ES2815552T3 - Medio de cultivo - Google Patents

Abstract

Medio de cultivo de embriones, medio de cultivo de gametos o medio de cultivo de células madre que comprende: a) acetilcarnitina a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 μM; y b) ácido lipoico o un derivado del mismo a una concentración de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 40 μM, en el que el derivado es una molécula de disulfuro/tiótica anfifílica biológicamente activa que tiene propiedades fisiológicas esencialmente equivalentes a las del ácido lipoico.

Description

DESCRIPCIÓN

Medio de cultivo

Campo técnico

La presente invención se refiere a un medio de cultivo para un embrión, un gameto o una célula madre.

Antecedentes

La infertilidad afecta a más de 80 millones de personas en todo el mundo. Se estima que el 10% de todas las parejas experimentan infertilidad primaria o secundaria. El tratamiento de reproducción asistida (ART) es un tratamiento médico electivo que puede brindarle a una pareja que de otro modo no hubiera podido concebir una oportunidad de establecer un embarazo. Es un proceso en el que se extraen óvulos (ovocitos) de los ovarios de una mujer y luego se fertilizan con esperma en el laboratorio. Los embriones creados en este proceso luego se colocan en el útero para su posible implantación.

A pesar de los avances en los ART, las tasas de éxito siguen siendo bajas con nacidos vivos por implantación en ~ 30%. Muchos factores influyen en el resultado satisfactorio del ART, especialmente porque el cultivo in vitro de embriones no puede simular las condiciones fisiológicas in vivo con exactitud. Por ejemplo, las especies reactivas de oxígeno (ROS) producidas a través del manejo, la manipulación y el cultivo de gametos en un ambiente in vitro pueden conducir al desarrollo de estrés oxidativo que puede afectar negativamente la calidad del embrión y la pérdida de viabilidad. Un factor clave de ROS in vitro es la concentración de oxígeno bajo la que se cultivan los embriones. La recolección y el cultivo de embriones en oxígeno atmosférico (~ 20%) crea una condición ambiental hiperóxica que se ha implicado en el aumento de la producción de ROS exógeno que posteriormente conduce al estrés oxidativo. Se ha demostrado que los efectos del estrés oxidativo en los embriones recolectados y cultivados con 20% de oxígeno afectan negativamente su expresión génica, alteran el proteoma resultante y perturban el metabolismo. Incluso una breve exposición al oxígeno atmosférico puede afectar negativamente el desarrollo del embrión y provocar divisiones de escisión retardadas. Sin embargo, a pesar de la creciente evidencia de que una alta concentración de oxígeno es perjudicial para el desarrollo y la viabilidad del embrión, un número considerable de ciclos de IVF en todo el mundo todavía se realizan con oxígeno atmosférico.

Aunque el cultivo de embriones realizado con 5% de oxígeno puede aliviar algunos de los efectos dañinos del estrés oxidativo, la concentración de 5% de oxígeno todavía conduce al estrés oxidativo. Además, todos los gametos están expuestos al oxígeno atmosférico durante su recolección y procesamiento. A pesar de la evidencia de que una alta concentración de oxígeno es perjudicial para el desarrollo y la viabilidad del embrión humano, se ha informado que solo el 25% de los ciclos de IVF en todo el mundo se realizan exclusivamente con 5% de oxígeno, con 34% de las clínicas que reportan el uso de 5% de oxígeno para etapas específicas del cultivo de embriones, y el resto de clínicas que emplean 20% de oxígeno exclusivamente (Christianson, et al., 2014 J. Assist Reprod. Genet. 31: 1029-1036). Además, los efectos del estrés oxidativo en los embriones provocados por altos niveles de ROS exógeno pueden agravarse debido a que los cultivos in vitro carecen de manera crucial de los mecanismos fisiológicos necesarios para mantener una regulación estricta sobre los niveles de ROS. Ciertamente, los gametos y embriones producen ROS endógeno in vivo, y los niveles bajos son necesarios para la regulación adecuada de la función y el desarrollo de los gametos. Sin embargo, a diferencia de las condiciones in vitro, el exceso de ROS in vivo se inactiva mediante un elegante sistema de defensa antioxidante que proporciona reparación y protección contra el daño oxidativo. Por lo tanto, en condiciones fisiológicas se mantiene un fino equilibrio/homeostasis entre ROS sistémico y la capacidad antioxidante. Este equilibrio se altera in vitro y, como en el caso del cultivo de embriones con 20% de oxígeno, la acumulación de ROS exógeno y la falta de mecanismos protectores conducen inevitablemente al estrés oxidativo. ROS in vivo es neutralizado por el sistema antioxidante innato que comprende enzimas y no enzimas. Los antioxidantes enzimáticos, que incluyen la catalasa, la glutatión peroxidasa/reductasa y la superóxido dismutasa (SOD), se encuentran en el citoplasma celular, las células glandulares endometriales y las mitocondrias y confieren protección mediante la eliminación de ROS. Se han encontrado antioxidantes no enzimáticos tales como las vitaminas (A, B, C y E), piruvato, glutatión (GSH) e hipotaurina en el ovario, el plasma seminal, el epitelio endometrial y el fluido folicular y tubárico, y previenen la formación de ROS al terminar con las reacciones de oxidación en cadena. Como el cultivo in vitro carece de estos antioxidantes innatos, la suplementación de varios antioxidantes a los medios de cultivo se ha utilizado como tratamiento para mantener los niveles de ROS bajo control y prevenir el daño oxidativo a gametos y embriones. El estrés oxidativo en el cultivo de células madre también es un problema documentado.

Aunque se han informado los efectos de los antioxidantes individuales sobre el desarrollo del embrión, ha habido una investigación relativamente limitada sobre los efectos de los antioxidantes presentes como grupo en el medio sobre el desarrollo del embrión. Existen informes contradictorios sobre los efectos beneficiosos de los antioxidantes en los medios de cultivo (Legge y Sellens, Hum Reprod 1991; 6: 867-871; Nasr-Esfahani y Johnson, Hum Reprod 1992; 7: 1281-1290; Noda, et al., Mol Reprod Dev 1991; 28: 356-360; Payne et al., Reprod Fertil Develop 1992; 4: 167-174).

Silva et al., 2015 describen que para reducir el estrés oxidativo, se añadieron los antioxidantes ácido a-lipoico (ALA; 10 |jM), a-tocoferol (250 j M), hipotaurina (1 mM) y N-acetilcisteína (NAC; 1 mM) y sirtuina (100 ng/mL) al medio de cultivo de embriones (AntiOX) y se comparó con un control (CON) sin antioxidantes, para evaluar el desarrollo de blastocistos después de la maduración in vitro y la fertilización de ovocitos de ratones hembra B6D2f I envejecidos (13,5 meses).

Ha sido un desafío encontrar medios de cultivo que mejoren el desarrollo de embriones y la proliferación y diferenciación de células madre o para mantener o mejorar la viabilidad de los gametos.

Sumario de la invención

De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención proporciona un medio de cultivo de embriones, gametos o células madre que comprende:

a) acetilcarnitina a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 j M; y

b) ácido lipoico o un derivado del mismo a una concentración de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 40 j M, en el que el derivado es una molécula de disulfuro/tiótica anfifílica biológicamente activa que tiene propiedades fisiológicas esencialmente equivalentes a las del ácido lipoico.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un medio de cultivo de embriones, gametos o células madre que comprende:

a) acetilcarnitina a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 j M;

b) ácido lipoico o un derivado del mismo a una concentración de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 40 j M; y c) acetilcisteína a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 j M.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para manejar y/o manipular y/o cultivar un embrión para IVF y/o un gameto, o una célula madre, comprendiendo el método manejar y/o manipular y/o cultivar el embrión para IVF y/o gameto o célula madre en un medio de cultivo de acuerdo con la presente invención.

La presente invención proporciona en otro aspecto un método para reducir o prevenir el estrés oxidativo y/o reducir o prevenir la formación de radicales libres (por ejemplo, formación de especies reactivas de oxígeno (ROS)) y/o aumentar los niveles de capacidad antioxidante en un embrión para IVF y/o gameto o células madre cultivadas in vitro y/o para mejorar el desarrollo de un embrión cultivado in vitro o para mejorar la proliferación y diferenciación de una célula madre cultivada in vitro o para mejorar la salud y/o viabilidad de los gametos, comprendiendo el método el manejo y/o manipulación y/o cultivo del embrión para IVF y/o gametos, o células madre en un medio de acuerdo con la presente invención.

En el presente documento se describe el uso de la combinación de acetilcarnitina y ácido lipoico o un derivado de los mismos en un medio de cultivo de embriones y/o un medio de cultivo de gametos o un medio de cultivo de células madre.

También se describe en este documento el uso de la combinación de acetilcarnitina, ácido lipoico o un derivado de los mismos y acetilcisteína en un medio de cultivo de embriones y/o un medio de cultivo de gametos o un medio de cultivo de células madre.

La presente invención también proporciona el uso de un medio de cultivo de embriones y/o un medio de cultivo de gametos, o medio de cultivo de células madre, de acuerdo con la presente invención para reducir o prevenir el estrés oxidativo y/o la formación de radicales libres y/o aumentar los niveles de capacidad antioxidante en un embrión para IVF o células madre cultivadas in vitro y/o para mejorar el desarrollo de un embrión cultivado in vitro para IVF o la proliferación y diferenciación de una célula madre cultivada in vitro o para mejorar la salud y/o viabilidad de los gametos.

En otro aspecto más de la presente invención, se proporciona el uso de un medio de cultivo de embriones y/o un medio de cultivo de gametos de acuerdo con la presente invención para mejorar la tasa de éxito de la fertilización in vitro. En una realización, el uso del medio de cultivo de embriones y/o medio de cultivo de gametos de acuerdo con la presente invención para mejorar la tasa de éxito de la fertilización in vitro no incluye la implantación del embrión en un cuerpo humano o animal. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de un medio de cultivo de acuerdo con la presente invención en el cultivo de un embrión para IVF, un gameto o una célula madre.

Breve descripción de los dibujos

Se describirán ahora realizaciones de la invención, únicamente a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1a muestra el desarrollo de un grupo de embriones en 20% de oxígeno con acetilcamitina en diferentes dosis.

La Figura 1b muestra el desarrollo de un grupo de embriones en 20% de oxígeno con acetilcisteína en diferentes dosis.

La Figura 1c muestra el desarrollo de un grupo de embriones en 20% de oxígeno con ácido lipoico en diferentes dosis. La Figura 2 muestra la asignación del linaje celular de los embriones cultivados en 20% de O². Los datos se expresan como la media ± SEM. Las porciones de barras claras y oscuras representan el promedio de células TE e ICM respectivamente. Control (n = 35), Carnitina 10 pM-Cisteína 10 pM (n = 42), Carnitina 10 pM-Ácido lipoico 5 pM (n = 53), Cisteína 10 pM-Ácido lipoico 5 pM (n = 48), Triple (Carnitina 10 pM-Cisteína 10 pM- Ácido lipoico 5 pM) (n = 44).

