CN102703383A - 正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用。其将正辛醇添加在含有胎牛血清的培养液中，正辛醇的浓度为：0.1～4mM。本发明显著延缓了哺乳动物卵母细胞体外老化的速度，同时保证了卵母细胞的体外发育能力，从而为延缓或逆转卵子老化提供新的途径，为改进辅助生殖技术提供了参考。本发明的技术在国内外为未见公开报道，具有很高的创新性，对哺乳动物胚胎工程领域有很大的推动作用。
Description
技术领域
本发明涉及哺乳动物胚胎工程领域，具体地，涉及正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用。
背景技术
根据哺乳动物的卵母细胞是否分别在卵泡或输卵管中停留相对较长的时间而将其分成排卵前老化或排卵后老化，排卵后老化又可以根据卵母细胞所处的环境分为体内老化和体外老化。卵子体外老化是指哺乳动物卵子在体外培养一段时间后发生的一系列生化和表观遗传学变化。这些变化导致卵子受精率下降、受精胚胎发育和受胎率低、胎儿畸形率和出生后死亡率高等。它是制约哺乳动物胚胎工程效率的关键因素之一，目前国内外还没有延缓哺乳动物卵子体外老化的实质性技术。而研究报道，如：Kikuchi等首先发现卵子老化的可逆性，他们发现Caffeine与Vanadate通过控制MPF（成熟促进因子）的活性调控卵子老化，钒酸盐能加速卵子老化而咖啡因能延迟卵子老化。Goud等发现NO（一氧化氮）能够延迟卵子老化。DTT（二硫苏糖醇）能够提高受精率与胚胎细胞数、抑制碎裂、促进囊胚的发育，同时降低内细胞团细胞的碎裂。除此之外，TSA（曲古菌素A）能降低猪卵母细胞的碎裂与提高其发育能力，但是对于小鼠来说，TSA能够加速小鼠卵子的老化。在老化过程中卵子内发生大量的分子事件，例如，Ca2+离子稳态发生变化，活性氧（ROS）升高，能量和抗氧化物浓度降低，MPF和MAPK（促分裂素原活化蛋白激酶）活性降低。大量研究表明，Ca2+的异常变化可能是这些事件的核心因素。老化卵子Ca2+的异常主要表现为胞内游离Ca2+浓度增加，受精时Ca2+振荡幅度下降、持续时间缩短，这能直接引发卵子凋亡的发生和基因表观遗传的改化。近来 研究证明细胞老化影响T型钙离子通道，例如，与年轻的神经元相比，老年大鼠神经元的T型Ca2+通道密度会明显增加。
因此，若能开发出通过抑制T型Ca2+通道，阻止卵胞质内游离Ca2+浓度升高而延缓卵子老化进程的技术，势必会对哺乳动物胚胎工程领域有很大的推动作用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用。
其中，所述正辛醇的浓度为：0.1~4mM。
进一步地，所述正辛醇的浓度为：0.5~2mM。
更进一步地，所述正辛醇的浓度为：1mM。
其中，所述正辛醇在哺乳动物卵母细胞体外成熟培养后，开始出现老化，继续进行体外培养的阶段中加入。
进一步地，所述哺乳动物卵母细胞体外成熟培养24h后，开始出现老化。
其中，所述哺乳动物为牛，羊，猪，鼠等。
其中，当所述哺乳动物为牛时，继续进行体外培养的阶段，所述正辛醇（1-octanol）添加在含有胎牛血清的培养液中。
其中，所述胎牛血清的浓度为：5%~20%。
进一步地，所述胎牛血清的浓度为：10%。
本发明所述的正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用，包括：将牛卵巢经体外成熟培养后，放入含上述浓度的正辛醇的胎牛血清培养液中进行老化培养，然后分别进行孤雌激活和体外受精，进行体外培养，统计囊胚率。
哺乳动物卵母细胞在体外成熟培养一段时间后开始老化，再转移到所述培养液中继续进行体外培养（上述老化培养），此时为了延缓哺乳动物卵子体外老化，加入所述正辛醇。一般情况下，哺乳动物卵 母细胞在体外成熟培养24h后开始老化。
本发明提出通过抑制T型Ca2+通道，阻止卵胞质内游离Ca2+浓度升高而延缓卵子老化进程。本发明的发明人通过大量的实验研究，发现正辛醇与没有添加正辛醇的对照组相比，可以显著提高体外老化一段时间后哺乳动物卵子体外受精后的囊胚率。
因此，本发明有益的技术效果如下：
