期胚胎。下表中提供了用于G-1TM培养基的完整配方：
除非另有说明，本表中的浓度均以mM计。
或者，(背景)培养基可以是能够在第3天(8-细胞阶段)之后支持胚胎的市售IVF培养基。这些培养基已经标记为在植入之前将胚胎带到胚泡阶段。一个实例包括α-修饰的基础培养基(αMEM)，其描述于Desai et al(Human Reprod.12:328-335(1997))。第二个实例包括HECM-6培养基加上泛酸(McKiernan SH&Bavister BD,Human Reprod.15:157-164(2000)。其它实例包括可从Vitrolife获得的G-2TM。设计了G-2TM培养基以将胚胎从8-细胞阶段左右(3天)发育至胚泡阶段。此类培养基含有碳水化合物、氨基酸和维生素以支持较晚期胚胎。
下表提供了用于G-2TM培养基的完整配方：
除非另有说明，本表中的浓度均以mM计。
在一个实施方案中，将8-细胞阶段胚胎从根据本发明补充的优化为支持早期阶段生长(即直到8-细胞阶段)的胚胎培养基转移到可以根据本发明进一步补充的优化为支持较晚期生长(即直到胚泡阶段)的培养基。
培养基中每种化合物的浓度可以根据培养基优化所针对的胚胎发育阶段而变化。无机盐在培养基中的典型浓度可以是约100mM至约150mM或约110mM至约140mM。
能量源在培养基中的典型浓度可以是约5mM至约40mM，例如约5mM至约30mM，或约5mM至约15mM。
培养基中氨基酸总量的典型浓度可以是约0.1mM至约15mM或约0.5mM至约12mM，或约0.5mM至约6mM。
培养基中的维生素、生长因子、激素和其它各种成分倾向于以相当低的浓度加入，例如1mM或更少，0.5mM或更少或甚至0.1mM或更少。
胚胎、配子或干细胞优选在石蜡油下培养。这可以防止培养基的蒸发，并从而保持恒定的渗透压。另外，油可以使pH和温度的波动最小化。
在一个实施方案中，本发明的培养基可以包含抗生素。适当的抗生素的一些例子包括青霉素和链霉素。
在一个实施方案中，本发明提供了处理和/或操作和/或培养胚胎和配子的方法，所述方法包括在根据本发明的培养基中处理和/或操作和/或培养胚胎和配子。
本发明包括在配子处理(例如在配子处理培养基(包括配子收集培养基)中，在精子制备培养基中，在卵母细胞成熟培养基中或用于配子的任何其他合适的培养基中)和胚胎操作(例如在用于胞质内精子注射(ICSI)的培养基中，在受精培养基中，在单一步骤胚胎培养基中，在胚胎转移培养基中或用于胚胎的任何其他合适的培养基中)两者期间，使用乙酰肉碱(例如以5-50μM的浓度)和硫辛酸或其衍生物(例如以约2.5至约40μM的浓度)，以及任选地乙酰半胱氨酸(例如以约5至约50μM的浓度)的组合。
在一个实施方案中，本发明涉及在配子处理(例如在配子收集培养基中)期间和在胚胎操作期间，如在ICSI或受精或胚胎转移(如在用于胞质内精子注射(ICSI)的培养基中或在受精培养基或在胚胎转移培养基中)两者期间，使用乙酰肉碱(例如以5-50μM的浓度)和硫辛酸或其衍生物(例如以约2.5至约40μM的浓度)，以及任选地乙酰半胱氨酸(例如以约5至约50μM的浓度)的组合。
在一个实施方案中，本发明涉及乙酰肉碱(例如以5-50μM的浓度)和硫辛酸或其衍生物(例如以约2.5至约40μM的浓度)，以及任选地乙酰半胱氨酸(例如以约5至约50μM的浓度)的组合在胚胎培养基中的用途。
在一些实施方案中，在配子处理期间和/或在胚胎操作期间和/或在胚胎培养期间添加用于本发明的化合物。换句话说，可以在IVF/ICSI过程期间的多个阶段加入用于本发明的化合物。
在一些实施方案中，将用于本发明的化合物添加到配子处理培养基和/或胚胎操作培养基和/或胚胎培养基中。如本文所用，术语“操作”可以包括例如配子，胚胎或干细胞的任何保持或移动。例如，这可以包括在收集或转移用于植入的胚胎期间和之后的配子转移。
如本文所用，术语“操作”可以包括配子和/或胚胎和/或干细胞的任何操作。例如，这可以包括ICSI或受精(例如通过使精子对卵子受精)。
如本文所用，术语“培养”可以意指在适合生长或成熟的条件下保持。
优选地，培养基的pH(保持在)约7.2至7.4之间(在培养期间)。
令人惊讶地发现，根据本发明的培养基在体外培养的胚胎、配子或干细胞中减少或防止氧化应激和/或减少或防止自由基形成(如活性氧类别(ROS)形成)和/或增加抗氧化能力水平。
氧化应激反映了活性氧类别的系统性表现与胚胎或干细胞容易对反应性中间体解毒或修复所造成的损害的能力之间的不平衡。细胞正常氧化还原状态的紊乱可以通过产生损害细胞所有组分(包括蛋白质、脂质和DNA)的过氧化物和自由基而引起毒性效应。来自氧化代谢的氧化应激导致碱基损伤，以及DNA中的链断裂。碱基损伤大多是间接的，并且由产生的活性氧类别(ROS)例如O2-(超氧自由基)、OH(羟基自由基)和H2O2(过氧化氢)引起。此外，一些活性氧类别在氧化还原信号传导中充当细胞信使。因此，氧化应激可导致正常的细胞信号传导机制的破坏。
如本文所用，术语“抗氧化能力”意指胚胎或干细胞容忍氧化应激的能力。可通过测量胚胎的生长率和/或通过测量细胞内谷胱甘肽(GSH)来间接测量抗氧化能力(如下面的方法和材料部分中详述)。
在一个实施方案中，根据本发明的培养基将体外培养胚胎中的GSH水平维持于与体内发育胚胎的水平基本相同的水平。换言之，与缺少该化合物的组合的培养基中体外培养的胚胎相比，根据本发明的培养基中本文教导的乙酰肉碱，硫辛酸和(任选地)乙酰半胱氨酸的特定组合增加了体外培养的胚胎的GSH水平。