3 réplicas biológicas. ** P <0,01, **** P <0,0001.

La Figura 3 muestra la asignación del linaje celular de los grupos cultivados de embriones en 5% de O². Cóctel que comprende carnitina 10 pM, cisteína 10 pM y ácido lipoico 5 pM. Los datos se expresan como la media ± SEM. Las porciones de barras claras y oscuras representan el promedio de células TE e ICM respectivamente. 3 réplicas biológicas. Control (n = 154), cóctel (n = 168). *** P <0,005, * P <0,05.

La Figura 4 muestra la asignación del linaje celular de embriones cultivados individualmente en 20% de O². Los datos se expresan como la media ± SEM. Las porciones de barras claras y oscuras representan el promedio de células TE e ICM respectivamente. 6 réplicas biológicas. Control (n = 116), cóctel (n = 145). **** P <0,0001, *** P <0,005.

La Figura 5 muestra el momento de los principales eventos del desarrollo expresados en horas después de la inyección de hCG. tPNB = tiempo de ruptura de pronúcleos, t2 = tiempo de división de 2 células, t3 = tiempo de división de 3 células, t4 = tiempo de división de 4 células, t5 = tiempo de división de 5 células, t6 = tiempo de división de 6 células, t8 = tiempo de división de 8 células, tCA = tiempo de cavitación (el blastocele comienza a formarse), tB = tiempo en que se forma el blastocisto, tE = tiempo en que el blastocisto está completamente expandido, tH = tiempo en que el blastocisto eclosiona. Las barras oscuras muestran los controles, las barras grises sombreadas muestran el grupo tratado con cóctel triple **P <0,01; ***P <0,001; ****P <0,0005. Datos expresados como la media ± SEM.

La Figura 6 muestra el efecto del tiempo de exposición al cóctel triple sobre la asignación del linaje celular para grupos de embriones cultivados en 20% de oxígeno. El cóctel se compone de carnitina 10 pM, cisteína 10 pM y ácido lipoico 5 pM suplementado en medio durante los primeros 2 días (G1) o los últimos 3 días (G2) o en ambos medios (G1 y G2). Los datos se expresan como la media ± SEM. Las porciones de barras claras y oscuras representan el promedio de células TE e ICM respectivamente. 3 réplicas biológicas. Control (n = 92), G1 (n = 84), G2 (n = 97), G1 y G2 (n = 80). *P <0,05, **P <0,01.

La Figura 7 muestra el efecto de BSO sobre la fluorescencia de MCB: tres réplicas biológicas (n = 6-12). **P = 0,004, *P = 0,011.

La Figura 8 muestra el marcaje por fluorescencia de embriones con MCB 10 pM. El cóctel se compone de carnitina 10 pM, cisteína 10 pM y ácido lipoico 5 pM. Datos expresados como la media ± SEM. Seis réplicas biológicas (n = 60). Los valores de fluorescencia se muestran en unidades arbitrarias. **P <0,01.

La Figura 9 muestra el efecto de los antioxidantes combinados sobre el número de células de blastocistos de embriones de IVF cultivados individualmente con 20% de oxígeno. Los datos se expresan como la media ± SEM. Las porciones de barras claras y oscuras representan el promedio de células TE e ICM respectivamente. Asignación del linaje celular de embriones cultivados individualmente en 20% de oxígeno. Los antioxidantes (A3) se encontraban en los medios de manipulación/recolección de gametos y/o medios de cultivo. Los controles (Con) estaban en gametos y/o medios de cultivo sin antioxidantes: 4 réplicas biológicas. Con/Con (n = 34), Con/A3 (n = 34), A3/Con (n = 38), A3/A3 (n = 48). *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001, ****P <0,0001.

La Figura 10 muestra el efecto de antioxidantes combinados sobre blastocistos derivados de IVF cultivados individualmente con 20% de oxígeno. Los datos se expresan como la media ± SEM. Los antioxidantes (A3) se encontraban en los medios de manipulación/recolección de gametos y/o medios de cultivo. Los controles (Con) estaban en medios de manipulación de gametos y/o medios de cultivo sin antioxidantes. 3 réplicas biológicas, Con/Con (n = 34), Con/A3 (n = 34), A3/Con (n = 38) A3/A3 (n = 48). **P <0,01.

La Figura 11 muestra la tasa de utilización de blastocistos humanos en porcentaje del número total de ovocitos fertilizados. En el grupo de control se seleccionaron 12 de 44 ovocitos fertilizados para uso clínico adicional, en el grupo cultivado en medio suplementado con acetilcarnitina 10 pM, acetilcisteína 10 pM y ácido lipoico 5 pM, 26 de 49 se seleccionaron para uso terapéutico clínico adicional. Los blastocistos que no cumplieron con los requisitos de calidad no fueron seleccionados y se descartaron. La diferencia entre los dos grupos fue significativa con un valor p de 0,0112 aplicando una prueba t de dos colas usando un software disponible comercialmente (GraphPad Prism). La Figura 12 muestra la tasa de utilización de blastocistos humanos en porcentaje del número total de blastocistos. En el grupo de control se seleccionaron 12 de 28 blastocistos para uso clínico adicional, en el grupo cultivado en medio suplementado con acetilcarnitina 10 pM, acetilcisteína 10 pM y ácido lipoico 5 pM, 26 de 36 se seleccionaron para uso terapéutico clínico adicional. Los blastocistos que no cumplieron con los requisitos de calidad no fueron seleccionados y se descartaron. La diferencia entre los dos grupos fue significativa con un valor p de 0,0173 aplicando una prueba t de dos colas utilizando software disponible comercialmente (GraphPad Prism).

La Figura 13 muestra la proporción de blastocistos humanos en porcentaje que alcanzan la puntuación de blastocistos de buena calidad (GQB), que equivalen a una puntuación de 3AB o superior de acuerdo con el sistema de clasificación de blastocistos de Gardner, por número total de blastocistos. En el grupo de control, 8 de 30 blastocistos se clasificaron como GQB en el grupo cultivado en medio suplementado con acetilcarnitina 10 pM, acetilcisteína 10 pM y ácido lipoico 5 pM, 18 de 36 se clasificaron como GQB. La gran diferencia entre los dos grupos se ilustra mediante el valor p de 0,0545 aplicando una prueba t de dos colas usando software disponible comercialmente (GraphPad Prism).

Descripción detallada

La presente invención se basa en el sorprendente hallazgo de que combinaciones específicas de acetilcamitina a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 pM y ácido lipoico o un derivado del mismo a una concentración de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 40 pM, y particularmente cuando se combinan con acetilcisteína a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 pM, mejoró significativamente el desarrollo de un embrión cultivado in vitro o la proliferación y diferenciación de una célula madre cultivada in vitro o la salud y viabilidad de los gametos y/o la fertilización de un ovocito por un esperma.

La presente invención se refiere a un medio de cultivo de gametos, un medio de cultivo de embriones o un medio de cultivo de células madre que comprende:

a) acetilcarnitina a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 pM; y

b) ácido lipoico o un derivado del mismo a una concentración de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 40 pM. En una realización, el medio de cultivo de gametos, medio de cultivo de embriones o medio de cultivo de células madre de acuerdo con la presente invención comprende además acetilcisteína a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 pM.

En una realización, la acetilcarnitina está presente en el medio de cultivo de la presente invención a una concentración de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 20 pM.

En otra realización, la acetilcarnitina está presente en el medio de cultivo de la presente invención a una concentración de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 15 pM.

En una realización preferida, la acetilcarnitina está presente en el medio de cultivo de la presente invención a una concentración de aproximadamente 10 pM.

En una realización, el ácido lipoico o un derivado del mismo está presente en el medio de cultivo de la presente invención a una concentración de aproximadamente 2,5 pM a aproximadamente 20 pM, por ejemplo, 5 pM a aproximadamente 20 pM.

En otra realización, el ácido lipoico o un derivado del mismo está presente en el medio de cultivo de la presente invención a una concentración de aproximadamente 2,5 pM a aproximadamente 10 pM, por ejemplo, 5 pM a aproximadamente 10 pM.

En una realización preferida, el ácido lipoico o un derivado del mismo está presente en el medio de cultivo de la presente invención a una concentración de aproximadamente 5 pM.

En una realización, la acetilcisteína está presente en el medio de cultivo de la presente invención a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 pM.

En otra realización, la acetilcisteína está presente en el medio de cultivo de la presente invención a una concentración de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 15 pM.

En una realización preferida, la acetilcisteína está presente en el medio de cultivo de la presente invención a una concentración de aproximadamente 10 pM.

De forma adecuada, el medio de acuerdo con la presente invención puede comprender además uno o más compuestos adicionales, por ejemplo, una sal inorgánica, una fuente de energía, un aminoácido, una fuente de proteínas, una citocina, un agente quelante, un antibiótico, un hialuronano, un factor de crecimiento, una hormona, una vitamina y/o un factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF).

En una realización, el medio de cultivo puede comprender una sal inorgánica. En una realización, la sal inorgánica puede ser una que se disocie en sus iones inorgánicos en solución acuosa. Adecuadamente, la sal inorgánica puede ser una que comprenda uno o más de los siguientes iones inorgánicos: Na(+), K(+), Cl(-), Ca(2+), Mg(2+), SO(4)(2-) o PO(4)(2-).

En una realización, el medio de cultivo puede comprender una fuente de energía. La fuente de energía puede ser piruvato, lactato o glucosa dependiendo de la etapa de desarrollo del embrión. Los requerimientos de fuentes de energía evolucionan desde una preferencia de piruvato-lactato mientras los embriones, hasta la etapa de 8 células, están bajo control genético materno, a un metabolismo basado en glucosa después de la activación del genoma embrionario que apoya su desarrollo de 8 células a blastocistos. De manera adecuada, el uno o más compuestos adicionales pueden ser o pueden incluir los carbohidratos lactato y piruvato como fuente de energía.

En una realización, el uno o más compuestos adicionales pueden ser un ácido hialurónico. En una realización, el medio de cultivo puede comprender un aminoácido. El aminoácido puede ser un aminoácido esencial. De manera adecuada, los aminoácidos esenciales incluyen cisteína, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, valina, arginina, glutamina, fenilalanina, treonina y/o triptófano. En una realización alternativa, el aminoácido puede ser un aminoácido no esencial, tal como prolina, serina, alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina y/o ácido glutámico. Los medios que apoyan el desarrollo de cigotos de hasta 8 células pueden complementarse típicamente con aminoácidos no esenciales, tal como prolina, serina, alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina y/o ácido glutámico. Los medios que apoyan el desarrollo de embriones de 8 células hasta la etapa de blastocisto generalmente se suplementan con aminoácidos esenciales, tales como cisteína, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, valina, arginina, glutamina, fenilalanina, treonina y/o triptófano.

