KR100882858B1 - 돼지 배아의 발생률 증가용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 돼지 배아의 발생률 증가용 조성물에 관한 것이다.
돼지 배아, 발생, 항산화제

Description

돼지 배아의 발생률 증가용 조성물{Composition for increasing developmental rate of porcine embryos}
본 발명은 돼지 배아의 발생률 증가용 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 돼지 배아들의 인 비트로의 생성은 생식 생명공학에서 주요한 적용을 가진다. 그러나 돼지 종족에서 배아 생성의 효율은 낮다(Wang et al., 1999, Biol. Reprod., 60:1020-1028) 난할구(Blastomere) 절편화는 포유류 배아에서 주요한 문제점 중 하나이다. 그것은 핵분열(karyokinesis)없는 세포질 분열 또는 핵에서 핵분열은 진행되었으나 세포의 형태적 외양은 여전하게 유지하고 있는 에팝토시스의 특징으로 여겨질 수 있다. 그것은 처녀생식(Kikuchi et al., 1999 Biol. Reprod., 60:336-340) 난세포질내 정자 주입법(ICSI;Kolbe and Holtz, 1999 Theriogenology., 52:671-82), 및 체세포 핵전이 돼지 배아들(Cheong et al., 2000..Reprod. Fertil. Dev., 12:15-20.)에서 종종 관찰되고, 절편의 실질적인 양은 인간에서 크게 감소된 이식(implantation)률을 가지기 때문에(Ziebe et al. 1997 Hum. Reprod., 12:1545-1549), Ebner et al. 2001, Fertil. Steril., 76:281-285) 그것은 불량 배아 특성의 지표로 간주된다(Mateusen et al., 2005 Reproduction 129:443-52, Lindner & Wright 1983 Theriogenology., 52:671-82 Puissant et al. 1987., Hum Reprod., 2:705-708). 비정상적인 난할구의 진행성 손실 및 따라서 염색체 이상 때문에 배아들도 초기 배아 발생의 특정 단계에서 일어날 수 있다(King, 1990; Iwasaki et al., 1992., Advances in Veterinary Science and Medicine.,34:229-250). 따라서 초기 난할 단계 중 건강한 배아들의 동정 및 생성은 핵전이를 수반하는 적절한 임신을 달성하는데 중요하다.
반응성 산소 족(ROS)에 의한 산화적 스트레스는 세포막에 해로운 지질 과산화를 유도한다(Johnson et al., 1994 Bioessays. 16:31-8). 지질 과산화는 산화적 스트레스의 주된 결과이고 일반적으로 세포막의 다중불포화 지질과 ROS의 상호작용에 의해 야기되는 것으로 생각된다 (Jennifer et al., 1998 Journal of pharmacological & toxicological., 39:155-162). 돼지 난자들은 다른 포유류 종보다 다중불포화 지질의 양이 3-4배 높은 양을 가지고(McEvoy et al., 2000, J Reprod Fertil. 118:163-70) 따라서 지질 과산화에 특히 취약하다(Yuichiro et al., 2004 Theriogenology. 62:1186-1197).
따라서 본 발명은 인 비트로에서 생성된 돼지 처녀생식에서 난할구 절편화와 지질 과산화 사이의 관계를 조사하여 돼지 배아의 절편률을 줄이고 발생률을 증가시키는 것에 관한 것이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 돼지 배아의 발생률을 증가시키기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 항산화제를 유효성분으로 하는 돼지 배아 발생률 증가용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 항산화제는 시스테인, 타우린, 글루타치온으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항산화제가 바람직하며, 상기 항산화제의 유효 농도는 0.1mM에서 50mM인 것이 더욱 바람직하다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 항산화제는 라자로이드인 것이 더욱 바람직하며, 상기 라자로이드의 유효 농도는 1에서 90 μM인 것이 바람직하며, 상기 유효 농도는 6에서 50 μM인 것이 더욱 바람직하다.
이하, 본 발명은 간단하게 설명한다.
본 발명은 돼지 처녀 배아에 항산화제를 첨가하여 발생 능력을 증가시키고, 낮은 절편률을 나타내었다(표 2, 표 6 및 표 7 등 참조).