不希望受理论束缚，GSH是巯基硫醇肽，其在保护细胞免受氧化损伤方面起关键作用。它在胚胎发育中的作用已经在胚胎发育事件期间的细胞增殖和进展中得到证实。GSH合成取决于半胱氨酸的可用性，并且由于反馈抑制，细胞内半胱氨酸水平决定细胞GSH的上限浓度。因此，GSH的增加可能由于更强的抗氧化能力而保护细胞免受氧化应激，从而有助于提高胚胎质量。
可以通过测量以下来测量生长率：测量滋养外胚层细胞数目、内细胞团数目，或总细胞数目(例如在本发明的培养基中培养2天时，或在胚泡阶段，例如适当地当在本发明的培养基中培养5天时测量时；通过测量到达扩张的胚泡的时间；和/或通过测量到达孵化胚泡的时间)。
另外/或者，令人惊讶地发现，根据本发明的培养基改善了体外培养的胚胎发育。
如本文所用，与胚胎相关的术语“改善发育”可以包括以下的一个或多个：
a)增加胚泡阶段的胚胎中滋养外胚层细胞数目，例如当在本发明的培养基中培养5至6天测量时)；
b)增加胚泡阶段的胚胎中的内细胞团，例如当在本发明的培养基中培养5至6天测量时；
c)增加胚泡阶段的胚胎中总细胞数目，例如当在本发明的培养基中培养5至6天测量时)；
d)减少到达扩张的胚泡的时间；
e)减少到达孵化胚泡的时间；
f)胚胎转移后胎儿重量的增加；
g)胚胎转移后胎儿顶臀长增加；
h)胚胎转移后胎盘重量增加；
i)与在不含抗氧化剂的相当培养基中培养的胚胎相比，良好质量胚泡(GQB)(即根据加德纳胚泡分级系统(参见Gardner et al 1999)，达到3AB或更高得分的胚泡分数)/胚泡总细胞数的增加。
j)胚泡利用率(即，新鲜使用以转移给患者或冷冻保存以供随后转移给患者的胚泡分数，例如以受精卵母细胞总数的百分比或胚泡总数的百分比计)增加。
术语“内细胞团(ICM)”在本文中定义为最终将导致胚胎确定性结构的胚胎内的细胞团。内细胞团也可称为成胚细胞或多胚。
术语“滋养外胚层(TE)”在本文中定义为形成胚泡外层的细胞，例如该细胞为胚胎提供营养并发育为胎盘的大部分。
如本文所用，“扩张的胚泡”意指当囊胚腔大于胚胎时的发育阶段。通常这与胚泡壳(透明带)变薄相结合。
如本文所用，术语“孵化胚泡”意指胚胎从包裹的透明带中释放出来的时点。通过一系列的扩张-收缩循环，胚胎弄破了覆盖物。这是由溶解对胚极处的透明带的酶支持的。节律性的扩张和收缩导致胚胎从刚性糖蛋白外套(透明带)破裂和出现。
术语“改善”(例如关于发育和/或增殖和/或分化)意指与对照(例如生长在类似培养基中，但是所述类似培养基不含如本发明定义的乙酰肉碱和硫辛酸或其衍生物的组合或乙酰肉碱和硫辛酸或其衍生物和乙酰半胱氨酸的组合)相比改善。
在优选实施方案中，胚胎是哺乳动物胚胎，例如人类胚胎。
在一个实施方案中，胚胎是人类胚胎。
胚胎发育的植入前期在哺乳动物物种之间变化。然而，人类和小鼠的胚胎共享最相似的发育长度(约4至5天)并也展示了十分相似的植入。两种物种的胚泡达到相似的大小，并且小鼠和人与小鼠的胚胎之间的营养物利用模式非常相似(例如参见Gott AL,HardyK,Winston RM,Leese HJ.Non-invasive measurement of pyruvate and glucose uptakeand lactate production by single human preimplantation embryos.HumReprod.1990；5(1):104-8；Leese HJ,Barton AM.Pyruvate and glucose uptake bymouse ova and preimplantation embryos.J Reprod Fertil.1984；72(1):9-13；andGardner DK,Wale PL.Analysis of metabolism to select viable human embryos fortransfer.Fertility and Sterility.2013；99(4):1062-72)。人类和小鼠发育所共享的相似性使得它们允许从鼠系统进行的实验来评估人类发育(参见Csaba Pribensky etal.Reproductive Biomedicine Online(2010)20,371-379。因此，认为小鼠是人类植入前胚胎的最合适的模型。
如本文所用，术语“配子”可以指卵母细胞和/或精子细胞。
如本文所用，术语“胚胎”可以具有宽泛的定义，其包括前胚胎阶段。如本文所用，术语“胚胎”可以涵盖从通过接触使卵母细胞受精、桑椹胚、胚泡阶段、孵化和植入的所有发育阶段。
在一些情况下，术语“胚胎”用于描述子宫中植入后受精的卵母细胞，直至受精后8周，在该阶段其成为人类胎儿。根据该定义，受精的卵母细胞通常称为前胚胎，直到植入发生。然而，如上所述，如本文所用，术语“胚胎”可以包含前胚胎阶段。
胚胎近似为球形，并且由称为透明带的无细胞基质包围的一个或多个细胞(卵裂球)组成。透明带在胚胎孵化前执行各种功能，是胚胎评估的一个良好的标记。透明带是球形和半透明的，并且应该与细胞碎片清楚区分。
受精是精子细胞被卵母细胞识别和接受的时间点。卵母细胞的减数分裂周期暂停在第二次减数分裂的中期之后，精子细胞触发卵子活化。这导致第二极体的产生和挤出。这是在本文中称作第二极体排出的时间点(参见参考值ii)。精子和卵子融合后几个小时，DNA开始合成。出现雄性和雌性原核(PN)。这是称为原核(PN)出现时的时间点(参见参考值iii)。PN移动到卵子的中心并且膜破裂和PN消失。这是本文称为原核消失(或消退)的时间点(参见参考值i.)。两种基因组的此组合称为融合生殖(syngamy)。此后，细胞分裂开始。