En una realización, el medio de cultivo puede comprender una fuente de proteína. La fuente de proteína puede ser albúmina o suero sintético (por ejemplo, a una concentración de 5 a 20% p/v o v/v respectivamente). Las fuentes adecuadas para la suplementación de proteínas incluyen suero humano, suero de cordón humano (HCS), albúmina de suero humano (HSA), suero de ternera fetal (FCS) o albúmina de suero bovino (BSA).

En una realización, el medio de cultivo puede comprender un factor de crecimiento.

En una realización, el uno o más compuestos adicionales pueden ser cualquier compuesto presente en un medio adecuado para el cultivo de un embrión, un gameto o una célula madre.

De forma adecuada, el uno o más compuestos adicionales incluyen una fuente de proteína, tal como albúmina de suero humano.

En una realización, el uno o más compuestos adicionales pueden incluir agua.

En una realización, el uno o más compuestos adicionales pueden incluir una solución tampón. Las soluciones tampón adecuadas incluyen tampón HEPES o tampón MOPS, por ejemplo.

En una realización, el uno o más compuestos adicionales pueden incluir agua, sales inorgánicas y al menos una fuente de energía.

En una realización, el uno o más compuestos adicionales pueden incluir agua, sales inorgánicas, al menos una fuente de energía y uno o más aminoácidos.

En una realización, el uno o más compuestos adicionales pueden ser o pueden comprender al menos una fuente de energía (por ejemplo, un carbohidrato tal como lactato, piruvato), una fuente de proteínas (por ejemplo, albúmina de suero humano) y agua o una solución tampón.

En una realización, el uno o más compuestos adicionales pueden ser o pueden comprender una fuente de energía (por ejemplo, un carbohidrato tal como lactato, piruvato), un aminoácido, hialuronano y agua o una solución tampón. El uno o más compuestos adicionales pueden estar en forma de un medio adecuado para el cultivo de un gameto, un embrión o una célula madre, cuyo medio podría denominarse medio de fondo.

El término "medio de cultivo" como se usa en este documento no se limita a un medio de cultivo (por ejemplo, en condiciones adecuadas para el crecimiento), sino que abarca un medio que usa el manejo o recolección o manipulación de gametos, embriones y/o células madre.

De forma adecuada, el uno o más compuestos adicionales pueden formar un medio tamponado (por ejemplo, un medio tamponado con bicarbonato).

El uno o más compuestos adicionales pueden estar en forma de un medio diseñado para soportar un embrión (por ejemplo, un embrión de mamífero) hasta la etapa de 4 células, medio que podría denominarse medio de fondo. El uno o más compuestos adicionales pueden estar en forma de un medio diseñado para soportar un embrión (por ejemplo, un embrión de mamífero) hasta la etapa de 8 células, medio que podría denominarse medio de fondo. El uno o más compuestos adicionales pueden estar en forma de un medio diseñado para soportar un embrión (por ejemplo, un embrión de mamífero) hasta la etapa de blastocisto, cuyo medio podría denominarse medio de fondo. El medio (de fondo) puede ser cualquier medio adecuado para el cultivo de un embrión, un gameto o una célula madre. En una realización, el medio (de fondo) puede ser un medio específico para la transferencia de embriones.

En una realización, el medio (de fondo) puede ser uno o más del grupo que consiste en medio de manipulación de gametos (incluido el medio de recolección de gametos), un medio para inyección intracitoplasmática de esperma (ICSI), un medio de fertilización, un medio de cultivo de embriones de un sola etapa, medio de transferencia de embriones, medio de maduración de ovocitos, medio de preparación y fertilización de espermatozoides, o cualquier otro medio adecuado utilizado para gametos o embriones.

En una realización, el medio de cultivo de embriones o medio de cultivo de gametos de acuerdo con la presente invención puede ser uno o más del grupo que consiste en un medio de manipulación de gametos (incluido el medio de recolección de gametos), un medio para inyección intracitoplasmática de esperma (ICSI), un medio de fertilización, un medio de cultivo de embriones de una sola etapa, un medio de transferencia de embriones, un medio de maduración de ovocitos, un medio de preparación y fertilización de esperma, o cualquier otro medio adecuado utilizado para gametos o embriones.

En una realización, el medio (de fondo) puede ser cualquier medio de cultivo simple disponible comercialmente, tal como fluido tubárico humano (HTF), medio T6 de Whittingham y solución salina equilibrada de Earle (EBSS) (disponible a través de Irvine Scientific).

En una realización, el medio (de fondo) puede ser un medio básico tal como IVFMR de Vitrolife. IVFMR puede considerarse un medio de fertilización.

En una realización, el medio de IVF se considera un medio de fertilización.

Alternativamente o además, el medio puede ser uno o más de los siguientes medios G-1MR, G-2MR, HSA-solutionMR, G-MOPSMR Plus, G-MOPSMR, EmbryoGlueMR, ICSIMR o G-TLMR o una combinación de los mismos. Estos productos están disponibles a través de Vitrolife AB, Suecia. Estos podrían referirse a un medio de fondo.

En una realización, un medio de manipulación adecuado (por ejemplo, medio de manipulación de gametos) puede ser G-MOPSMR.

En una realización, un medio de cultivo adecuado de una sola etapa puede ser G-TLMR

En una realización, un medio de transferencia de embriones puede ser EmbryoGlueMR En algunas realizaciones, un medio de transferencia de embriones puede denominarse medio de transferencia que promueve la implantación. En una realización, el medio (de fondo) puede ser un medio tal como medio de maduración de ovocitos o medio de preparación de esperma y medio de fertilización o una combinación de los mismos.

El medio de maduración de ovocitos se ha diseñado para proporcionar un mejor desarrollo y supervivencia de los ovocitos cultivados. La formulación completa de un medio de maduración de ovocitos adecuado se proporciona en la siguiente tabla:

continuación

Las concentraciones en esta tabla se proporcionan en mM, a menos que se indique lo contrario; el medio es acuoso. La formulación completa de un medio de fertilización y preparación de esperma adecuado se proporciona en la siguiente tabla:

Las concentraciones en esta tabla se proporcionan en mM, a menos que se indique lo contrario; el medio es acuoso. Un medio para inyección intracitoplasmática de esperma (ICSI), por ejemplo, ICSIMR, está diseñado para ayudar a manipular el esperma, facilitar la inmovilización e inyección del esperma en el ovocito durante la fertilización. La formulación completa de un medio adecuado para ICSi se proporciona en la siguiente tabla:

El medio G-1MR está diseñado para soportar el desarrollo de embriones en etapa de escisión hasta aproximadamente la etapa de 8 células. Dicho medio contiene carbohidratos, aminoácidos y quelantes para soportar al embrión temprano. La fórmula completa del medio G-1MR se proporciona en la siguiente tabla:

Las concentraciones en esta tabla se proporcionan en mM, a menos que se indique lo contrario.

Alternativamente, el medio (de fondo) puede ser un medio de cultivo de IVF disponible comercialmente capaz de soportar embriones más allá del día 3 (etapa de 8 células). Estos medios de cultivo se han diseñado para portar los embriones a la etapa de blastocisto antes de la implantación. Un ejemplo, incluye medio esencial a-modificado (aMEM), descrito en Desai et al., (Human Reprod. 12: 328-335 (1997)). Un segundo ejemplo incluye el medio HECM-6 más pantotenato (McKiernan SH & Bavister BD, Human Reprod. 15: 157-164 (2000)). Otros ejemplos incluyen G-2MR disponible a través de Vitrolife. El medio G-2MR está diseñado para soportar el desarrollo del embrión desde alrededor de la etapa de 8 células (día 3) hasta la etapa de blastocisto. Dicho medio contiene carbohidratos, aminoácidos y vitaminas para soportar al embrión en la etapa posterior.

La formulación completa para el medio G-2MR se proporciona en la siguiente tabla:

Las concentraciones en la tabla anterior se proporcionan en mM, a menos que se indique lo contrario.

En una realización, los embriones en etapa de 8 células se transfieren desde un medio de cultivo de embriones optimizado para soportar el crecimiento en etapa temprana (es decir, hasta la etapa de 8 células) suplementado de acuerdo con la presente invención a un medio de cultivo de embriones optimizado para soportar crecimiento en etapa posterior (es decir, hasta la etapa de blastocisto), que puede ser un suplemento adicional de acuerdo con la presente invención.

La concentración de cada compuesto en un medio de cultivo puede variar dependiendo de la etapa de desarrollo del embrión para la que se optimiza el medio. Las concentraciones típicas para las sales inorgánicas en el medio de cultivo pueden ser de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 150 mM o de aproximadamente 110 mM a aproximadamente 140 mM.

Las concentraciones típicas para la fuente de energía en el medio pueden ser de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 40 mM, por ejemplo, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM, o de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM.

Las concentraciones típicas para la cantidad total de aminoácidos en el medio de cultivo pueden ser de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 15 mM o de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 12 mM, o de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 6 mM.

Las vitaminas, factores de crecimiento, hormonas y otros ingredientes diversos en el medio de cultivo tienden a añadirse en concentraciones bastante bajas, por ejemplo, 1 mM o menos, 0,5 mM o menos o incluso 0,1 mM o menos. Preferiblemente, el embrión, gameto o célula madre se cultiva en aceite de parafina. Esto puede prevenir la evaporación del medio y por lo tanto preservar una osmolaridad constante. Además, el aceite puede minimizar las fluctuaciones de pH y temperatura.

En una realización, el medio de cultivo de la presente invención puede comprender un antibiótico. Algunos ejemplos de antibióticos adecuados incluyen penicilina y estreptomicina.

En una realización, la presente invención proporciona un método para manejar y/o manipular y/o cultivar un embrión y un gameto, comprendiendo el método el manejo y/o manipulación y/o cultivo del embrión y el gameto en un medio de cultivo de acuerdo con la presente invención. La presente divulgación incluye el uso de una combinación de acetilcarnitina (por ejemplo, a una concentración de 5-50 j M) y ácido lipoico o un derivado del mismo (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 40 j M) y opcionalmente acetilcisteína (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 j M) durante la manipulación del gameto (por ejemplo, en el medio de manipulación del gameto (incluido el medio de recolección de gametos), en el medio de preparación de esperma, en el medio de maduración de ovocitos o cualquier otro medio adecuado utilizado para gametos) y la manipulación de embriones (por ejemplo, en un medio para inyección intracitoplasmática de esperma (ICSI), un medio de fertilización, un medio de cultivo de embriones de una sola etapa, un medio de transferencia de embriones o cualquier otro medio adecuado utilizado para embriones).

La presente divulgación se refiere al uso de una combinación de acetilcarnitina (por ejemplo, a una concentración de 5-50 j M) y ácido lipoico o un derivado del mismo (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 40 j M) y opcionalmente acetilcisteína (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 j M) durante la manipulación de los gametos (por ejemplo, en el medio de recolección de gametos) y durante la manipulación del embrión, tal como durante ICSI o la fertilización o la transferencia de embriones (por ejemplo, en un medio para la inyección intracitoplasmática de esperma (ICSI ) o en un medio de fertilización o un medio de transferencia de embriones).