특히 항산화제 중 Lazaroid (U83836E;C30H44N6O22HCL / MW: 593.6 Calbiochem, cat.No.662058)는 다른 항산화제들에 비하여 훨씬 낮은 농도 범위에서 대조군보다 매우 낮은 절편화률을 가질 뿐 아니라 매우 높은 발생 능력을 가진다(표 6). 또한 전체 세포 수도 Lazaroid 를 처리함에 따라 증가할 뿐 아니라 핵 절편화률은 감소하였다(표 7).
따라서 본 발명자들은 특히 Lazaroid가 돼지 처녀 배아에 대한 발생률에 있어서 낮은 농도에서도 우수한 효과를 보인다는 것을 밝혀냈다.
비록 Lazaroid U83836E는 우수한 항산화제이지만 고농도 사용하는 경우에는 세포독성을 가지므로(Katharina et al., 1998, Biochemical. Pharm., 56:945-954) 본 발명에서 사용된 Lazaroid의 바람직한 농도는 배반포 단계에서 1-90 μM이 바람직하고, 6-50 μM이 더욱 바람직하며, 10μM 부근이 가장 바람직하다.
본 발명의 구성에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명은 H2O2에 의하여 유도된 지질 과산화에 의하여 증가된 난할구 절편화를 본 발명의 Lazaroid 화합물을 처리하여 절편화를 감소시키고, 발생률을 증가시킨다는 것을 보였다.
이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예는 처녀 배아의 절편화의 빈도를 측정하였다. 절편화된 것과 되지 않은 배아들을 그들의 발생 능력을 평가하기 위하여 분리하여 배양하였다.
본 발명의 다른 일 실시예는 절편화률과 배반포률에 대한 시스테인,타우린 및 글루타치온의 효과를 평가하였다.
본 발명의 또 다른 일 실시예는 성숙률, 절편화률 및 배반포률에 대하여 각각 산화 및 절편화 유도제로 알려진 H2O2와 dbcAMP-의 효과를 측정하였다.
본 발명의 또 다른 일 실시예는 절편화률에 대한 특정한 지질 과산화 저해제인 Lazaroid U83836E의 효과를 측정하였다.
실시예 1: 돼지 처녀 배아(Parthenotes)의 생산
난자 채취 및 인 비트로 성숙
성숙기 전(Prepubertal) 돼지 난소를 지역 도살장에서 수집하여 30-37℃ 식염수에 유지되어 실험실로 운반되었다.난자 난구 복합체(Cumulus oocyte complex;COC)를 18G 바늘을 가진 10ml 주사기를 사용하여 난포(2-6mm 직경)으로부터 추출하였다. 그 난자 난구 복합체들을 1mg/ml 소 혈청 알부민(BSA) (낮은 카보네이트 TALP; Parrish et al., 1988)를 포함하는 TL-HEPES 배지에서 3회 세척 후, 25 mM NaHCO3 10%(v/v)돼지 난포액, 0.57mM Cystein, 0.22 ㎍/ml sodium pyruvate, 25㎛/ml gentamicin sulfate, 0.5 ㎍/ml p-FSH(Follitropin V; Vetrepharm, Canada), 1㎍/ml estradiol-17B, 및 10ng/ml 표피 세포 성장 인자(EGF;E-4127,Sigma)가 보충된 Earle's 염을 가지는 500㎕의 조직 배양 배지 199(TCM-199;Gibco BRL, Grand Island, NY)으로 50 군으로 나누어서, 5% CO2 공기의 습도 분위기에서 39℃에서 광유 하에서 42-44 시간 성숙시켰다.
난자의 처녀생식적 활성화
인 비트로 성숙 후에, 난자들을 0.1% 히아루로니데이즈를 사용하여 난구 세포를 벗겨서 이배체 처녀배아를 생성하기 위하여 전기적으로 활성화하였다. 간단하게 설명하면, 벗긴 난자들을 TL-HEPES-BSA 배지로 3회 세척 후에, 0.3M mannitol, 0.1 mM MgSO₄와 1.0 mM CaCl₂를 포함하는 활성배지로 전기적으로 활성화하였다. 활성화는 벗긴 난자들을 전기 펄싱 기계(BTX Electo Cell Manipulator200; BTX, San Diego, CA)가 연결된 챔버에서 활성화 배지로 커버된 1mm 폭과 0.2mm 직경의 백금 전극 사이로 전달했다. 활성화는 1.36 kv/cm의 단일 직류 펄스로 30 m초 동안 유도하였다. 활성화 후, 활성화된 난자들을 추가 배양을 위한 인 비트로 배양 배지로 옮기기 전에 4시간 동안 7.5 mg/ml Cytochalasin B (Sigma, St. Louis, MO, USA)가 보충된 북 캘리포니아 주립 대학 배지 23(NCSU23)배지에 배양하였다.