胚胎发育期间，卵裂球数量以几何方式(1-2-4-8-16-等)增加。在人类胚胎中，同步细胞分裂通常保持到8-细胞阶段。此后，细胞分裂变得异步并且最后个体细胞拥有自己的细胞周期。在不育症治疗过程中产生的人胚胎通常在8-卵裂球阶段前转移至接受者。在一些情况下，转移前也将人胚胎培养到胚泡阶段。优选地，这在当许多良好质量胚胎是可用的或需要延长的温育以等待植入前基因诊断(PGD)的结果时完成。然而，随着温育技术的改进，存在着延长温育的趋势。
因此，以下使用的术语胚胎表示以下的每个阶段：受精的卵母细胞、合子、2-细胞、4-细胞、8-细胞、16-细胞、紧贴(compaction)、桑椹胚、胚泡、扩张的胚泡和孵化胚泡，以及之间的阶段(如3-细胞或5-细胞)。
当通过融合或注射精子细胞(精子)使卵母细胞受精时形成胚胎。该术语传统上也用于在孵化(即透明带的破裂)和随后的植入后。对于人类来说，受精的卵母细胞传统上对于前8周被称为合子或胚胎。在此之后(即8周后和当所有主要器官都已经形成时)，其称为胎儿。然而，合子、胚胎和胎儿之间的区别通常并不明确。术语胚胎和合子在本文中可互换使用。
在一个实施方案中，可以单独培养胚胎。
在又一实施方案中，胚胎培养与本发明的培养基中，直至胚泡阶段、扩张的胚泡阶段或孵化的胚泡阶段。
另外/或者，令人惊讶地发现，根据本发明的培养基改善了体外培养的干细胞的增殖和分化。
如本文所用，术语“分化”(如与干细胞发育相关)意指细胞从一种细胞类型变为另一种细胞的过程。该术语可包含例如在细胞生长过程中，不太特化的细胞类型成为更为特化的细胞类型。
如本文所用，术语“增殖”(如与干细胞发育相关)意指例如导致干细胞群体扩张的干细胞操作。
如本文所用，术语“干细胞”意指未分化的生物细胞，其能够分化为特化的细胞并能够分裂(通过有丝分裂)以产生更多干细胞。术语“干细胞”涵盖胚胎干细胞(可分离自胚泡的内细胞团)和成体干细胞(其可存在于多种组织中)两者。另外/或者，如本文所用，术语“干细胞”意指诱导的多能干细胞(iPSC)。iPSC是能够直接从成体细胞产生的多能干细胞类型。
在一个实施方案中，术语干细胞意指胚胎干细胞。
值得注意的是，胚胎干细胞来源于胚胎的内细胞团。本发明的发明人已经显示了本发明的培养基保护和/或改善内细胞团的发育。因此，本发明的培养基保护源自内细胞团的胚胎干细胞。
在一个实施方案中，干细胞可以是人类干细胞。
在一个实施方案中，(背景)培养基可以是对干细胞培养物特异性的培养基。任何已知的干细胞培养基可用作背景培养基。
在一个实施方案中，干细胞(背景)培养基可以是用于培养多能干细胞的培养基。
在一个实施方案中，干细胞(背景)培养基可以是用于培养人类胚胎干细胞和/或iPS细胞的培养基。
在一个实施方案中，干细胞(背景)培养基可以是称为mTeSRTM1的市售培养基，例如用于人胚胎干细胞和iPS细胞的明确的无饲养层的维持培养基(可获自StemCellTMTechnologies,UK)。
胚胎或干细胞可以在氧含量为5-20％v/v的环境中培养。
在一个实施方案中，胚胎、配子或干细胞在环境氧条件下培养。如本文所用，环境氧条件可以在约18-22％v/v之间或在约19-21％v/v之间。在一个实施方案中，环境氧条件约为20％v/v。
在另一个实施方案中，在降低的氧条件下培养胚胎、配子或干细胞。如本文所用，降低的氧条件可以是在约3％(v/v)至约7％(v/v)或约4％(v/v)至约6％(v/v)之间的氧浓度。在一个实施方案中，降低的氧条件为约5％(v/v)。
本发明涉及硫辛酸或其衍生物的用途。术语硫辛酸可意指α-硫辛酸。该化合物可以是任何外消旋形式，例如(±)-1,2-二硫戊环-3-戊酸、(R)-5-(1,2-二硫戊环-3-yl)戊酸，或(S)-1,2-二硫戊环-3-戊酸。硫辛酸或其衍生物可以作为对映体形式的混合物或作为单一对映体添加。在后一种情况下，已发现R-对映异构体更具生物活性。用于本发明的硫辛酸的一种衍生物是硫辛酸盐/酯。硫辛酸盐/酯是硫辛酸的盐或酯衍生物。硫辛酸的另一衍生物包括甲基化的硫辛酸。如本文所用，与硫辛酸有关的术语“衍生物”意指具有与硫辛酸基本上等同的生理学性质的生物活性两亲性二硫化物/二硫辛酸分子。
如本文所用，术语“乙酰半胱氨酸”可以是N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)(如未修饰的NAC)或其衍生物，如N-乙酰半胱氨酸-酰胺(NACA)。
在优选的实施方案中，如本文所用，术语“乙酰半胱氨酸”意指N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)(如未修饰的NAC)。
术语乙酰肉碱可以称为乙酰基-L-肉碱。
在一个实施方案中，可以在约35℃至约39℃的温度在本发明的培养基中培养胚胎或干细胞。
在优选的实施方案中，可以在约36.5℃至约37.5℃的温度在本发明的培养基中培养胚胎或干细胞。
在最优选的实施方案中，可以在约37℃的温度在本发明的培养基中培养胚胎或干细胞。
在一个实施方案中，根据本发明的培养基不含辅酶Q或泛醌。
在一个实施方案中，根据本发明的培养基在最终组合物中不含以重量计的0.0001％至0.005％范围内的辅酶Q或泛醌。
在一个实施方案中，根据本发明的培养基不含聚山梨酸酯表面活性剂。聚山梨酸酯表面活性剂例如可以是吐温TM或SpanTM。
如本文所提及，对配子的引用包括单个配子和多个配子。换句话说，配子意指“一个或多个配子”。
如本文所提及，对胚胎的引用包括单个胚胎和多个胚胎。换句话说，配子意指“一个或多个胚胎”。