（1）应用方法简单、实用，只需在卵子体外培养液中添加一定浓度的抑制剂即可。
（2）应用范围广，可以用于小型实验动物、家畜、灵长类的体外受精、细胞核移植、单精子注射等胚胎体外生产技术，也可以用于人的辅助生殖技术。
（3）本发明的应用方法对卵子不产生化学毒害。
总之，本发明显著延缓了哺乳动物卵子体外老化的速度，同时保证了卵子的体外发育能力，从而为延缓或逆转卵子老化提供新的途径，为改进辅助生殖技术提供了参考。本发明的技术在国内外为未见公开报道，具有很高的创新性，对哺乳动物胚胎工程领域有很大的推动作用。
附图说明
图1-1至图1-3为正辛醇对体外老化牛卵子胞内游离Ca2+水平的影响（对比例1）；其中图1-1为体外老化12h对照组（TCM199+10%FBS+0mM正辛醇）牛卵子胞质内游离Ca2+水平（对应图1-3中的柱A），图1-2为体外老化12h正辛醇组（TCM199+10%FBS+1mM正辛醇）牛卵子胞质内游离Ca2+水平（对应图1-3中的柱B），图1-3为体外老化12h对照组（柱A）与正辛醇组（柱B）牛卵子胞内游离Ca2+水平的比较，纵坐标表示荧光强度数值；图1-3中的字母a，b表示：具有一个相同字母的标注表示差异不显著（P>0.05），但若双字母不同即表示差异显著（P<0.05），Bar=100μm。
图2-1至图2-3为PMA对体外老化牛卵子胞内游离Ca2+水平的影响（对比例2）；其中图2-1为体外老化12h对照组（TCM199+10%FBS，对应图2-3中的柱A）牛卵子胞质内游离Ca2+水平，图2-2为体外老化12h PMA组（TCM199+10%FBS+100nM PMA，对应图2-3中的柱B）牛卵子胞质内游离Ca2+水平，图2-3为体外老化12h对照组（柱A）与PMA组（柱B）牛卵子胞质内游离Ca2+水平的比较；图2-3中的字母a，b表示：具有一个相同字母的标注表示差异不显著（P>0.05），但若双字母不同即表示差异显著（P<0.05），Bar=100μm。
图3-1至图3-3为BAPTA对体外老化牛卵子胞内游离Ca2+水平的影响（对比例3）；其中图3-1为体外老化12h对照组（TCM199+10%FBS，对应图3-3中的柱A）牛卵子胞质内游离Ca2+水平，图3-2为体外老化12h BAPTA组（TCM199+10%FBS+5μM BAPTA，对应图3-3中的柱B）牛卵子胞质内游离Ca2+水平，图3-3为体外老化12h对照组（柱A）与BAPTA组（柱B）牛卵子胞质内游离Ca2+水平的比较；图3-3中的字母a，b表示：具有一个相同字母的标注表示差异不显著（P>0.05），但若双字母不同即表示差异显著（P<0.05），Bar=100μm。
图4-1至图4-4为培养液中Ca2+对体外老化牛卵子胞内游离Ca2+水平的影响（对比例4）；其中图4-1为体外老化12h有Ca2+组[CR1aa（5mM Ca2+）+10%FBS+0mM正辛醇]牛卵子胞质内游离Ca2+水平（对应图4-4中的柱A），图4-2为体外老化12h无Ca2+组[CR1aa（0mM Ca2+）+10%FBS+0mM正辛醇]牛卵子胞质内游离Ca2+水平（对应图4-4中的柱B），图4-3为体外老化12h无Ca2+但含正辛醇组[CR1aa（0mMCa2+）+10%FBS+1mM正辛醇]牛卵子胞质内游离Ca2+水平（对应图4-4中的柱C），图4-4为体外老化12h有Ca2+组（柱A）、无Ca2+组（柱B）及无Ca2+但含正辛醇组（柱C）牛卵子胞质内游离Ca2+水平的比较，纵坐标表示荧光强度数值；图4-4中的字母a，b表示：具有一个相同字母的标注表示差异不显著（P>0.05），但若双字母不同即表示差异 显著（P<0.05），Bar=100μm。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明中出现的百分号“%”均指体积百分比。
本发明实施例中所使用的试剂成分如下：
M199和TCM199为：直接从M&C基因科技公司（M&C Gene Technology(Beijing)Ltd）公司购买，商品化物料。
非必需氨基酸：