활성화된 난자의 인 비트로 배양
활성화된 처녀배아를 0.4% 지방산 없는 BSA (Sigma, St. Louis, MO, USA)가 보충된 NCSU23에서 7일간 배양하여 배반포률을 배양 7일째에 측정하였다. 활성화 168시간 후, 배반포는 TUNEL 레이블링, Hoechst 33342 염색 및 유전자 발현 분석에 의하여 배아 질을 평가하기 위하여 수집하였다.
실시예 2: TUNEL 및 세포 카운팅
TUNEL 분석 키트는 배반포에서 에팝토틱 세포의 존재를 평가하기 위하여 사 용하였다(in situ Cell Death Detection Kit, AP; Roche Diagnostic Corp., Indianapolis, IN) 간단하게 설명하면, 7 일된 배반포를 상온에서 1시간 동안 pH 7.4에서 PBS에서 4% 파라포름알데히드에서 고정하여, 1시간 동안 1.0% Triton X-100와 0.1% 구연산 나트륨 용액으로 PBS에서 투과시켰다. 죽은 세포의 절단된 DNA 말단들에 TdT와 fluorescein-Dutp로 39℃에서 1시간 동안 표지하였다. 그 후 그 배반포들을 전체 핵 수를 가시화하기 위하여 5 ㎍/ml Hoechst 33342 (Sigma, St. Louis, MO, USA)로 카운터-염색하고 유니버설 마운트(Research Genetics, Huntsville, AL)에 마운트하였다. 핵 형태(즉 절편화)는 현미경을 통하여 보는 동안 측정하였으나 세포 수를 결정하기 위하여 각 배반포의 두 디지털 이미지들(Nikon Coolpix 990; Nikon Corporation, Tokyo, Japan)을 기록하였다: (i)Hoechst 33342 이미지를 위한 UV 필터를 사용하고, (ii) TUNEL 이미지를 위한 FITC 필터를 사용하여. 핵의 수는 이미지를 인쇄한 후 카운트하였다.
실시예 3: 난할구 절편화의 유도
난할구 절편화는 다이부티릭 사이클릭 아데노신 3' 5' 모노포스페이트(dbcAMP)에 의하여 유도하였다. 간단하게 설명하면, 난자들을 확장된 두레이션을 위하여 0.1 mM의 dbcAMP (Sigma, MO, USA)이 공급된 인 비트로 성숙 배지에서 성숙시켜서 배양 24, 48, 72, 및 120 시간에서 측정하였다.
실시예 4: 난할구(blastomere) 절편화의 평가
난할구 절편화를 측정하기 위하여, 비 고정된 배아들을 배아 당 핵의 수를 계수하기 위하여 25㎍/ml의 bisbenzmide (Hoechst 33342)로 염색하고 DAPI 필터 세트를 사용하여 UV 조사 하에서 가시화하였다. 동일한 배아를 광원 하에서 난할구의 수를 기록하였다. 핵없는 난할구를 가지는 배아들을 절편화된 것으로 간주하였다.
실시예 5: 지질 과산화의 유도
지질 과산화는 다음과 같이 유도하였다. 섬유아세포들을 Ca2 +/Mg2 + 프리 DPBS (Gibco BRL, UK)에서 3회 세척하고, 지질 과산화를 측정하기 위하여 사용되기 전에 15분간 과산화 수소(1.0, 5.0, 10.0 mM)에서 배양하였다. 배아의 경우에는 배양 배지에서 3회 세척 후, 그들을 30분간 과산화 수소(10.0mM) 가 첨가된 배양 배지에서 배양하였다.