如本文所提及，对干细胞的引用包括单个干细胞和多个干细胞。换句话说，配子意指“一个或多个干细胞”。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。Singleton,et al.,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY,20ED.,John Wiley and Sons,New York(1994)，以及Hale&Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)向技术人员提供本公开中使用的许多术语的通用词典。
本公开不受在此公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可以用于本公开的实施方案的实践或测试中。
在提供数值范围的情况下，应该理解，除非上下文清楚地另外指明，否则在该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限单位的十分之一)也被具体地公开。在所述范围内的任何规定值或中间值与该规定范围内的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围包含在本公开内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在外，并且其中任一个或两个限制都包括在较小范围内的每个范围也包含在本公开的内容中，受限于所述范围内的任何特别排除的限制。在所述范围包括一个或两个限制的情况下，排除那些所包括的限制中的任一个或两个的范围也包括在本公开中。
应当理解，如本文所用和在所附的权利要求书中，除非上下文另有明确规定，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数引用。因此，例如，对“胚胎”的引用包括多个此类候选胚胎，等等。
本文讨论的出版物仅仅提供其在本申请的提交日期之前公开。本文没有任何内容解释为承认此类出版物构成了所附权利要求书的现有技术。
本申请中或在本申请中引用的所有专利和非专利参考文献也通过引用整体并入本文。
现在将参照下面的附图和实施例仅以举例的方式描述本发明。
实施例
方法和材料
胚胎收集
对3-4周龄的F1未受精(virgin)杂交雌性小鼠(C57BL/6x CBA)腹膜内注射5IU的怀孕母马血清促性腺激素。48小时后，施用5IU的人绒毛膜促性腺激素，并且雌性小鼠与>12周龄的F1雄性小鼠交配。次日早餐，通过阴道粘液塞的存在来确认交配成功。hCG注射后22小时收集前核卵母细胞，置于预热的补充有5mg/ml人血清白蛋白的处理培养基(G-MOPS)中。用含有300IU/ml透明质酸酶的GMOPS从卵母细胞上剥下卵丘细胞。对所有胚胎在G-MOPS培养基中洗涤两次和在G-1TM培养基中洗涤一次，之后分配以培养。将动物饲养在12小时光照日光照周期中，食物和水随意供应。所有的小鼠实验都得到了机构动物伦理委员会的批准。
胚胎培养
胚胎在石蜡油下的20ul培养基液滴中，在空气中6％CO2(大气氧约20％)或在6％CO2 5％氧气中，在加湿的多气体培养箱(Sanyo MCOK-5M[RC],日本)中37℃下以各组10个培养。在G-1TM培养基(G-1TM，具有HSA-solutionTM,Vitrolife)中培养胚胎48小时，并且然后在G-2TM培养基(G-2TM，具有HSA-solutionTM,Vitrolife)中继续培养48小时。在转移之前，将在第4天选择用于子宫转移的胚泡于G2培养基中培养24小时。所有培养物在35mm培养皿(Falcon,BD Biosciences)中进行。
胚胎转移
将8-12周龄F1雌性小鼠与切除输精管(vasectomised)的雄性交配以建立假孕。次日早餐，通过阴道塞的存在来确认交配成功。将第4天的胚泡(授精后96小时)手术转移至第4天假孕雌性小鼠的子宫(与接受体雌性生殖道同步)。用异氟烷气体麻醉受体雌性小鼠。用玻璃移液管通过背侧切口将五个胚胎移植到每个子宫角(horn)的腔中，其中每个接受体雌性从对照组和治疗组接受胚胎。为了避免任何优先植入的偏倚，将交替的组(alternategroups)转移到每个接受体的右角和左角两者。胚胎转移之后，用无菌手术夹密封皮肤伤口。在10天后处死怀孕的雌性，并且记录胎儿发育或吸收部位。测量顶臀长、胚胎和胎盘重量，并且测定胎儿耳，眼和肢体发育的形态等级，如由Wahlsten和Wainwright(1977)(J.ofEmbryology and Experimental Morphology 42:79-92)设计的，通过引用将其并入本文。
测定胚胎细胞数
通过本领域公知的技术进行胚胎的差异染色以测定第5天时(例如在胚泡中)细胞至内细胞团(ICM)和滋养外胚层(TE)的分配。简而言之，使用链霉蛋白酶去除带后，用互补反应处理胚胎，所述互补反应用碘化丙啶标记TE核，并且保持ICM完整和未标记。在双苯甲亚胺处理后，所有细胞核被染色。将胚胎整装在甘油中，并且使用配有数码相机(Nikondigital sight DS-Fi1)的倒置荧光显微镜(Nikon Eclipse TS100)成像，并且使用成像软件ImageJ对核计数。
用于MCB和BSO处理的胚胎培养