La presente divulgación se refiere al uso de una combinación de acetilcarnitina (por ejemplo, a una concentración de 5-50 j M) y ácido lipoico o un derivado del mismo (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 40 j M) y opcionalmente acetilcisteína (por ejemplo, a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 j M) en un medio de cultivo de embriones.

En algunas realizaciones, los compuestos para su uso en la presente invención se añaden durante la manipulación de gametos y/o durante la manipulación de embriones y/o durante el cultivo de embriones. En otras palabras, los compuestos para usar en la presente invención se pueden agregar en múltiples etapas durante el proceso de IVF/ICSI. En algunas realizaciones, los compuestos para su uso en la presente invención se añaden al medio de manipulación de gametos y/o al medio de manipulación de embriones y/o al medio de cultivo de embriones. El término "manipulación" como se usa en este documento puede incluir cualquier soporte o movimiento, por ejemplo, del gameto, embrión o célula madre. Por ejemplo, esto puede incluir la transferencia de gametos durante y después de la recolección o transferencia de embriones para implantación.

El término "manipulación" como se usa en este documento puede incluir cualquier manipulación del gameto y/o embrión y/o célula madre. Por ejemplo, esto puede incluir ICSI o fertilización (por ejemplo, dejando que el esperma fertilice el óvulo).

El término "cultivo", como se usa en este documento, puede significar el mantenimiento en condiciones adecuadas para el crecimiento o la maduración.

Preferiblemente, el pH del medio de cultivo se (mantiene) entre 7,2 y 7,4 (durante el cultivo).

Se ha descubierto sorprendentemente que el medio de cultivo de acuerdo con la presente invención reduce o previene el estrés oxidativo y/o reduce o previene la formación de radicales libres (por ejemplo, formación de especies reactivas de oxígeno (ROS)) y/o aumenta los niveles de capacidad antioxidante en un gameto, un embrión o una célula madre cultivados in vitro.

El estrés oxidativo refleja un desequilibrio entre la manifestación sistémica de las especies reactivas de oxígeno y la capacidad del embrión o de la célula madre para desintoxicar fácilmente los compuestos intermedios reactivos o reparar el daño resultante. Las alteraciones en el estado redox normal de las células pueden provocar efectos tóxicos a través de la producción de peróxidos y radicales libres que dañan todos los componentes de la célula, incluidas las proteínas, los lípidos y el ADN. El estrés oxidativo del metabolismo oxidativo causa daño en las bases, así como la rotura de cadenas en el ADN. El daño de las bases es principalmente indirecto y causado por especies reactivas de oxígeno (ROS) generadas, por ejemplo, O2- (radical superóxido), OH (radical hidroxilo) y H2O2 (peróxido de hidrógeno). Además, algunas especies oxidativas reactivas actúan como mensajeros celulares en la señalización redox. Por tanto, el estrés oxidativo puede provocar alteraciones en los mecanismos normales de señalización celular.

El término "capacidad antioxidante", como se usa en este documento, significa la capacidad del embrión o de la célula madre para tolerar el estrés oxidativo. La capacidad antioxidante de un embrión se puede medir indirectamente midiendo la tasa de crecimiento del embrión y/o midiendo el glutatión intracelular (GSH) (como se detalla en la sección de métodos y materiales a continuación).

En una realización, el medio de cultivo de acuerdo con la presente invención mantiene los niveles de GSH dentro de los embriones cultivados in vitro a niveles sustancialmente iguales a los de los embriones desarrollados in vivo. En otras palabras, las combinaciones específicas de acetilcarnitina, ácido lipoico y (opcionalmente) acetilcisteína que se enseñan en este documento en un medio de cultivo de acuerdo con la presente invención aumentan los niveles de GSH en embriones cultivados in vitro en comparación con embriones cultivados in vitro en un medio de cultivo sin esta combinación de compuestos.

Sin desear estar ligado a ninguna teoría, el GSH es un péptido de sulfidriltiol, que juega un papel crítico en la protección de las células del daño oxidativo. Su papel en el desarrollo embrionario se ha demostrado en la proliferación y progresión celular durante eventos embrionarios. La síntesis de GSH depende de la disponibilidad de cisteína y, debido a la inhibición por retroalimentación, los niveles intracelulares de cisteína determinan la concentración superior de GSH celular. Por lo tanto, un aumento de GSH puede proteger a la célula del estrés oxidativo debido a una mayor capacidad antioxidante facilitando así una mejor calidad del embrión.

La tasa de crecimiento se puede medir midiendo el número de células del trofectodermo, el número de masa celular interna o el número total de células, por ejemplo, a los 2 días de cultivo en un medio de cultivo de la presente invención o en la etapa de blastocisto, por ejemplo cuando se mide adecuadamente a los 5 días de cultivo en un medio de cultivo de la presente invención); midiendo el tiempo para alcanzar el blastocisto expandido; y/o midiendo el tiempo para alcanzar el blastocisto en eclosión.

Adicional o alternativamente, se ha encontrado sorprendentemente que el medio de cultivo de acuerdo con la presente invención mejora el desarrollo de un embrión cultivado in vitro.

El término "mejora el desarrollo" en relación con un embrión, como se usa en este documento, puede incluir uno o más de los siguientes:

a) aumentar el número de células de trofectodermo en el embrión en la etapa de blastocisto, por ejemplo, cuando se mide a los 5 a 6 días de cultivo en un medio de cultivo de la presente invención);

b) aumentar la masa celular interna en el embrión en la etapa de blastocisto, por ejemplo, cuando se mide a los 5 a 6 días de cultivo en un medio de cultivo de la presente invención);

c) aumentar el número total de células en el embrión en la etapa de blastocisto, por ejemplo, cuando se mide a los 5­ 6 días de cultivo en un medio de cultivo de la presente invención);

d) un tiempo reducido para alcanzar el blastocisto expandido;

e) un tiempo reducido para alcanzar al blastocisto en eclosión;

f) un aumento del peso fetal después de la transferencia de embriones;

g) un aumento de la longitud céfalo-caudal fetal después de la transferencia de embriones;

h) un aumento del peso de la placenta después de la transferencia de embriones;

i) un aumento en los blastocistos de buena calidad (GQB) (es decir, la fracción de blastocistos que alcanzó una puntuación de 3AB o más de acuerdo con el sistema de clasificación de blastocistos de Gardner, (véase Gardner et al 1999) por número total de blastocistos en comparación con los embriones cultivados en medios comparables sin antioxidantes; y/o

j) un aumento en la tasa de utilización de blastocistos (es decir, la fracción de blastocistos que se utilizan frescos para transferencia o criopreservados para su posterior transferencia al paciente, por ejemplo, en porcentaje del número total de ovocitos fertilizados o en porcentaje del número total de blastocistos).

El término "masa celular interna (ICM)" se define en el presente documento como la masa de células dentro del embrión que eventualmente dará lugar a las estructuras definitivas del feto. La masa celular interna también se conoce como embrioblasto o pluriblasto.

El término "trofectodermo (TE)" se define en el presente documento como las células que forman la capa externa de un blastocisto, por ejemplo, que aportan nutrientes al embrión y se convierten en una gran parte de la placenta.

El término "blastocisto expandido", como se usa en el presente documento, significa la etapa de desarrollo en la que la cavidad del blastocele es más grande que el embrión. Por lo general, esto se combina con el adelgazamiento de la capa del blastocisto (zona pelúcida).

El término "blastocisto en eclosión", como se usa en el presente documento, significa el punto en el que el embrión se libera de la zona pelúcida envolvente. A través de una serie de ciclos de expansión-contracción, el embrión revienta la cubierta. Esto está respaldado por enzimas que disuelven la zona pelúcida en el polo abembrionario. Las expansiones y contracciones rítmicas hacen que el embrión se hernie y emerja de la capa rígida de glicoproteínas (zona pelúcida).

El término "mejora" (por ejemplo, en relación con el desarrollo y/o proliferación y/o diferenciación) significa mejora en comparación con un control (por ejemplo, cultivado en un medio de cultivo similar, pero sin la combinación de acetilcarnitina y ácido lipoico o un derivado del mismo o la combinación de acetilcarnitina y ácido lipoico o un derivado del mismo y acetilcisteína como se define en la presente invención).

En una realización preferida, el embrión es un embrión de mamífero, por ejemplo, un embrión humano.

En una realización, el embrión es un embrión humano.

El período de implantación previa del desarrollo del embrión varía entre las especies de mamíferos. Sin embargo, los embriones de humanos y ratones comparten la duración de desarrollo más similar (alrededor de 4 a 5 días) y también exhiben una implantación bastante similar. Los blastocistos de ambas especies alcanzan un tamaño similar y los patrones de utilización de nutrientes son muy similares entre ratones, embriones de humanos y ratones (véase, por ejemplo, Gott AL, Hardy K, Winston RM, Leese HJ. Non-invasive measurement of pyruvate and glucose uptake and lactate production by single human preimplantation embryos. Hum Reprod. 1990;5(1):104-8; Leese HJ, Barton AM. Pyruvate and glucose uptake by mouse ova and preimplantation embryos. J Reprod Fertil. 1984;72(1):9-13; y Gardner DK, Wale PL. Analysis of metabolism to select viable human embryos for transfer. Fertility and Sterility.

2013;99(4):1062-72). Las similitudes compartidas entre el desarrollo humano y del ratón son tales que permiten la evaluación del desarrollo humano a partir de experimentos realizados en sistemas murinos (véase Csaba Pribensky et al. Reproductive Biomedicine Online (2010) 20, 371-379). En consecuencia, se sostiene que el ratón es el modelo más apropiado para el embrión de implantación previa humana.

El término "gameto" como se usa en este documento puede referirse a una célula de ovocito y/o una célula de esperma.

El término "embrión" como se usa en este documento puede tener una definición amplia, que incluye la fase pre­ embrionaria. El término "embrión" como se usa en este documento puede abarcar todas las etapas de desarrollo desde la fertilización del ovocito hasta las etapas de compactación, mórula, blastocisto, eclosión e implantación.

En algunos casos, el término "embrión" se usa para describir un ovocito fertilizado después de la implantación en el útero hasta 8 semanas después de la fertilización, en cuya etapa se convierte en un feto en humanos. De acuerdo con esta definición, el ovocito fertilizado a menudo se denomina embrión previo hasta que se produce la implantación. Sin embargo, como se indicó anteriormente, el término "embrión", como se usa en este documento, puede incluir la fase de embrión previo. Un embrión es aproximadamente esférico y está compuesto por una o más células (blastómeros) rodeadas por la matriz acelular conocida como zona pelúcida. La zona pelúcida realiza una variedad de funciones hasta que el embrión eclosiona y es un buen punto de referencia para la evaluación del embrión. La zona pelúcida es esférica y translúcida, y debe distinguirse claramente de los restos celulares.