실시예 6: 지질 과산화의 억제
지질 과산화는 특정한 항 지질 과산화제인 Lazaroid (U83836E)를 사용하여 세포 및 배아에서 억제되었다. 섬유아세포의 경우에는 그 세포들을 Lazaroid (0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 50.0, 100.0 μM)의 존재하에서 밤새 배양하고 지질 과산화의 수준을 측정하였다. 배아의 경우에는 그들을 0, 5, 10, 50 μM의 Lazaroid로 처리하였다.
실시예 7: 지질 과산화의 측정
지질 과산화는 지질 과산화 특정 fluorophore C-11 BODIPY581/591 (1μM, Junction City, OR, USA)를 이용한 형광 분석으로 측정하였다. 지질 과산화 레벨을 측정하기 위하여 세포들을 DPBS로 3회 세척 후에 C-11 BODIPY581/591로 30분간 처리하였다. 그 후 그 세포들을 DPBS로 세척하였다. 형광성 측정은 멀티웰 스펙트로후로로미터(Molecular device, USA)를 사용하여 수행하였다. 붉은 형광은 각각 590/15nm와 635/20 nm의 익사이테이션 및 에미션 밴드패스 필터를 사용하여 선택적으로 검출하였다. 측정들을 3회 반복하였고 1시간 동안 2분마다 반복하였다. 지질 과산화 스트레스는 시간당 이 선형 감소의 기울기에 해당하는 과산화 스트레스 계수로 표현하였다.
상기 모든 실험들은 최소 3회 반복한 것으로 구성된다. 통계 분석은 SAS 소프트웨어(Statistical Analysis System Inc., Cary, NC, USA)를 사용하여 수행하였다. 배반포 핵 카운트 및 핵 손상 평균을 넌 페어된 t-테스트 또는 ANOVA로 비교하였다. 데이터는 평균 ±S.E.M로 나타내었다. 0.05 이하의 P값 차이를 유의적인 것으로 간주하였다.
상기 실시예에 따른 결과는 다음과 같다.
도 1에 나타난 바와 같이, 돼지 처녀배아는 배양 2일에서 높은 퍼센테이지의 절편률(57.3 ±0.3%) 및 낮은 발생능(12.0 ±0.5%)을 보였다. 또 절편화된 배아들(20.0 ±0.6%)은 비 절편화된 배아들(30.5 ±0.3%)보다 더 낮은 발생능을 보였다(도 2).
또 처녀생식 배아들을 배양 2일에 Hoechst 33342로 염색하고 난할구의 수 및 거기에 핵의 존재 또는 부존재에 기초하여 절편화된 배아와 비-절편화된 배아로 분류한 후 분리하여 배양하고 발생률에 대한 그들의 영향을 측정하였다. 처녀생식 활성화 2일 후 배아의 분류를 도 3에서 나타내었다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이 이들 배야들의 절편화률은 2-4 세포 레귤라(37.0 ±0.7%), 2-4 세포 일레귤라(27.8 ±0.3%), 4 세포 레귤라 이상(15.8 ±0.0%)및 4 세포 일레귤라 이상(12.3 ±0.2%)이었다. 인 비트로에서 생성된 처녀배아는 2일의 분류 후에 배반포단계로 배양하였다(도 3). 2-4 세포 레귤라 군(16.0 ±0.4%)은 다른 군인 2-4 세포 일레귤라(5.7 ±0.1%), 4 세포 레귤라 이상(3.1 ±0.1%) 및 4 세포 일레귤라 이상군(0.3 ±0.0%)(P<0.05)보다 현저하게 높은 배반포로 발생률을 보였다.
군 배아들의 수 발생률
8-16 세포 상실배 배반포
2-4 세포 레귤라 150 86(21.5)a 76(18.9)a 64(16.0)a
2-4 세포 일레귤라 109 34(8.9)b 27(7.0)b 22(5.7)b
4 세포 레귤라 이상 63 22(5.4)c 11(2.7)b 12(3.1)c
4 세포 일레귤라 이상 49 7(1.7)c 3(0.7)b 1(0.3)c
표 1은 인 비트로 배양 2일째 레귤러리티와 세포의 수에 기초한 돼지 처녀배아의 발생 능력을 나타내는 표이고, 컬럼 내에 다른 첨자들을 갖는 a,b,c 값들은 유의적으로 다르다(P<0.05). 또 상기의 결과는 3회 반복 실행하여 얻어진 것이다.