将胚胎以各组10个在石蜡油(Ovoil,Vitrolife)下的20ul培养基液滴中，在6％CO2,20％O2 74％N2，在加湿的多气体培养箱(Sanyo MCOK-5M[RC],日本)中37℃下培养。将一半的胚胎分配到对照组，另一半分配到处理组。将对照组胚胎在G-1TM培养基(G-1TM，具有HSA-solutionTM,Vitrolife)中培养4小时。将处理组胚胎同样用在补充了最佳三重抗氧化剂剂量的G-1TM培养基(如实施例2中所确定)中培养。
BSO剂量优化
收集后，立即在掺有0、50、100、200、400、800、1600μM的剂量的BSO的G-1TM培养基中于37℃在6％CO2,20％O2 74％N2下孵育前核对照胚胎达4小时。用具有HSA-solutionTM的G-1TM培养基彻底清洗胚胎，并分别放入具有HSA-solutionTM的GMOPS(G-MOPSTM Plus,Vitrolife AB,Sweden)的2μl液滴中，所述液滴在玻璃底皿(Fluorodish,CoherentScientific,Australia)上制备，并且用石蜡油(Ovoil,Vitrolife)覆盖用于荧光成像。通过在荧光显微镜(Nikon Eclipse TS100)下记录360±40nm/460±40nm激发/发射波长处的荧光来确定最佳剂量。通过从所记录的荧光中减去空白值(没有BSO暴露的胚胎)和培养基的基础水平来计算结果。所有使用的培养基和油在37℃下在6％CO2,20％O2 74％N2中预平衡过夜。
MCB剂量优化
MCB荧光探针优化与BSO优化类似地进行，如前所述，在补充有0、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320、640μM剂量的MCB的G-1TM培养基中培养胚胎达15分钟。
验证MCB对谷胱甘肽(GSH)的特异性
用200μM BSO和10μM MCB的最佳剂量来验证MCB对GSH的特异性。以与如先前描述的探针剂量优化相同的方式进行验证。收集后，立即将前核胚胎在补充有200μM BSO的G-1TM培养基中温育4小时。在具有HSA-solutionTM的G-1TM培养基中彻底冲洗后，在10μM MCB中进一步培养胚胎15分钟。在具有HSA-solutionTM的G-1TM培养基中最后彻底冲洗后，将胚胎分别放入石蜡油下具有HSA-solutionTM的G-MOPSTM的2μl液滴中，并拍摄荧光图像。
谷胱甘肽水平的测定
在卵母细胞收集和温育后4小时，来自对照组和处理组的胚胎在相同的培养条件下用10μM MCB处理15分钟。在对胚胎清洗并放入单独的2ul G-1TM培养基滴液后，如前所述捕获荧光。每10分钟取得图像以评估MCB的时间进程。
统计分析
对与对照相比所有处理的细胞数数据进行单因素方差分析(ANOVA)，随后进行Bonferroni多重比较检验。比例数据使用3x2列联表进行比较。对于单剂量，使用Studentt-检验将数据平均值与对照进行比较。在使用Bartlett检验进行分析之前，所有组均进行了正态性检验。在0.05的P值下，差异被认为是生物学显著的。所有分析均使用Windows版的GraphPad Prism 5.04版(可获自GraphPad Software)进行。
实施例1：用单一化合物在20％O2中的组胚胎发育
对照组中培养的胚胎在补充有HSA 5mg/ml(HSA,Vitrolife)的G-TM1和G-2TM培养基中生长。将处理组中的胚胎类似地与G-TM1和G-2TM培养基中以1,10和100μM剂量补充的乙酰肉碱、乙酰半胱氨酸或α-硫辛酸(Sigma Aldrich,USA)一起培养并且补充作为对照组的HAS。通过培养胚胎并分析获得的胚泡细胞谱系数目来确定肉碱(代表两个独立实验的图1a和表1a)、半胱氨酸(代表两个独立实验的图1b和表1b)和硫辛酸(图1c和表1c)的最佳剂量。“总平均值”意指第5天时胚胎(包括内细胞团和滋养外胚层)的平均总细胞数。导致显著更高细胞数量的剂量被认为是最佳的剂量。发现乙酰肉碱的最佳剂量为10μM，其具有显著增加的滋养外胚层细胞，导致胚泡细胞数量增加。类似地，乙酰半胱氨酸的最佳剂量为10μM，其具有显著增加的胚泡内细胞数量。发现硫辛酸的最佳剂量为5μM，其显示出显著更高的滋养外胚层和内细胞数目，导致增加的胚泡细胞数。与对照相比，任何处理对胚泡形成没有负面影响(数据未示出)。
表1a：
处理 胚胎编号 总平均值
对照 11 90.09
1μM 13 95.85
10μM 11 107.83
30μM 14 86.93
1000μM 17 67.41
表1b：
处理 胚胎编号 总平均值
对照 12 93.75
1μM 12 81.92
10μM 7 109.29
30μM 8 104.38
1000μM 12 95.17
表1c
另外，这些数据表明，单独提高单一化合物的浓度不会带来与本发明的组合相关的益处。
实施例2：组合的抗氧化剂对胚泡细胞数量的影响。
对照组中培养的胚胎在补充有HSA-solutionTM 5mg/ml的G-TM1和G-2TM培养基中生长。对照组中的胚胎以类似的方式在补充有10μM乙酰肉碱-10μM乙酰半胱氨酸，10μM乙酰肉碱-5μM硫辛酸，10μM乙酰半胱氨酸-5μM硫辛酸，10μM乙酰肉碱10μM乙酰半胱氨酸5μM硫辛酸的三重混合物的G-TM1和G-2TM培养基中培养并补充HAS。培养5天后，用三重抗氧化剂处理的胚胎中的胚泡细胞数量显著高于二重抗氧化剂处理。虽然10uM肉碱-5uM硫辛酸组相较于对照也具有显著更高的总细胞数量，但三重混合物也具有显著增加的TE细胞，这有助于更高的细胞总数(图2)。
实施例3：在5％O2中用组合的化合物的组胚胎发育