La fertilización es el momento en el que la célula de esperma es reconocida y aceptada por el ovocito. La célula de esperma desencadena la activación del óvulo después de que el ciclo meiótico del ovocito se haya suspendido en la metafase de la segunda división meiótica. Esto da como resultado la producción y extrusión del segundo cuerpo polar. Este es el punto de tiempo al que se hace referencia en este documento como la exclusión del segundo cuerpo polar (véase el valor de referencia ii.). Algunas horas después de la fusión del esperma y el óvulo, comienza la síntesis de ADN. Aparecen pronúcleos masculinos y femeninos (PN). Este es el punto de tiempo al que se hace referencia como cuando aparecen los pronúcleos (PN) (véase el valor de referencia iii.). Los PN se mueven hacia el centro del óvulo y las membranas se rompen y desaparecen los PN. Este es el punto de tiempo al que se hace referencia en el presente documento como el punto de tiempo en el que los pronúcleos han desaparecido (o se han desvanecido) (véase el valor de referencia i). Esta combinación de los dos genomas se llama singamia. A partir de entonces, comienzan las divisiones celulares.

Durante el desarrollo embrionario, el número de blastómeros aumenta geométricamente (1-2-4-8-16- etc.). La escisión celular sincrónica generalmente se mantiene en la etapa de 8 células en embriones humanos. Después de eso, la división celular se vuelve asincrónica y finalmente las células individuales poseen su propio ciclo celular. Los embriones humanos producidos durante el tratamiento de infertilidad generalmente se transfieren al receptor antes de la etapa de 8 blastómeros. En algunos casos, los embriones humanos también se cultivan hasta la etapa de blastocisto antes de la transferencia. Esto se hace preferiblemente cuando hay muchos embriones de buena calidad disponibles o cuando es necesaria una incubación prolongada para esperar el resultado de un diagnóstico genético previo a la implantación (PGD). Sin embargo, existe una tendencia a la incubación prolongada a medida que mejora la tecnología de incubación.

En consecuencia, el término embrión se usa a continuación para indicar cada una de las etapas de ovocito fertilizado, cigoto, 2 células, 4 células, 8 células, 16 células, compactación, mórula, blastocisto, blastocisto expandido y blastocisto eclosionado, así como todas las etapas intermedias (por ejemplo, 3 células o 5 células).

Se forma un embrión cuando se fertiliza un ovocito mediante la fusión o inyección de una célula de esperma (espermatozoides). El término se usa tradicionalmente también después de la eclosión (es decir, ruptura de la zona pelúcida) y la implantación subsiguiente. Para los seres humanos, el ovocito fertilizado se denomina tradicionalmente cigoto o embrión durante las primeras 8 semanas. Después de eso (es decir, después de ocho semanas y cuando se han formado todos los órganos principales) se le llama feto. Sin embargo, la distinción entre cigoto, embrión y feto no está generalmente bien definida. Los términos embrión y cigoto se utilizan en el presente documento indistintamente. En una realización, el embrión se puede cultivar individualmente.

En otra realización más, el embrión se cultiva en el medio de cultivo de la presente invención hasta la etapa de blastocisto, etapa de blastocisto expandido o etapa de blastocisto eclosionado. Adicional o alternativamente, se ha encontrado sorprendentemente que el medio de cultivo de acuerdo con la presente invención mejora la proliferación y diferenciación de una célula madre cultivada in vitro. El término "diferenciación" como se usa en el presente documento (por ejemplo, en relación con el desarrollo de células madre) significa el proceso mediante el cual una célula cambia de un tipo de célula a otro. Este término puede abarcar un tipo de célula menos especializado convirtiéndose en un tipo de célula más especializado, tal como durante el crecimiento celular.

El término "proliferación" como se usa en este documento (por ejemplo, en relación con el desarrollo de células madre) significa la multiplicación de células madre, por ejemplo, resultando en la expansión de la población de células madre. El término "célula madre", como se usa en este documento, significa células biológicas indiferenciadas que pueden diferenciarse en células especializadas y pueden dividirse (mediante mitosis) para producir más células madre. El término "célula madre" abarca tanto las células madre embrionarias, que pueden aislarse de la masa celular interna de los blastocistos, como células madre adultas, que pueden encontrarse en diversos tejidos. Además o alternativamente, el término "célula madre" como se usa en este documento significa una célula madre pluripotente inducida (iPSC). Las iPSC son un tipo de célula madre pluripotente que se puede generar directamente a partir de células adultas.

En una realización, el término célula madre significa célula madre embrionaria.

En particular, las células madre embrionarias pueden derivarse de la masa celular interna de un embrión. Los inventores de la presente invención han demostrado que el medio de cultivo de la presente invención protege y/o mejora el desarrollo de la masa celular interna. Por lo tanto, el medio de cultivo de la presente invención protege las células madre embrionarias, que se derivan de la masa celular interna. En una realización, la célula madre puede ser una célula madre humana.

En una realización, el medio (de fondo) puede ser un medio específico para el cultivo de células madre. Se puede utilizar cualquier medio de cultivo de células madre conocido como medio de fondo.

En una realización, el medio de células madre (de fondo) puede ser un medio para el cultivo de una célula madre pluripotente.

En una realización, el medio de células madre (de fondo) puede ser un medio para el cultivo de células madre embrionarias humanas y/o células iPS.

En una realización, el medio de células madre (de fondo) puede ser el medio disponible comercialmente conocido como mTeSRMR1, por ejemplo, un medio de mantenimiento definido, sin alimentador para células madre embrionarias humanas y células iPS (disponibles a través de StemCellMR Technologies, Reino Unido).

El embrión o la célula madre se puede cultivar en un entorno con un contenido de oxígeno de entre 5-20% v/v. En una realización, el embrión, gameto o célula madre se cultiva en condiciones ambientales de oxígeno. Las condiciones ambientales de oxígeno como se usan en este documento pueden estar entre aproximadamente 18-22% v/v o entre aproximadamente 19-21% v/v. En una realización, las condiciones ambientales de oxígeno son aproximadamente 20% v/v.

En otra realización, el embrión, gameto o célula madre se cultiva en condiciones de oxígeno reducido. Las condiciones de oxígeno reducido como se usan en este documento pueden ser una concentración de oxígeno entre aproximadamente 3% (v/v) y aproximadamente 7% (v/v) o entre aproximadamente 4% (v/v) y aproximadamente 6% (v/v). En una realización, las condiciones de oxígeno reducido son aproximadamente 5% (v/v).

La presente invención se refiere al uso de ácido lipoico o un derivado del mismo. El término ácido lipoico puede significar ácido a-lipoico. Este compuesto puede ser cualquier forma racémica, por ejemplo, Ácido (±)-1,2-ditiolano-3-pentanoico, ácido (R)-5-(1,2-ditiolano-3-il)pentanoico o ácido (S)-1,2-ditiolano-3-pentanoico. El ácido lipoico o derivado del mismo se puede añadir como una mezcla de formas enantioméricas o como un solo enantiómero. En el último caso, se ha encontrado que el enantiómero R es más activo biológicamente. Un derivado del ácido lipoico para usar en la presente invención es el lipoato. El lipoato es una sal o un éster derivado del ácido lipoico. Otro derivado del ácido lipoico incluye ácido lipoico metilado. El término "derivado" como se usa en este documento en relación con el ácido lipoico significa moléculas de disulfuro/tióticas anfifílicas biológicamente activas que tienen propiedades fisiológicas esencialmente equivalentes a las del ácido lipoico.

El término "acetilcisteína" como se usa en este documento puede ser N-acetil-L-cisteína (NAC) (por ejemplo, NAC sin modificar), o un derivado de la misma, tal como N-acetilcisteína-amida (NACA).

En una realización preferida, el término "acetilcisteína" como se usa en este documento significa N-acetil-L-cisteína (NAC) (por ejemplo, NAC sin modificar).

El término acetilcarnitina puede denominarse acetil-L-carnitina.

En una realización, el embrión o la célula madre puede cultivarse en el medio de la presente invención a una temperatura de entre aproximadamente 35 °C y aproximadamente 39 °C.

En una realización preferida, el embrión o la célula madre puede cultivarse en el medio de la presente invención a una temperatura entre aproximadamente 36,5 °C y aproximadamente 37,5 °C.

En una realización más preferible, el embrión o la célula madre puede cultivarse en el medio de la presente invención a una temperatura de aproximadamente 37 °C.

En una realización, el medio de cultivo de acuerdo con la presente invención no comprende coenzima Q o ubiquinona. En una realización, el medio de cultivo de acuerdo con la presente invención no comprende coenzima Q o ubiquinona en la región de 0,0001% al 0,005% en peso en la composición final.

En una realización, el medio de cultivo de acuerdo con la presente invención no comprende un tensioactivo de polisorbato. El tensioactivo de polisorbato puede ser, por ejemplo, TweenMR o SpanMR

Una referencia a un gameto como se menciona en el presente documento incluye tanto un gameto singular como múltiples gametos. En otras palabras, un gameto significa "un gameto o gametos".

Una referencia a un embrión como se menciona en el presente documento incluye tanto un embrión singular como múltiples embriones. En otras palabras, un embrión significa "un embrión o embriones".

Una referencia a una célula madre como se menciona en el presente documento incluye tanto una célula madre singular como múltiples células madre. En otras palabras, una célula madre significa "una célula madre o células madre".

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, Nueva York (1994), y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) le proporcionan al experto un diccionario general de muchos de los términos usados en esta divulgación. Esta divulgación no está limitada por los ejemplos de métodos y materiales divulgados en el presente documento, y cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse en la práctica o prueba de las realizaciones de esta divulgación.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de ese intervalo también se describe específicamente. Cada intervalo más pequeño entre cualquier valor establecido o valor intermedio en un intervalo establecido y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido está incluido en esta descripción. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse o excluirse de forma independiente en el intervalo, y cada intervalo en el que ninguno o ambos límites están incluidos en los intervalos más pequeños también se incluye dentro de esta descripción, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos de los límites incluidos también se incluyen en esta descripción.

Debe tenerse en cuenta que, como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un embrión" incluye una pluralidad de tales embriones candidatos, y así sucesivamente. Las publicaciones discutidas en este documento se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este documento debe interpretarse como una admisión de que tales publicaciones constituyen la técnica anterior a las reivindicaciones adjuntas.

La invención se describirá ahora, solo a modo de ejemplo, con referencia a las siguientes Figuras y Ejemplos.

Ejemplos

Métodos y materiales

Recolección de embriones

Se inyectaron intraperitonealmente ratones hembra híbridos F1 vírgenes (C57BL/6 x CBA) de 3-4 semanas de edad con 5 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada. 48 horas después, se administraron 5 UI de gonadotropina chorulon humana y las hembras se aparearon con ratones macho F1 de mas de 12 semanas de edad. El apareamiento exitoso fue confirmado por la presencia de un tapón de moco vaginal a la mañana siguiente. Los ovocitos pronucleados se recogieron 22 horas después de la inyección de hCG, en medio de manipulación precalentado (G-MOPS) suplementado con 5 mg/mL de albúmina de suero humano. Las células del cúmulo se desnudaron de los ovocitos con GMOPS que contenía 300 UI/mL de hialuronidasa. Todos los embriones se lavaron dos veces en medio G-MOPS y una vez en medio G-1MR antes de la asignación para cultivo. Los animales se alojaron con un fotoperiodo de 12 horas de luz al día con comida y agua disponibles a voluntad. Toda la experimentación con ratones fue aprobada por el Comité Institucional de Ética Animal.