인 비트로 성숙 배지에 시스테인(0.56 mM) 타우린(7.0 mM) 또는 글루타치온(0.25 mM)을 첨가한 것과 첨가하지 않은 것에 처녀생식을 수행하였다. 결과들은 항산화제로 처리한 군에서 비 절편화된(7.2 ±0.4, 17.5 ±0.7, 17.9 ±0.7 및 14.4 ±0.1%) 배아들과 절편화된 배아들(2.1 ±0.3, 9.0 ±0.4, 6.4 ±0.1 및 8.6 ±0.1%) 모두 배반포률이 증가되었고, 절편화률이 감소(41.6 ±0.3, 33.0 ±0.3, 34.2 ±0.4 및 26.8 ±0.4%)하였다. 처리군은 대조군보다 더 낮은 절편화률을 나타낼 뿐만 아니라(P<0.05), 대조군보다 절편화된 및 비절편화된 군의 더 높은 배반포률을 나타낸다(P<0.05).
군 난자 수 비절편화된 절편화된 전체
난할 배반포 난할 배반포 난할 배반포
대조군 168 54(32.3)a 13(7.2)a 71(41.6)a 4(2.1)a 125(73.9) 17(9.3)a
시스테인 165 83(49.7)b 29(17.5)b 53(33.0)b 13(9.0)b 136(82.7) 42(26.5)b
타우린 162 75(46.7)b 28(17.9)b 57(34.2)b 10(6.4)b 132(81.0) 42(24.3)b
글루타치온 170 86(49.8)b 25(14.4)b 46(26.8)b 15(8.6)b 132(76.5) 40(23.0)b
표 2는 돼지 처녀배아의 발생률 및 절편화에 대한 항 산화제의 효과를 보여주는 표이다. 컬럼 내에 다른 첨자들을 갖는 a,b 값들은 유의적으로 다르다(P<0.05).
또한 본 발명의 일 실시예 세트는 H2O2 (0.1 mM)에 의한 지질 과산화 및 dbcAMP (0.1 mM)에 의한 절편화의 유도 효과를 조사하기 위하여 고안되었다. 이 실시예에서 상기 실시예들과 다르게 정의된 배지(FSH 및 FBS가 첨가된 NCSU23 배지)가 난자들의 인비트로 성숙을 위하여 사용되었다. 결과는 배양 2일 때까지 난할구 절편화률에 대한 군들 사이에 차이가 없다는 것을 나타내었다. 그러나 모든 군들의 자발적인 절편화는 48시간 후에 현저하게 유도되었다. H2O2 (92.7 ±0.4%) 및 dbcAMP (69.4 ±0.6%) 처리 군들은 대조군(59.4 ±0.4%)보다 더 높은 절편화률을 나타내었다. 특히 H2O2는 가장 높은 절편화률을 나타내었다. 120 시간의 마지막에서 그들을 절편화 타입을 확인하기 위하여 Hoechst 33342로 염색하였다.　
군들 난자 수 노말 레귤라 절편화 일레귤라 절편화 퇴화
대조군 102 9(8.8)a 6(5.6) 54(53.4)a 33(32.4)a
dbcAMP 100 5(5.3)a 1(1.1) 69(68.3)b 25(25.3)a
H2O2 102 1(0.8)b 0(0.0) 94(92.7)c 7(6.5)b
표 3은 난할구 절편화의 타입에 대한 H2O2 와 dbcAMP의 효과를 나타낸 표이다.
표 3에서 나타낸 바와 같이 자발적인 절편화된 배아들을 Hoechst 33342 염색으로 조사하였다. H2O2 와 dbcAMP 처리군은 대조군보다 더 낮은 정상(0.8 ±0.1, 5.3 ±0.2 와 8.8 ±0.2%)과 레귤라 절편화률(0.0 ±0.0, 1.1 ±0.2 및 5.6 ±0.3%)을 보였다. 또 H2O2 군은 가장 높은 일레귤라 절편화률을 보였다. 또 다른 실시예 세트에서 난자들을 H2O2 (0.1 mM) 또는 or dbcAMP (0.1 mM)의 존재 또는 부존재하에서 성숙하여 난구 팽창 및 극체 돌출(extrusion)의 관점에서 인 비트로 성숙의 효과를 측정하였다. 그 난자들을 성숙된 난자들의 핵 상태를 분석하기 위하여 Hoechst 33342로 더 염색하였다. 표 4에서 나타낸 것과 같이 dbcAMP 처리군은 대조군(52.1±0.7%)보다 더 낮은 난구 팽창률(45.7 ±0.1%)을 보였으나 극체 돌출에서 좀 더 높은 (48.4 ±0.7 과 52.7 ±0.1%)을 보였다. H2O2 처리 군은 더 낮은(P<0.05) 난구 팽창률 및 극체 돌출을 보였다.