胚胎以各组10个在石蜡油(Ovoil,Vitrolife)下的20ul培养基液滴中，在6％CO2,5％O2 89％N2，在加湿的多气体培养箱(Sanyo MCOK-5M[RC],日本)中37℃下培养。将一半的胚胎分配到对照组，另一半分配到处理组。如先前测定的，用在培养基中补充的最佳抗氧化剂剂量来培养处理组胚胎。当在5％O2下培养时，用三重混合物分别培养的胚胎具有显著增加的ICM和滋养外胚层细胞，导致增加的胚泡总细胞数目(图3)。
实施例4：用组合的化合物在20％O2中的单独胚胎培养物
胚胎在石蜡油下的20ul培养基液滴中，在空气(大气氧约20％)中6％CO2在加湿的多气体培养箱(Sanyo MCOK-5M[RC],日本)中37℃下单独培养。将一半的胚胎分配到对照组，另一半分配到处理组。用三重混合物单独培养的胚胎显著增加了ICM和滋养外胚层细胞，导致增加的胚泡总细胞数量(图4)这些结果表明在单独培养期间也观察到改善的胚胎发育。尽管单独培养的胚胎中总细胞数目较低，但是与在组中培养的胚胎形成对比，组合的抗氧化剂对单独培养的胚胎影响更大，其具有增加的ICM、TE和总细胞数量(图4比图2)。
实施例5：在三重混合物情况下单独胚胎培养物的分裂和发育时间
使用PrimoVison(Vitrolife)，利用配有明场光学元件(MCOK-5M[RC],Sanyo,Osaka,日本)和Embryo ScopeTM(Unisense FertiliTech)延时成像系统的双重气体恒温培养箱获得胚胎发育动力学。胚胎在对照组中和在最佳抗氧化剂的处理组中单独培养，并且在细胞培养期间以15分钟间隔来生成延迟图像。形态动力学(Morphokinetic)事件时机被记录为hCG施用后的小时。在20％O2，在补充有包含10μM肉碱、10μM半胱氨酸和5μM硫辛酸10μM的抗氧化剂的培养基中或在不含抗氧化剂的对照培养基中单独培养的胚胎的细胞分裂和发育时机(图5)。发育动力学分析显示，与在对照组中培养的胚胎相比，在三重混合物组中培养的胚胎具有显著更快的到扩张的胚泡(99.8±0.5h对102.8±0.7h；P<0.05)和孵化的胚泡(102.6±0.8h对104.9±1.1h；P<0.01)的时间(图5)，说明暴露于抗氧化剂的益处随着胚泡发育而在后来的发育中可见。
实施例6：对化合物的暴露时间的影响
对抗氧化剂的暴露时间的影响
胚泡内细胞团数目显著增加，导致与对照相比，在长达5天的整个培养期期间补充有混合物的培养基中生长的胚胎的总细胞数目显著增加(G1和G2)。仅培养基G-1TM中补充的培养基中生长的胚胎的胚泡总细胞数目也显著增加(图6)，说明预紧贴(pre-compaction)益处。
实施例7：由BSO特异性导致的关联GSH耗竭
发现最优探针剂量为200μM丁硫氨酸硫酸亚胺(buthionine sulfoximine，BSO)和10μM/ml单氯二胺(monochlorobimane，MCB)。BSO是谷胱甘肽合成酶的抑制剂。MCB结合还原型谷胱甘肽(GSH)并且是用于测量细胞内GSH的GSH荧光标志物。
与仅用MCB处理的组相比，用200μM BSO预处理并随后用10μM/ml或40μmol/ml MCB处理的胚胎显示出显著减少的荧光(图7)。结果表明BSO与谷胱甘肽合成酶的高度特异性结合减少了GSH的内源性浓度，从而导致较低的荧光水平。该图显示，与仅用MCB处理的胚胎相比，在用200μM BSO与10μM或40μM MCB的组合处理的胚胎中荧光显著降低。与40μM(P＝0.011)相比，10μM MCB具有更大的荧光降低(P＝0.004)，因此在后续试验中使用该浓度(40μM)。有趣的是，在80μM MCB处，BSO处理和非BSO处理组之间没有显著的荧光差异，说明在较高MCB浓度下，由于高MCB荧光水平，无法检测由于BSO螯合所致的荧光降低。
实施例8：抗氧化剂对胚胎GSH水平的影响
按照材料和方法部分(参见“用于MCB和BSO处理的胚胎培养”部分)对胚胎进行培养，并且在上述材料和方法部分的“测定谷胱甘肽水平”期间测定谷胱甘肽(GSH)水平。与体内冲出胚胎相比，在缺少化合物(如抗氧化剂)中培养的对照组中的胚胎具有显著更低的GSH水平(P<0.01)(图8)。然而，当用三重抗氧化剂混合物培养胚胎时，GSH的水平与在体内发育的胚胎的GSH水平相似，说明抗氧化剂在体外培养的胚胎内维持GSH的水平。
实施例9：化合物对胎儿发育及妊娠的影响(20％O2)，
在胚泡转移到假孕接受体之后，与对照相比，在抗氧化剂存在下培养的胚胎导致显著更长的顶臀长(11.6±0.1mm对11.3±0.1mm；P<0.01)，更重的胎儿(209.8±11.8mg对183.9±5.9mg；P<0.05)和胎盘(103.5±3.1mg对93.6±2.7mg；P<0.01)(表2)。对照和三重抗氧化剂培养的胚胎之间在植入率上没有显著差异。类似地，两组间在肢体，眼和耳的形态分级和性别决定参数上没有显示显著差异。
表2：用三重混合物在20％O2的胚胎转移
数据表示为％平均值±SEM。n＝每组95个转移的胚泡
F，雌性；M，雄性；n/a，未确定；Ex，露脑畸形(exencephalic)
行内的字母表示组间的显著差异
aP<0.05，bP<0.01，
实施例10：与第4天体内冲出相比，化合物对在5％氧气培养的胚胎的胎儿发育和妊娠的影响
将胚胎转移至假孕接受体之后，与对照组和三重抗氧化剂组中的胚胎相比，体内冲出的胚胎导致显著更重的胎儿(P<0.0001)(表3)。另外，与对照组相比，体内冲出组胎儿具有显著更长的顶臀长(P<0.01)，然而与三重组相比没有差异。另外，在三组之间植入率，肢体、眼和耳的形态分级以及性别参数没有显著差异。