Cultivo de embriones

Los embriones se cultivaron en grupos de 10 en gotas de 20 pL de medio bajo aceite de parafina en 6% de CO2 en aire (oxígeno atmosférico ~ 20%) o en 6% de CO2, 5% de oxígeno a 37 °C en una incubadora de gases múltiples humidificada (Sanyo MCOK-5M [RC], Japón). Los embriones se cultivaron en medio G-1MR (G-1MR con HSA-solutionMR, Vitrolife) durante 48 horas y luego durante 48 horas más en medio G-2MR (G-2MR con HSA-solutionMR, Vitrolife). Los blastocistos elegidos para la transferencia uterina el día 4 se cultivaron en medio G2 durante 24 horas antes de la transferencia. Todos los cultivos se realizaron en placas de Petri de 35 mm (Falcon, BD Biosciences). Transferencia de embrión

Se aparearon ratones hembra F1 de 8-12 semanas de edad con machos vasectomizados para establecer una pseudopreñez. El apareamiento exitoso fue confirmado por la presencia de un tapón vaginal a la mañana siguiente. Los blastocistos 4 días (96 horas después de la inseminación) se transfirieron quirúrgicamente al útero de ratones hembras pseudopreñadas de 4 días (sincrónicos con el tracto reproductor de la hembra receptora). Se anestesiaron ratones hembra receptores con gas isoflurano. Se transfirieron cinco embriones con una pipeta de vidrio a través de una incisión dorsal, al lumen de cada cuerno uterino, y cada hembra receptora recibió embriones de los grupos de control y de tratamiento. Para evitar cualquier sesgo de implantación preferencial, se transfirieron grupos alternativos al cuerno derecho e izquierdo por receptor. Después de la transferencia de embriones, la herida de la piel se selló con grapas quirúrgicas estériles. Las hembras preñadas se sacrificaron 10 días después y se registraron los sitios de desarrollo o reabsorción del feto. Se tomaron medidas de la longitud céfalo-caudal, pesos fetal y placentario y se determinaron los grados morfológicos del desarrollo de orejas, ojos y extremidades fetales de acuerdo con lo ideado por Wahlsten y Wainwright (1977) (J. of Embryology and Experimental Morphology 42: 79-92.

Determinación del número de células embrionarias

La tinción diferencial de embriones se realizó mediante técnicas comúnmente conocidas en el arte para determinar la asignación de células a la masa celular interna (ICM) y al trofectodermo (TE) el día 5 (por ejemplo, en el blastocisto). Brevemente, después de la eliminación de la zona usando pronasa, los embriones se trataron con una reacción de complemento que marca los núcleos en TE con yoduro de propidio y deja la ICM intacta y sin marcar. Después del tratamiento con bisbencimida, se tiñeron todos los núcleos. Los embriones se montaron en su totalidad en glicerol y se obtuvieron imágenes usando un microscopio de fluorescencia invertido (Nikon Eclipse TS100) equipado con una cámara digital (Nikon digital sight DS-Fi1) y se contaron los núcleos usando el software de imágenes ImageJ.

Cultivo de embriones para tratamiento con MCB y BSO

Los embriones se cultivaron en grupos de 10 en gotas de 20 pL de medio bajo aceite de parafina (Ovoil, Vitrolife) en 6% de CO² , 20% de O², 74% de N² a 37 °C en una incubadora de gases múltiples humidificada (Sanyo MCOK-5M [RC], Japón). La mitad de los embriones se asignaron al grupo de control y la otra mitad al grupo de tratamiento. Los embriones del grupo de control se cultivaron en medio G-1^MR (G-1^MR con HSA-solution^MR, Vitrolife) durante 4 horas. Los embriones del grupo de tratamiento se cultivaron igualmente con la dosis óptima triple antioxidante suplementada en el medio G-1^MR (como se determina en el Ejemplo 2).

Optimización de la dosificación de BSO

Inmediatamente después de la recolección, los embriones de control pronucleados se incubaron en medio G-1^MR enriquecido con BSO a dosis de 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1600 pM durante 4 horas con 6% de CO², 20% de O²74 % de N² a 37 °C. Los embriones se enjuagaron minuciosamente en G-1^MR con medio HSA-solution^MR y se colocaron individualmente en gotas de 2 pL de GMOPS con HSA-solution^MR (G-MOPS^MR Plus, Vitrolife AB, Suecia) preparados en placas con fondo de vidrio (Fluorodish, Coherent Scientific , Australia) y recubierto con aceite de parafina (Ovoil, Vitrolife) para obtener imágenes de fluorescencia. La dosis óptima se determinó registrando la fluorescencia a longitudes de onda de excitación/emisión de 360 ± 40 nm/460 ± 40 nm bajo un microscopio de fluorescencia (Nikon Eclipse TS100). Los resultados se calcularon restando los valores del blanco (embriones sin exposición a BSO) y los niveles basales del medio de cultivo de la fluorescencia registrada. Todos los medios y aceites usados se equilibraron previamente durante la noche con 6% de CO² , 20% de O² y 74% de N² a 37 °C.

Optimización de la dosificación de MCB

La optimización de la sonda fluorescente de MCB se llevó a cabo de manera similar a la optimización de BSO como se describió anteriormente con embriones incubados en medio G-1^MR suplementado con MCB con dosis de 0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 pM durante 15 minutos.

Verificación de la especificidad de MCB por glutatión (GSH)

Se utilizaron las dosis óptimas de BSO 200 pM y MCB 10 pM para verificar la especificidad de MCB por GSH. La verificación se llevó a cabo de la misma manera que las optimizaciones de dosificación de la sonda como se describió anteriormente. Inmediatamente después de la recolección, los embriones pronucleados se incubaron en medio G-1^MR ™ suplementado con BSO 200 pM durante 4 horas. Después de un enjuague completo en G-1^MR con medio HSA-solution^MR, los embriones se cultivaron adicionalmente en MCB 10 pM durante 15 minutos. Después de un enjuague completo final en G-1^MR con HSA-solution^MR, los embriones se colocaron individualmente en gotas de 2 pl de G-MOPS^MR con HSA-solution^MR bajo aceite de parafina y se tomaron imágenes de fluorescencia.

Determinación de los niveles de glutatión.

4 horas después de la recolección e incubación de los ovocitos, los embriones de los grupos de control y de tratamiento se trataron con MCB 10 pM durante 15 minutos en las mismas condiciones de cultivo. Después de enjuagar los embriones y colocarlos en gotas de medio individuales de 2 pL de G-1^MR, se capturó la fluorescencia como se describió anteriormente. Para evaluar el curso temporal de MCB se tomaron imágenes cada 10 minutos.

Análisis estadístico

Los datos del número de células para todos los tratamientos en comparación con el control se sometieron a un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni. Los datos proporcionales se compararon mediante una tabla de contingencia de 3x2. Para dosis únicas, las medias de los datos se compararon con los controles utilizando la prueba t de Student. Se probó la normalidad de todos los grupos antes del análisis mediante la prueba de Bartlett. Las diferencias se consideraron biológicamente significativas con un valor p de 0,05. Todos los análisis se realizaron utilizando GraphPad Prism versión 5.04 para Windows (disponible de GraphPad Software).

Ejemplo 1: Desarrollo de embriones grupales en 20% de O² con compuestos individuales

Los embriones cultivados en grupos de control se cultivaron en medio G-1^MR y G-2^MR suplementado con HSA 5 mg/mL (HSA, Vitrolife). Los embriones en los grupos de tratamiento se cultivaron de manera similar con acetilcarnitina, acetilcisteína o ácido a-lipoico (Sigma Aldrich, EE. UU.) suplementados en el medio G-1^MR y G-2^MR con dosis de 1, 10 y 100 pM y suplementado con HSA como grupo de control. La dosis óptima de carnitina (Figura 1a y Tabla 1a que representan dos experimentos independientes), cisteína (Figura 1b y Tabla 1b que representan dos experimentos independientes) y ácido lipoico (Figura 1c y Tabla 1c) se determinaron cultivando embriones y analizando los números de linaje celular de blastocistos resultantes. La "media total" significa el número total medio de células en el embrión (incluida la masa celular interna y el trofectodermo) en el día 5. La dosis que dio como resultado un número de células significativamente mayor se consideró la dosis óptima. Se encontró que la dosis óptima para acetilcarnitina era de 10 pM con un aumento significativo de las células de trofectodermo que da como resultado un aumento del número de células de blastocisto. De manera similar, la dosis óptima para acetilcisteína fue 10 pM con un número de células internas de blastocisto significativamente mayor. Se encontró que 5 pM era la dosis óptima para el ácido lipoico que mostraba un número de células internas y de trofectodermo significativamente más alto que da como resultado un número mayor de células de blastocisto. No hubo ningún efecto negativo en ningún tratamiento sobre la formación de blastocisto en comparación con el control (datos no mostrados).

Tabla 1a:

Tabla 1b:

Tabla 1c:

Además, estos datos muestran que únicamente aumentar la concentración de un único compuesto no aporta los beneficios asociados con las combinaciones de la presente invención.

Ejemplo 2: Efecto de antioxidantes combinados sobre el número de células de blastocistos

Los embriones cultivados en grupos de control se cultivaron en medio G-1MR y G-2MR suplementado con 5 mg/mL de HSA-solutionMR. Los embriones en los grupos de tratamiento se cultivaron de manera similar con acetilcarnitina 10 pM-acetilcisteína 10 pM, acetilcarnitina 10 pM-ácido lipoico 5 pM, acetilcisteína 10 pM-ácido lipoico 5 pM, el cóctel triple de acetilcarnitina 10 pM-acetilcisteína 10 pM-ácido lipoico 5 pM suplementado en el medio G-1MR y G-2MR y suplementado con HSA. El número de células de blastocistos después de 5 días de incubación fue significativamente mayor en los embriones tratados con el cóctel antioxidante triple que con los tratamientos con antioxidante doble. Mientras que el grupo de carnitina 10 pM-ácido lipoico 5 pM también tuvo un número total de células significativamente mayor en comparación con el control, el cóctel triple también había aumentado significativamente las células TE que contribuyeron a un mayor número total de células (Figura 2).

Ejemplo 3: Desarrollo de embriones grupales en 5% de O2 con compuestos combinados

Los embriones se cultivaron en grupos de 10 en gotas de 20 pL de medio bajo aceite de parafina (Ovoil, Vitrolife) en 6% de CO2, 5% de O2, 89% de N2 a 37 °C en una incubadora de múltiples gases humidificada (Sanyo MCOK-5M[Rc ], Japón). La mitad de los embriones se asignaron al grupo de control y la otra mitad al grupo de tratamiento. Los embriones del grupo de tratamiento se cultivaron con la dosis óptima de antioxidante suplementada en el medio, como se determinó previamente. Cuando se cultivaron con 5% de O2, los embriones cultivados individualmente con el cóctel triple habían aumentado significativamente la ICM y las células de trofectodermo, lo que resultó en un mayor número total de células de blastocistos (Figura 3).