군들 난자 수 큐뮤러스(cumulus)팽창 PB 돌출
디그리 0 디그리 1 디그리 2
대조군 139 8(5.5)a 57(42.4)a 66(52.1)a 66(48.4)a
dbcAMP 142 15(10.4)a 63(43.9)a 75(45.7)a 75(52.7)a
H2O2 137 112(81.4)b 23(16.6)b 25(2.0)b 25(19.4)b
표 4는 돼지 처녀배아의 인 비트로 성숙률에 대한 H2O2 와 dbcAMP의 효과를 나타낸 표이다.
핵 성숙률은 성숙된 난자들에 대한 H2O2 및 dbcAMP의 효과를 측정하였다. 결과들은 대조군과 dbcAMP 군들은 H2O2 (39.6 ±0.7%)보다 더 높은 퍼센테이지의 성숙률(83.9±0.4%)를 보였고, H2O2 군에서, 가장 높은 비정상성(36.8 ±0.3%)을 보였다.
군들 난자 수 GV GVBD MI MⅡ 비정상
대조군 139 3(2.2)a 0(0.0)a 0(0.0) 117(83.9)a 19(13.9)a
dbcAMP 142 8(5.6)a 1(0.9)a 4(2.8) 117(81.0)a 11(8.6)a
H2O2 137 13(10.1)b 16(10.3)b 5(3.2) 53(39.6)b 50(36.8)b
표 5는 핵 성숙에 대한 H2O2 와 dbcAMP의 효과를 나타낸 표이다.
또한 본 발명에서는 난할구 절편화에 대한 지질 과산화의 유도 또는 억제 효과를 조사하였다.
지질 과산화는 H2O2에 의해 유도되고 지질 과산화에 특이적인 Lazaroid에 의하여 억제되었다. 난할구 절편화는 상기에 언급한 것과 같이 dbcAMP에 의하여 유도되었다. 실험의 첫번째 세트에서 본 발명자들은 지질 과산화에 영향을 미치는 그들의 능력에 대한 세포 배양 시스템에 대한 H2O2 및 Lazaroid의 효과를 테스트하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, H2O2로 처리한 세포는 용량 및 시간 의존적인 형태로 초기 형광의 퍼센테이지의 감소를 야기하였다.
70-80% 컨푸루언시의 태아 섬유아세포를 Lazaroid (0.0, 0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 50.0, 및 100.0 μM)의 존재하에서 밤샘 배양하였다. 그 후 그 세포들을 DPBS로 세척하고 지질 과산화 특이적인 C11-BODIPY로 30분간 로드하였다. 그 후 염료 로드된 세포들을 H2O2 (0.0, 1.0, 5.0 및 10.0 mM)로 15분간 배양하고 지질 과산화 레벨을 측정하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, H2O2에 의하여 생산된 산화적 스트레스 계수는 용량 의존적인 형태로 Lazaroid 처리 군에 대하여 감소하였다.
다음으로 인 비트로 성숙 배지에 Lazaroid 보충의 효과를 조사하였다. 이것을 위하여 난자들을 Lazaroid (0.0, 5.0, 10 및 50.0 μM)로 보충된 한정 배지(FSH 및 FBS가 첨가된 NCSU23 배지)에서 성숙시켰다. 표 7에서 나타낸 것과 같이, 난할률은 Lazaroid (33.9 ±3.0, 45.6 ±2.9, 60.4 ±1.2 및 43.9 ±0.9%) 존재에서 증가한 반면 절편화률은 10 μM의 Lazaroid 처리 군(43.4 ±1.6, 42.8 ±1.0, 28.8 ±0.5 및 42.1 ±2.2%)에서 현저하게 감소하였다. 또 10 μM의 Lazaroid 처리는 다른 군들(22.5 ±1.5, 24.7 ±0.5 및 23.5 ±0.9%)보다 현저하게 높은 배반포률을 보였다(34.8±0.6%). 표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 배반포의 전체 세포수는 35.5±2.5 (대조군), 46.7 ±4.5 (5 μM), 49.5 ±5.0 (10 μM), 22.7 ±5.5 (50 μM)인 반면에 핵 절편화률은 17.6 ±2.5 (대조군), 5.0 ±1.2 (5 μM), 5.0 ±1.1 (10 μM), 9.3±2.6 (50 μM)이었다. 전체 세포수 및 핵 절편화는 군들 사이에 현저한 차이를 보였다(P<0.05).