表3：用三重混合物在5％O2的胚胎转移
数据表示为％平均值±SEM。每组转移的胚泡：对照(n＝60)，三重(n＝55)，体内(n＝45)
F，雌性；M，雄性；n/a，未确定；Ex，露脑畸形
来自体内的显著差异；***p<0.0001
对照与体内显著不同；**P<0.01
实施例11：抗氧化剂的组合对于IVF的影响显著改善胚胎发育
氧化应激发生在人类ART的所有阶段，其中配子对氧化损伤特别敏感。我们已经显示了培养基中抗氧化剂硫辛酸和肉碱(和任选地半胱氨酸)的组合对胚胎发育是非常有利的。
本实验工作中，我们显示了IVF期间抗氧化剂的存在也是有益的。我们因此研究了卵母细胞和精子收集和IVF期间该组抗氧化剂的影响。
材料和方法：在20％氧气，在存在或缺乏10μM乙酰-L-肉碱/10μM N-乙酰-L-半胱氨酸/5μMα-硫辛酸下进行从F1小鼠收集配子和IVF。将所得的胚胎在含有或不含抗氧化剂的培养基G-1TM和G-2TM中单独培养，从而创建了四个组。通过延时显微术研究胚胎发育，之后通过差异核染色来确定分配至胚泡的细胞。
对照中的总细胞和内细胞团(ICM)数量分别为32.9±2.1和7.7±2.1。仅在IVF培养基中添加抗氧化剂导致总数目的显著增加(48.7±2.8；P<0.01)。仅存在于胚胎培养基中的抗氧化剂导致总细胞数量的显著增加(50.4±3.2；P<0.001)。然而，IVF培养基和胚胎培养基两者中存在的抗氧化剂显著增加了总胚泡和ICM的细胞数量两者(59.8±3.4,15.3±1.1；P<0.01)。随后对IVF衍生胚胎的延时分析揭示了IVF和培养期间的抗氧化处理与至5细胞分裂的更快的发育时间(51.8±0.6h对54.1±0.7h)相关，这延续到扩张胚的泡阶段。
总之，IVF期间和整个胚胎培养期间抗氧化剂的存在对胚胎发育率和随后的细胞数量和分配具有显著的有益效果。这些发现表明，向IVF培养基以及胚胎培养基中补充抗氧化剂将进一步帮助维持ART中人类胚胎的存活力，这可能是通过减少氧化应激来实现的。
在不同研究中，在配体处理培养基(即G-MOPSTM)中，在存在或不存在抗氧化剂的情况下收集前核胚胎，并在不含抗氧化剂的对照培养基中培养。用于IVF的受精培养基是G-IVFTM，用于将胚胎从一个细胞培养至胚泡的胚胎培养基在G-1TM并且然后在G-2TM培养基中(G-1TM针对第1天持续48h，并且G-2TM针对第3天进行48h)。通过差异细胞染色来分析胚胎发育。
结果：与对照相比，仅在用于IVF的配子处理培养基中添加抗氧化剂导致胚胎具有显著增加的胚泡细胞数量(48.9±3.3对33.6±2.1；P<0.001)(参见图9)。类似地，与对照相比，仅存在于胚胎培养基中的抗氧化剂导致显著增加的胚泡细胞数量(59.3±3.1对33.6±2.1；P<0.001))(参见图9)。与对照相比，在配子收集和胚胎培养两者期间存在的抗氧化剂也导致胚泡细胞数目的进一步显著增加(61.0±3.9对33.6±2.1；P<0.001)(参见图9)。对IVF来源的胚胎的随后延时分析揭示出收集和培养两者期间抗氧化剂的处理与至5细胞分裂的更快的发育时间(51.8±0.6h对54.1±0.7h)相关，这继续到胚泡阶段(参见图10)。在独立研究中，与对照相比，胚胎收集阶段用抗氧化剂对前核卵母细胞处理20分钟导致胚泡内细胞团数量的显著增加(19.3±1.2对16.2±1.1；P<0.05)。
结论：在配子制备和IVF期间以及整个培养期间加入抗氧化剂对于胚胎细胞数量和发育率都有益处。这些发现说明在卵母细胞和精子制备/处理培养基和IVF培养基，以及胚胎培养中补充抗氧化剂将通过减少氧化应激的方式进一步协助ART中人类胚胎的发育和存活力。
实施例12：抗氧化剂组合的效果显著改善了体外人类胚胎发育
在本实验工作中，我们显示了抗氧化剂的存在对体外人类胚胎发育是有益的。我们检测了抗氧化剂的组(即10μM乙酰肉碱,10μM乙酰半胱氨酸和5μM硫辛酸)在体外胚胎发育期间的影响。
材料和方法
对于实验组，将抗氧化剂(10μM乙酰-L-肉碱/10μM N-乙酰-L-半胱氨酸/5μMα-硫辛酸)添加到用于人类卵母细胞获取和受精的Vitrolife培养基G-IVF中，并且添加到用于人类胚胎培养的补充了蛋白质的G1和G2的培养基(可获得自Vitrolife)，在第三天时将G-1培养基换为G-2培养基。
在5％氧气下培养胚胎。
通过延时显微术评估胚胎发育，并且在第5天通过限定的胚泡评分系统测量胚胎质量(参见Gardner et al 1999In vitro culture of human blastocyst In Jansen Rand Mortimer D(编)Towards reproductive certainty:fertility and geneticsbeyond 1999.Parthenon Publishing Carnforth,UK,pp.378-388))。最终的结果参数是胚泡阶段的利用率和胚胎质量。
结果：与在不含抗氧化剂的可比的培养基中培养的胚胎相比，在胚胎培养基中添加抗氧化剂导致更多的良好质量胚泡(即根据Gardner评分系统(参见Gardner et al1999)，达到质量得分3AB或更高的胚泡分数)(参见图13)。图13显示了根据加德纳胚泡分级系统，胚泡总数目中达到良好质量胚泡(GQB)得分的以百分率计的胚泡比例。在对照组中，30个胚泡中的8个被评级为GQB，在补充有10μM乙酰肉碱、10μM乙酰半胱氨酸和5μM硫辛酸的培养基中培养的组中，36个胚泡中的18个被评级为GQB。应用双尾t检验使用市售软件(GraphPad Prism)通过0.0545的p值显示两组之间的较大差异。