Ejemplo 4: Cultivo de embriones individuales en 20% O2 con compuestos combinados

Los embriones se cultivaron individualmente en gotas de 20 pL de medio bajo aceite de parafina en 6% de CO2 en aire (oxígeno atmosférico ~ 20%) a 37 °C en una incubadora de múltiples gases humidificada (Sanyo MCOK-5M [RC], Japón). La mitad de los embriones se asignaron al grupo de control y la otra mitad al grupo de tratamiento. Los embriones cultivados individualmente con el cóctel triple habían aumentado significativamente la ICM y las células de trofectodermo, lo que resultó en un aumento del número total de células de blastocistos (Figura 4). Estos resultados muestran que el desarrollo embrionario mejorado también se observa durante el cultivo individual. Si bien el número total de células fue menor en los embriones cultivados individualmente, los efectos de combinar los antioxidantes fueron mayores para los embriones cultivados individualmente en comparación con los cultivados en grupos, con un aumento de ICM, TE y número total de células (Figura 4 vs Figura 2).

Ejemplo 5: Tiempos de escisión y desarrollo de embriones individuales cultivados con cóctel triple.

La cinética de desarrollo embrionario se adquirió usando PrimoVison (Vitrolife) usando una incubadora termostatada de dos gases equipada con óptica de campo brillante (MCOK-5M[RC], Sanyo, Osaka, Japón) y los sistemas de obtención de imágenes en un lapso de tiempo EmbryoScopeMR (Unisense FertiliTech). Los embriones se cultivaron individualmente en grupos de control y en grupos de tratamiento a la dosis óptima de antioxidante y se generaron imágenes de lapso de tiempo a intervalos de 15 minutos durante todo el período de cultivo. Los tiempos de los eventos morfocinéticos se registraron como horas después de la administración de hCG. Tiempos de escisión y desarrollo celular de embriones cultivados individualmente en 20% de O2 en medio suplementado con cóctel antioxidante que comprende Carnitina 10 pM, Cisteína 10 pM y ácido lipoico 5 pM o en medio de control sin antioxidantes (Figura 5). El análisis de la cinética de desarrollo reveló que los embriones cultivados en el grupo de cóctel triple tuvieron tiempos significativamente más rápidos para expandirse (99,8 ± 0,5 horas frente a 102,8 ± 0,7 horas; P <0,05) y blastocistos en eclosión (102,6 ± 0,8 horas frente a 104,9 ± 1,1 horas; P <0,01) que los embriones cultivados en los grupos de control (Figura 5), lo que indica que el beneficio de la exposición a los antioxidantes se puede ver más adelante en el desarrollo a medida que se desarrolla el blastocisto.

Ejemplo 6: Efecto del tiempo de exposición a los compuestos

Efecto del tiempo de exposición a los antioxidantes

Hubo un aumento significativo en el número de masa celular interna del blastocisto, lo que condujo a un aumento significativo en el número total de células de embriones cultivados en medio suplementado con cóctel durante todo el período de cultivo hasta 5 días (G1 y G2), en comparación con los controles. También hubo un aumento significativo en el número de células totales de blastocisto de embriones cultivados en medio suplementado solo en medio G-1MR (Figura 6), lo que indica un beneficio de precompactación.

Ejemplo 7: Correlación del agotamiento de GSH debido a la especificidad de BSO

Se encontró que las dosis óptimas de sonda eran de butionina sulfoximina (BSO) 200 pM y 10 pM/mL de monoclorobimano (MCB). BSO es un inhibidor de la glutatión sintetasa. MCB se une al glutatión (GSH) reducido y es un marcador fluorescente de GSH que se utiliza para medir el GSH dentro de las células.

Los embriones que se trataron previamente con BSO 200 pM de y posteriormente se trataron con 10 pM/mL o 40 pmol/mL de MCB mostraron una fluorescencia significativamente reducida en comparación con los grupos tratados con MCB solamente (Figura 7). Los resultados indican una unión de alta especificidad de BSO a la glutatión sintetasa, lo que reduce la concentración endógena de GSH, lo que da como resultado niveles de fluorescencia más bajos. La Figura muestra una reducción significativa de la fluorescencia en embriones tratados con una combinación de BSO 200 pM y MCB 10 pM o 40 pM en comparación con los embriones tratados solo con MCB. MCB 10 pM tenía una fluorescencia reducida mayor (P = 0,004) en comparación con 40 pM (P = 0,011) por lo que esta concentración (40 pM) se usó en experimentos posteriores. Curiosamente, con MCB 80 pM no hubo diferencias significativas en la fluorescencia entre el grupo tratado con BSO y el grupo no tratado con BSO, lo que indica que a concentraciones más altas de MCB no se pudo detectar la disminución de la fluorescencia debido al secuestro de BSO debido a los altos niveles de fluorescencia de MCB.

Ejemplo 8: Efecto de los antioxidantes sobre los niveles de GSH embrionario

Los embriones se cultivaron de acuerdo con la sección de materiales y métodos - véase "Cultivo de embriones para tratamiento con MCB y BSO" y los niveles de glutatión (GSH) se determinaron durante la "Determinación de los niveles de glutatión" en la sección de materiales y métodos anterior. Los embriones en los grupos de control que se cultivaron en ausencia de los compuestos (por ejemplo, antioxidantes) tenían niveles significativamente más bajos de GSH (P <0,01) en comparación con los embriones lavados in vivo (Figura 8). Sin embargo, cuando los embriones se cultivaron con el cóctel de triple antioxidante, los niveles de GSH fueron similares a los de los embriones desarrollados in vivo, lo que indica que los antioxidantes mantuvieron los niveles de GSH dentro de los embriones cultivados in vitro. Ejemplo 9: Efecto de los compuestos sobre el desarrollo fetal y el embarazo (20% de O2)

Después de la transferencia de blastocistos a embriones de receptoras pseudopreñadas que se cultivaron en presencia de antioxidantes, se obtuvo una longitud céfalo-caudal significativamente mayor (11,6 ± 0,1 mm frente a 11,3 ± 0,1 mm; P <0,01), fetos más pesados (209,8 ± 11,8 mg frente a 183,9 ± 5,9 mg; P <0,05) y placentas (103,5 ± 3,1 mg frente a 93,6 ± 2,7 mg; P <0,01) en comparación con los controles (Tabla 2). No hubo diferencias significativas en la tasa de implantación entre los embriones de control y los embriones cultivados con triple antioxidante. De manera similar, la clasificación morfológica de los parámetros de determinación de la extremidad, el ojo y el oído y el sexo no mostró diferencias significativas entre los dos grupos.

Tabla 2: Transferencia de embriones en 20% de O2 con cóctel triple

Los datos son expresados como % de la media ± SEM. n =95 blastocistos transferidos por grupo

F, hembra; M, macho; n/a, no determinado; Ex, Exencefalia

La letra dentro de la fila representa diferencias significativas entre los grupos

a P<0,05, b P<0,01.

Ejemplo 10: efecto de los compuestos sobre el desarrollo fetal y el embarazo de embriones cultivados con 5% de oxígeno y comparados con embriones de 4 días lavados in vivo

Después de la transferencia de blastocistos a receptoras pseudopreñadas, los embriones que se lavaron in vivo dieron como resultado fetos significativamente más pesados (P <0,0001) en comparación con los embriones en los grupos de control y triple antioxidante (Tabla 3). Además, los fetos del grupo lavado in vivo tenían una longitud céfalo-caudal significativamente mayor (P <0,01) en comparación con el grupo de control, sin embargo, no hubo diferencias en comparación con el grupo triple. Además, no hubo diferencias significativas en la tasa de implantación, la clasificación morfológica de las extremidades, los ojos y los oídos y los parámetros sexuales entre los tres grupos.

Tabla 3: Transferencia de embriones en 5% de O2 con cóctel tri le

Ejemplo 11: Efecto de una combinación de antioxidantes para IVF mejora significativamente el desarrollo del embrión El estrés oxidativo ocurre en todas las etapas del ART humano, siendo los gametos particularmente susceptibles al daño oxidativo. Se ha demostrado que la combinación de los antioxidantes lipoato y carnitina (y opcionalmente cisteína) en medios de cultivo fue muy beneficiosa para el desarrollo del embrión.

En el presente trabajo experimental se mostró que la presencia de antioxidantes durante la IVF también fue beneficiosa. Por lo tanto, se examinaron los efectos de este grupo de antioxidantes durante la recolección de ovocitos y espermatozoides y la IVF.

Materiales y métodos: La recolección de gametos de ratones F1 y la IVF se llevaron a cabo en 20% de oxígeno en presencia o ausencia de acetil-L-carnitina 10 pM/N-acetil-L-cisteína 10 pM/ácido a-lipoico 5 pM. Los embriones resultantes se cultivaron individualmente en medios G-1MR y G-2MR con o sin antioxidantes, creando cuatro grupos. El desarrollo del embrión se analizó mediante microscopía de lapso de tiempo seguida de tinción nuclear diferencial para determinar la asignación de células al blastocisto.

Los números de masa celular total e interna (ICM) en el control fueron 32,9 ± 2,1 y 7,7 ± 2,1 respectivamente. La adición de antioxidantes exclusivamente en el medio para la IVF dio como resultado un aumento significativo en el número total (48,7 ± 2,8; P <0,01). Los antioxidantes presentes únicamente en los medios de cultivo de embriones dieron como resultado un aumento significativo en el número total de células (50,4 ± 3,2; P <0,001). Sin embargo, la presencia de antioxidantes tanto en el medio de IVF como en el medio de cultivo de embriones resultó en aumentos significativos tanto en el blastocisto total como en el número de células ICM (59,8 ± 3,4, 15,3 ± 1,1; P <0,01). El análisis de lapso de tiempo posterior en los embriones derivados de la IVF reveló que el tratamiento con antioxidantes durante la IVF y el cultivo se asoció con tiempos de desarrollo más rápidos hasta la división de 5 células (51,8 ± 0,6 horas frente a 54,1 ± 0,7 horas) que continuó hasta la etapa de blastocisto expandido. En conclusión, la presencia de antioxidantes durante la IVF y durante el cultivo de embriones imparte efectos beneficiosos significativos sobre la tasa de desarrollo del embrión y el número y la asignación de células posteriores. Estos hallazgos indican que la suplementación de antioxidantes al medio de IVF, así como al cultivo de embriones, ayudará aún más a mantener la viabilidad de los embriones humanos en ART, posiblemente a través de la reducción del estrés oxidativo.