군 배반포 수 총 세포 수 핵 절편화 절편화 지수
대조군 22 35.5±2.5 a 100 17.6 ±2.5
5 μM 22 46.7 ±4.5c 77.3 5.0 ±1.2
10 μM 30 49.5 ±5.0c 66.7 5.0 ±1.1
50 μM 19 22.7 ±5.5b 76.5 9.3±2.6
표 6은 Lazaroid 부존재 또는 존재하에서 성숙된 돼지 난자들의 핵 절편화 및 전체 세포수를 나타낸다.
군 난자 수 난할 절편화 8-16세포 상실배 배반포 전체
초기 팽창 해취드
대조군 123 45(36.2)a 50(40.0)a 19(15.1)a 17(13.8) 4(3.2) 4(3.4) 0(0.0) 8(6.6)
5 μM 120 48(40.2)a 43(35.0)a 29(24.2)b 22(18.9) 5(4.2) 6(5.2) 0(0.0) 11(9.4)
10 μM 119 65(55.1)b 33(27.3)b 32(27.2)b 21(18.1) 4(3.5) 8(7.1) 0(0.0) 12(10.6)
50 μM 116 45(39.6)a 38(32.1)a 11(9.4)a 9(7.7) 3(3.0) 2(1.6) 0(0.0) 5(4.6)
표 7은 Lazaroid 부존재 또는 존재 하에서 성숙된 돼지 난자의 절편화 및 발생능력을 나타내는 표이다.
다음으로 처녀생식(Parthenogenetic) 배아들을 Lazaroid (0.0, 5.0, 10 및 50.0 μM)가 보충된 한정 배지(0.4% PVA가 첨가된 NCSU 23 배지)에서 배양하여 절편화, 난할 및 배반포률을 측정하였다. 배반포들을 Hoechst 33342 염색에 의하여 핵 절편화의 지수, 빈도 및 전체 핵 수를 더 측정하였다. 표 8에 나타난 바와 같이, 10 μM Lazaroid 처리군은 대조군(40.0±0.7%)보다 현저하게 낮은(P<0.05) 절편화률(27.3 ±0.4%)을 보였다. 그러나 그들 사이의 배반포률에는 큰 차이는 없었다. 이들 배아들의 세포 수 및 핵 절편화 모두는 대조군보다 Lazaroid 처리군에서 더 높은 세포 수 및 더 낮은 절편화률을 보였다.
군 난자 수 난할 절편화 8-16세포 상실배 배반포 전체
초기 팽창 해취드
대조군 123 45(36.2)a 50(40.0)a 19(15.1)a 17(13.8) 4(3.2) 4(3.4) 0(0.0) 8(6.6)
5 μM 120 48(40.2)a 43(35.0)a 29(24.2)b 22(18.9) 5(4.2) 6(5.2) 0(0.0) 11(9.4)
10 μM 119 65(55.1)b 33(27.3)b 32(27.2)b 21(18.1) 4(3.5) 8(7.1) 0(0.0) 12(10.6)
50 μM 116 45(39.6)a 38(32.1)a 11(9.4)a 9(7.7) 3(3.0) 2(1.6) 0(0.0) 5(4.6)
표 8은 Lazaroid 부존재 또는 존재하에서 배양된 돼지 처녀배아들의 핵 절편화와 발생능력을 나타낸 표이다.