商品名：MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACID SOLUTION（100×），货号：M7145；公司：SIGMA。
必需氨基酸：
商品名：BME AMINO ACID SOLUTION（50×），货号：B6766；公司：SIGMA。
H199液的成分为：9.9g M199粉末，5mmol/LNaHCO3，1.0mmol/LPyruvate Sodium（丙酮酸钠），10mmol/L HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸），10mmol/L HEPES Sodium（4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠），10mg/LHeparin（肝素），75mg/L Penicillin（青霉素），50mg/L Streptomycin（链霉素）。
洗卵液：9.9g M199粉末，5mmol/L NaHCO3，1.0mmol/L Pyruvate Sodium（丙酮酸钠），10mmol/L HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸），10mmol/L HEPES Sodium（4-羟乙基哌嗪乙磺酸钠），10mg/L Heparin（肝素），2%FBS（胎牛血清），75mg/L Penicillin（青霉素），50mg/LStreptomycin（链霉素）。
成熟液：TCM199+10%FBS（胎牛血清）+0.1mg/mL半光氨酸+10ng/mL EGF（表皮生长因子）+10ug/mL FSH（促卵泡素）+10ug/mL LH（促黄体生成素）+0.065mg/mL青霉素+0.05mg/mL链霉素。
CR1aa培养液：
将上述成份加入80mL超纯水中，待所有试剂彻底溶解后，加入0.0287g MgCl2·6H2O 0.055g Hemicalcium L-lactate（乳酸钙，5mM）及100μL Phenol Red（酚红），调整pH为7.4，用超纯水加到100mL，渗透压为265-285mOsm/L。溶液配制好后用0.22μm滤器过滤灭菌，并用15ml无菌离心管分装，每管10mL，4℃保存。
在使用当天，在每1mL的CR1aa培养液中加入3mg的无脂肪酸的BSA（血清白蛋白）或10%FBS（胎牛血清）、20μL必需氨基酸50×储液）、10μL的非必需氨基酸100×储液）和10μL的L-Glutamine（L-谷氨酰胺，100×储液），用0.22μm滤器过滤灭菌，并用1.5ml无菌离心管分装，每管1mL，4℃保存。
BO液（10×）：
定容后使用0.22μm滤器过滤灭菌，并用15ml无菌离心管分装，每管10mL，4℃保存。其中双抗为：青霉素与链霉素。
获能液：BO液（10×）稀释10倍，加入10mM Caffeine（咖啡因）和20μg/mL Heparin（肝素）。
受精液：BO液（10×）稀释10倍，加入3mg/mL BSA（牛血清蛋白）。
透明质酸酶：取透明质酸酶0.1g，溶于10mL DPBS溶液（无钙镁的磷酸缓冲液）中，0.22μm滤膜过滤灭菌，-20℃保存。
本发明所用其他试剂均是可以从市场上购得的常规试剂。
实施例1：牛卵母细胞的采取与体外成熟培养
从屠宰场收集牛卵巢，将其置于含有25-30℃生理盐水的保温瓶内3h内送回实验室。到实验室之后用37℃预热的灭菌生理盐水洗涤卵巢3遍，然后将洗净的卵巢放于预热的灭菌生理盐水置于37℃水浴锅中，用18号针头的10mL的注射器抽吸卵巢上面2-8mm卵泡内的COCs，将具有完整卵丘细胞层或部分致密卵丘细胞在的洗卵液中洗涤2次，然后在成熟液中洗涤3次，将洗净的COCs移入100μL卵母细胞体外成熟培养微滴中，每个微滴放入15-20枚COCs，最后置入38.5℃、5%CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养24h。
实施例2：牛卵子的体外老化