另外，抗氧化剂显著增加了胚泡利用率(即新鲜使用以用于转移到患者或者冷冻保存用于以后转移到患者的胚泡分数--(参见图11和图12))。图11显示了胚泡利用率占受精的卵母细胞总数的百分比。在对照组中，选择44个受精的卵母细胞中的12个用于进一步临床应用，在补充有10μM乙酰肉碱、10μM乙酰半胱氨酸和5μM硫辛酸的培养基中培养的组中，选择49个中的26个用于进一步临床治疗应用。不选择未达到质量要求的胚泡并丢弃。应用双尾t检验使用市售软件(GraphPad Prism)，两组之间的差异是显著的，p值为0.0112。
图12显示了胚泡利用率占胚泡总数的百分比。在对照组中，28个胚泡中的12个用于进一步的临床应用，在补充有10μM乙酰肉碱、10μM乙酰半胱氨酸和5μM硫辛酸的培养基中培养的组中，选择36个中的26个用于进一步临床治疗应用。不选择未达到质量要求的胚泡并丢弃。应用双尾t检验使用市售软件(GraphPad Prism)，两组之间的差异是显著的，p值为0.0173。
结论：在体外在卵母细胞获取、受精和胚胎培养过程中的抗氧化剂加入对胚泡质量具有有益的结果。特别地，抗氧化剂的使用导致更多的可用于治疗的更好质量的胚泡。
上述说明书中提到的所有出版物通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应该过度限于此类具体的实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的各种修改旨在落入以下权利要求书的范围内。

Claims (23)

1.胚胎培养基、配子培养基或干细胞培养基，其包含：
a)浓度为约5至约50μM的乙酰肉碱；和
b)浓度为约2.5至约40μM的硫辛酸或其衍生物。
2.根据权利要求1的培养基，其中培养基还包含浓度为约5至约50μM的乙酰半胱氨酸。
3.根据权利要求1或2中任一项的培养基，其中乙酰肉碱的浓度为约5μM至约20μM，如约10μM。
4.根据权利要求2至4中任一项的培养基，其中乙酰半胱氨酸的浓度为约5μM至约20μM，如约10μM。
5.根据前述权利要求中任一项的培养基，其中硫辛酸或其衍生物的浓度为约5μM至约10μM，如约5μM。
6.根据前述权利要求中任一项的培养基，其中所述培养基还含以下的一种或多种：无机盐、能量源、氨基酸、蛋白质、细胞因子、螯合剂、抗生素、透明质酸、生长因子、激素、维生素和GM-CSF。
7.处理和/或操作和/或培养胚胎、配子或干细胞的方法，所述方法包括在根据权利要求1-6中任一项的培养基中处理和/或操作和/或培养所述胚胎或配子或干细胞。
8.在体外培养的胚胎、配子或干细胞中减少或防止氧化应激和/或自由基形成，如活性氧类别(ROS)形成，和/或增加抗氧化能力水平的方法，和/或改善体外培养的胚胎发育的方法，或改善体外培养的干细胞增殖和分化的方法，或改善配子的健康和存活力的方法，或改善精子对卵细胞受精的方法，所述方法包括在根据权利要求1-6中任一项的培养基中处理和/或操作和/或培养所述胚胎和/或配子或干细胞。
9.体外受精的方法，其包括在根据权利要求1-6中任一项的培养基中处理和/或操作和/或培养配子和/或胚胎。
10.乙酰肉碱和硫辛酸或其衍生物的组合在胚胎培养基、配子培养基或干细胞培养基中的用途。
11.根据权利要求10的用途，其中所述组合还包含乙酰半胱氨酸。
12.根据权利要求10或权利要求11的用途，其中所述乙酰肉碱的浓度为约5至约50μM，并且所述硫辛酸或其衍生物的浓度为约2.5至约40μM。
13.根据权利要求11的用途，其中所述乙酰半胱氨酸的浓度为约5至约50μM。
14.根据权利要求1-6中任一项的胚胎培养基、配子培养基或干细胞培养基在体外培养的胚胎或干细胞中减少或防止氧化应激和/或自由基形成，如活性氧类别(ROS)形成，和/或增加抗氧化能力水平的用途，和/或改善体外培养的胚胎发育的用途，或改善体外培养的干细胞增殖和分化的用途。
15.根据权利要求8的方法或根据权利要求14的用途，其中胚胎发育的改善包括：
a)在胚泡阶段的胚胎中滋养外胚层细胞数目、内细胞团和/或总细胞数目增加；
b)达到扩张的胚泡和孵化发育的时间缩短；
c)胚胎转移之后胎儿重量、胎儿顶臀长(crown-rump length)和/或胎盘重量增加；
d)良好质量的胚泡增加；和/或
e)胚泡利用率增加。
16.根据权利要求1-6中任一项的培养基改善体外受精成功率的用途。
17.根据权利要求7-16中任一项的方法或用途，其中所述胚胎为哺乳动物胚胎，如人类胚胎。
18.根据权利要求7-17中任一项的方法或用途，其中单独培养所述胚胎。
19.根据权利要求7-18中任一项的方法或用途，其中将所述胚胎培养至胚泡阶段。
20.权利要求7-16中任一项的方法或用途，其中所述干细胞选自以下的一种或多种：胚胎干细胞、成体干细胞和诱导的多能干细胞。
21.根据权利要求7-16或权利要求20中任一项的方法，其中所述干细胞是人类干细胞。
22.根据权利要求7-21中任一项的方法或用途，其中在具有5-20％之间的氧含量的环境下处理和/或操作和/或培养所述胚胎、配子或干细胞，例如在环境氧条件下，例如约20％氧气，或在减少的氧条件下，例如约5％氧气下处理和/或操作和/或培养所述胚胎或干细胞。
23.根据权利要求1-6中任一项的培养基，用于培养胚胎、配子或干细胞。
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