본 실험의 다음 세트에서 난자들을 Lazaroid (10 μM) 또는 dbcAMP (0.1 mM) 또는 Lazaroid+dbcAMP로 보충되거나 보충되지 않는 한정 배지(FSH 및 FBS로 첨가된 NCSU23 배지)에서 성숙된 난자들을 배양 0, 48 및 72 시간들에서 절편화 패턴을 조사하였다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, Lazaroid 처리군(35.5 ±0.3%)은 대조군(45.2 ±0.3%) 및 dbcAMP (42.9 ±0.5%) 군 보다 더 낮은 절편화률을 보일 뿐 아니라 dbcAMP와 Lazaroid 군 (37.2 ±0.2%)은 Lazaroid 군보다 약간 더 높은 절편화률을 보였다.
군 배반포 수 총 세포 수 핵 절편화 절편화 지수
대조군 8 26.3±2.0 a 100 16.0 ±2.5a
5 μM 11 33.3 ±4.0b 81.7 10.2 ±1.2b
10 μM 12 40.2 ±5.2b 52.4 7.3 ±1.1b
50 μM 15 35.5 ±5.2b 79.5 8.3±2.6b
표 9는 Lazaroid 부존재 또는 존재 하에서 배양된 돼지 처녀배아의 핵 절편화 및 전체 세포 수를 나타내는 표이다.
따라서 본 발명의 항 지질 산화제는 돼지 배아의 발생률을 개선하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 인 비트로에서 처녀 배아(parthenotes)의 발생 특성을 나타낸 그림.
도 2는 인 비트로에서 생성된 절편화된 돼지 처녀배아들의 발생능력을 보여주는 그림.
도 3은 인 비트로 배양 2일째에 세포의 수와 레률라리티에 기초한 돼지 처녀배아의 분류를 보여주는 그림. A 및 B: 2-4 세포 레귤라 배아들; C 및 D: 2-4 세포 일레귤라 배아들; E: > 4 세포 레귤라 배아; F: > 4 세포 일레귤라 배아. 확대 X 200.
도 4는 인 비트로 배양 2일째에 세포의 수와 레률라리티에 기초한 돼지 처녀배아의 절편화률을 보여주는 그림.
도 5는 인 비트로 배양된 돼지 배아들에서 절편화 유도의 시간에 대한 H2O2와 dbcAMP에 대한 효과를 나타내는 그림. 값들과 평균 ± S.E.M, 대조군 배지에서 배양된 배아들(●); H2O2로 배양된 배아들(▲); dbcAMP로 배양된 배아들(■).
도 6은 H2O2와 dbcAMP로 배양된 절편의 타입을 나타내는 그림. A: 정상 난할된(cleaved) 배아; B: 레귤라 절편화된 배아;　C: 일레귤라 절편화된 배아; D: 퇴화된(degenerated) 배아.　확대 X 200.
도 7은 돼지 태아 섬유아세포들에서 지질 과산화에 대한 H2O2(0.0, 1.0, 5.0 및 10.0 mM)의 효과를 나타내는 그림. 본 도면은 3회 반복 측정된 초기값의 퍼센테이지와 형광 감소의 기울기로 형광의 평균값들을 나타낸다.
도 8은 태아 섬유아세포에서 H2O2 유도된(0.0, 1.0, 5.0 및 10.0 mM) 지질 과산화에 대한 Lazaroid U83836E (0.0, 0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0,　　50.0, 및 100.0 μM)의 효과를 나타내는 그림. 산화적 스트레스 계수는 시간에 대한 형광의 선형 감소의 기울기에 해당된다.
도 9는 돼지 처녀배아들의 발생에 대한 인 비트로 성숙 배지에 제공되는 Lazaroid의 효과를 나타내는 그림. 값들과 평균 ± S.E.M, 대조군 배지에서 배양된 배아들(◆); Lazaroid로 배양된 배아들(●); dbcAMP로 배양된 배아들(▲); Lazaroid와 dbcAMP로 배양된 배아들(■).
도 10은 전자 활성화에 의하여 생성된 돼지 배반포의 세포 핵의 검출을 위한 Hoechst 33342 (청색 A, B, C, D) 염색을 보여주는 사진.　 대조군(A), 5 μM(B), 10 μM(C), 50 μM(D). 확대 200X

Claims (6)

  1. 라자로이드를 유효성분으로 함유하는 돼지 배아 발생률 증가용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 상기 라자노이드의 유효 농도는 5μM초과 50 μM미만인 것을 특징으로 하는 돼지 배아 발생률 증가용 조성물.
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