En un estudio separado, se recolectaron embriones pronucleados en presencia o ausencia de antioxidantes en el medio de manipulación de gametos, a saber, G-MOPSMR, y se cultivaron en medio de control sin antioxidantes. El medio de fertilización utilizado para la IVF fue G-IVFMR, el medio de cultivo de embriones utilizado para cultivar los embriones desde una célula hasta el blastocisto fue en medio G-1MR y luego G-2MR (G-1MR fue para el día 1 durante 48 horas & G-2MR fue para el día 3 durante 48 horas). El desarrollo de embriones se analizó mediante tinción celular diferencial.

Resultados: La adición de antioxidantes exclusivamente en medios de manipulación de gametos para IVF dio como resultado embriones con números de células de blastocisto significativamente aumentados en comparación con los controles (48,9 ± 3,3 frente a 33,6 ± 2,1; P <0,001) (véase la Figura 9). De manera similar, los antioxidantes presentes únicamente en los medios de cultivo de embriones dieron como resultado un número de células de blastocistos significativamente mayor en comparación con los controles (59,3 ± 3,1 frente a 33,6 ± 2,1; P <0,001) (véase la Figura 9). La presencia de antioxidantes durante la recolección de gametos y el cultivo de embriones también resultó en aumentos significativos adicionales en el número de células de blastocistos en comparación con los controles (61,0 ± 3,9 frente a 33,6 ± 2,1; P <0,001) (véase la Figura 9). El análisis de lapso de tiempo posterior en los embriones derivados de la IVF reveló que el tratamiento con antioxidantes durante la recolección y el cultivo se asoció con tiempos de desarrollo más rápidos hasta la división de 5 células (51,8 ± 0,6 horas frente a 54,1 ± 0,7 horas) que continuó hasta la etapa de blastocisto (véase la Figura 10). En un estudio independiente, los ovocitos pronucleados tratados con antioxidantes durante 20 minutos durante la recolección de embriones resultaron en un aumento significativo del número de masa celular interna de blastocisto en comparación con los controles (19,3 ± 1,2 frente a 16,2 ± 1,1; P <0,05).

Conclusión: La inclusión de antioxidantes durante la preparación de gametos y la IVF y también durante el período de cultivo tiene resultados beneficiosos sobre el número de células embrionarias y la tasa de desarrollo. Estos hallazgos indican que la suplementación de antioxidantes en los medios de preparación/manipulación de ovocitos y esperma y los medios de IVF, así como en el cultivo de embriones, ayudará aún más en el desarrollo y la viabilidad de los embriones humanos en el ART mediante la reducción del estrés oxidativo.

Ejemplo 12: Efecto de una combinación de antioxidantes mejora significativamente el desarrollo de embriones humanos in vitro

En el presente trabajo experimental se mostró que la presencia de antioxidantes fue beneficiosa para el desarrollo del embrión humano in vitro. Se examinaron los efectos de un grupo de antioxidantes, a saber, acetilcarnitina 10 j M, acetilcisteína 10 j M y ácido lipoico 5 j M durante el desarrollo del embrión in vitro.

Materiales y métodos

Para el grupo experimental, los antioxidantes (acetil-L-carnitina 10 jM/N-acetil-L-cisteína 10 jM/ácido a-lipoico 5 j M) se añadieron al medio Vitrolife G-IVF que se usó para la recuperación y fertilización de ovocitos humanos y para los medios G1 y G2 suplementados con proteínas (disponibles a través de Vitrolife) que se utilizaron para el cultivo de embriones humanos, el medio se cambió de G-1 a G-2 el día tres.

Los embriones se cultivaron en 5% de oxígeno.

El desarrollo del embrión se evaluó mediante microscopía de lapso de tiempo y la calidad del embrión se midió el día 5 mediante un sistema de puntuación de blastocistos definido (véase Gardner et al., 1999. In vitro culture of human blastocyst In Jansen R and Mortimer D (eds) Towards reproductive certainty: fertility and genetics beyond 1999. Parthenon Publishing Carnforth, RU, páginas 378-388). Los parámetros del resultado final fueron la tasa de utilización y la calidad del embrión en la etapa de blastocisto.

Resultados: La adición de antioxidantes en los medios de cultivo de embriones dio como resultado más blastocistos de buena calidad (es decir, la fracción de blastocistos que alcanzó una puntuación de calidad de 3AB o superior de acuerdo con el sistema de puntuación de Gardner (véase Gardner et al., 1999) en comparación con los embriones cultivados en medios comparables sin antioxidantes (véase la Figura 13). La Figura 13 muestra la proporción de blastocistos en porcentaje que alcanzan la puntuación de Blastocistos de buena calidad (GQB), de acuerdo con el sistema de clasificación de blastocistos de Gardner, por número total de blastocistos. En el grupo de control 8 de 30 blastocistos se clasificaron como GQB en el grupo cultivado en medio suplementado con acetilcarnitina 10 j M, acetilcisteína 10 j M y ácido lipoico 5 j M, 18 de 36 se clasificaron como GQB. La gran diferencia entre los dos grupos se ilustra mediante el valor p de 0,0545 aplicando una prueba t de dos colas utilizando software disponible comercialmente (GraphPad Prism). Además, los antioxidantes aumentaron significativamente la tasa de utilización de blastocistos (es decir, la fracción de blastocistos que se utilizan frescos para la transferencia o criopreservados para su posterior transferencia al paciente (véase la Figura 11 y la Figura 12). La Figura 11 muestra la tasa de utilización de blastocistos en porcentaje del número total de ovocitos fertilizados. En el grupo de control se seleccionaron 12 de 44 ovocitos fertilizados para uso clínico adicional, en el grupo cultivado en medio suplementado con acetilcarnitina 10 |jM, acetilcisteína 10 jM y ácido lipoico 5 jM , 26 de 49 se seleccionaron para uso terapéutico clínico adicional. Los blastocistos que no cumplieron con los requisitos de calidad no fueron seleccionados y se descartaron. La diferencia entre los dos grupos fue significativa con un valor p de 0,0112 aplicando una prueba t de dos colas usando un software disponible comercialmente (GraphPad Prism).

La Figura 12 muestra la tasa de utilización de blastocistos en porcentaje del número total de blastocistos. En el grupo de control se seleccionaron 12 de 28 blastocistos para uso clínico adicional, en el grupo cultivado en medio suplementado con acetilcarnitina 10 jM , acetilcisteína 10 jM y ácido lipoico 5 jM , 26 de 36 se seleccionaron para uso terapéutico clínico adicional. Los blastocistos que no cumplieron con los requisitos de calidad no fueron seleccionados y se descartaron. La diferencia entre los dos grupos fue significativa con un valor p de 0,0173 aplicando una prueba t de dos colas utilizando software disponible comercialmente (GraphPad Prism).

Conclusión: La inclusión de antioxidantes durante la recuperación de ovocitos, fertilización y cultivo de embriones in vitro tiene resultados beneficiosos sobre la calidad de los blastocistos. En particular, el uso de antioxidantes dio como resultado más blastocistos de mejor calidad que pueden usarse para terapia.

Aunque la presente invención se ha descrito en relación con realizaciones preferidas específicas, debe entenderse que la invención tal como se reivindica no debe limitarse indebidamente a tales realizaciones específicas. De hecho, se pretende que varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención que son obvias para los expertos en bioquímica y biotecnología o campos relacionados estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Medio de cultivo de embriones, medio de cultivo de gametos o medio de cultivo de células madre que comprende: a) acetilcamitina a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 pM; y

b) ácido lipoico o un derivado del mismo a una concentración de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 40 pM, en el que el derivado es una molécula de disulfuro/tiótica anfifílica biológicamente activa que tiene propiedades fisiológicas esencialmente equivalentes a las del ácido lipoico.

2. El medio de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el medio de cultivo comprende además acetilcisteína a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 pM.

3. El medio de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la concentración de acetilcarnitina es de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 20 pM, tal como aproximadamente 10 pM.

4. El medio de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en el que la concentración de acetilcisteína es de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 20 pM, tal como aproximadamente 10 pM.

5. El medio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de ácido lipoico o un derivado del mismo es de aproximadamente 5 pM a aproximadamente 10 pM, tal como aproximadamente 5 pM.

6. El medio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio comprende además uno o más de: una sal inorgánica, fuente de energía, aminoácido, proteína, citocina, agente quelante, antibiótico, hialuronano, factor de crecimiento, hormona, vitamina y GM-CSF.

7. Un método para manejar y/o manipular y/o cultivar un embrión para IVF, un gameto o una célula madre, comprendiendo el método manejar y/o manipular y/o cultivar el embrión para IVF o gameto o célula madre en un medio de cultivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. Un método para reducir o prevenir el estrés oxidativo y/o la formación de radicales libres, por ejemplo formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y/o aumento de los niveles de capacidad antioxidante en un embrión para IVF, un gameto o una célula madre cultivada in vitro y/o mejorar el desarrollo de un embrión cultivado in vitro o mejorar la proliferación y diferenciación de una célula madre cultivada in vitro o mejorar la salud y viabilidad de un gameto, comprendiendo el método manejar y/o manipular y/o cultivar el embrión para IVF y/o gameto, o célula madre, en un medio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

9. Uso de un medio de cultivo de embriones, medio de cultivo de gametos o medio de cultivo de células madre de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para reducir o prevenir el estrés oxidativo y/o la formación de radicales libres, por ejemplo, formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y/o aumentar los niveles de capacidad antioxidante en un embrión para IVF o células madre cultivadas in vitro y/o para mejorar el desarrollo de un embrión cultivado in vitro para IVF o mejorar la proliferación y diferenciación de una célula madre cultivada in vitro.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 8 o el uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la mejora en el desarrollo de un embrión comprende:

c) un aumento en el número de células del trofectodermo, la masa celular interna y/o el número total de células en el embrión en la etapa de blastocisto;

d) un tiempo reducido para alcanzar el blastocisto expandido y el desarrollo de la eclosión;

e) un aumento en el peso fetal, la longitud céfalo-caudal fetal y/o el peso placentario después de la transferencia de embriones;

f) un aumento de blastocistos de buena calidad; y/o

g) un aumento en la tasa de utilización de blastocistos.

11. Uso de un medio de cultivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para mejorar la tasa de éxito de la fertilización in vitro.

12. El método o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-11, en el que el embrión es un embrión de mamífero, por ejemplo, un embrión humano.

13. El método o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-12, en el que el embrión se cultiva individualmente.

14. El método o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-13, en el que el embrión se cultiva hasta la etapa de blastocisto.

15. El método o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-11, en el que la célula madre se selecciona de una o más de las siguientes: una célula madre embrionaria, una célula madre adulta y una célula madre pluripotente inducida.

16. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7-12 o la reivindicación 15, en el que la célula madre es una célula madre humana.

17. El método o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-16, en el que el embrión, gameto o célula madre se maneja y/o manipula y/o cultiva en un ambiente con un contenido de oxígeno de entre 5-20%.

18. Uso de un medio de cultivo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en el cultivo de un embrión para IVF, un gameto o una célula madre.