在牛COCs体外培养24h（作为老化的0h）后，COCs用0.1%透明质酸酶（hyaluronidase）脱卵丘细胞或者COCs转移到TCM199+10%FBS中在上述的条件下继续培养（6-24h，每个微滴放20-25枚卵子）。在老化的不同时间点，随机选取裸卵和COCs组做各种检测。
实施例3：牛卵母细胞的孤雌激活
将成熟24h的卵母细胞放入含有0.1％透明质酸酶管内，用移液枪反复吹打1min去除卵丘细胞，然后用含10%FBS的H199液洗涤三遍，将形态完整、细胞质均匀的卵母细胞在5μmol/L离子霉素中激活5min 后，移入含有2.0mmol/L 6-DMAP（6-二甲氨基嘌呤）培养4h。然后用CR1aa+3mg/mL BSA洗三遍，转到预平衡4h的CR1aa+3mg/mLBSA微滴中，每滴15-20枚，置于38.5℃，5%CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，孤雌激活后48h检查卵裂率，将卵裂的胚胎从CR1aa+3mg/mL BSA微滴中挑出并用含CR1aa+10%FBS洗涤3遍，然后将胚胎转到CR1aa+10%FBS微滴中继续培养6d，统计囊胚率，每隔48h换半液。
实施例4：牛卵母细胞的体外受精
（1）成熟卵母细胞体外受精前的准备
将体外成熟培养24h的卵母细胞移入预先平衡BO受精液（38.5℃、5%CO2的二氧化碳培养箱）中洗涤3次，然后移入预平衡的60mm培养皿中的50μL受精液微滴中置入38.5℃、5%CO2的二氧化碳培养箱中等待体外受精，每个受精微滴15-20枚成熟卵母细胞。
（2）精子的准备
将冻精在37℃水浴中解冻后，取0.25ml精液小心置于含有7mLBO获能液灭菌的10mL离心管中，然后离心（1800rpm/min，5min）洗涤两次，然后在显微镜下用BO获能液调整精子浓度为2×106个/mL。
（3）体外受精
取50μL浓度为2×106个/mL的精子悬液加入到50μL受精液微滴中，将成熟卵母细胞与精子在38.5℃，5%CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱中共孵育6h。
（4）胚胎的体外培养
将成熟的卵母细胞与精子共培养6h后从受精微滴中挑出，用脱卵针将颗粒细胞吹打掉，然后用CR1aa+3mg/mL BSA将受精卵洗涤3遍，转到预平衡4h的CR1aa+3mg/mL BSA微滴中，每滴15-20枚受精卵，置于38.5℃，5%CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，受精后48h检查卵裂率，将卵裂的受精卵从CR1aa微滴中挑出用含 CR1aa+10%FBS洗涤3遍，然后将洗涤完的卵裂的受精卵转到CR1aa+10%FBS微滴中，继续培养6d，统计囊胚率，每隔48h换半液。
实施例5：正辛醇在延缓牛卵子体外老化中的应用
从屠宰场取回牛卵巢约3个小时回到实验室，经过体外成熟培养24小时后，放入含1mM 1-octanol，10%胎牛血清的TCM-199培养液中老化培养6小时，12小时和24小时，然后分别进行孤雌激活和体外受精，进行体外培养，每48小时换半液，第8天统计囊胚率。
孤雌囊胚率，不添加1-octanol与添加1mM 1-octanol分别为：
6小时：41.2%、44.0%；12小时：23.3%、33.9%；24小时：8.6%、21.9%（见实验例表1）；
体外老化6小时卵子体外受精后的囊胚率，不添加1-octanol与添加1mM 1-octanol分别为：28.4%、35.7%（见实验例表2）。
实施例6：正辛醇在延缓牛卵子体外老化中的应用
除了加入的正辛醇的浓度为2mM，其余同实施例5。
孤雌囊胚率，不添加1-octanol与添加2mM 1-octanol分别为：
6小时：41.2%、43.4%；12小时：23.3%、32.8%；24小时：8.6%、19.8%？；
体外老化6小时卵子体外受精后的囊胚率，不添加1-octanol与添加2mM 1-octanol分别为：28.4%、34.9%。
实施例7：正辛醇在延缓牛卵子体外老化中的应用
除了加入的正辛醇的浓度为0.5mM，其余同实施例5。
孤雌囊胚率，不添加1-octanol与添加0.5mM 1-octanol分别为：
6小时：41.2%、42.2%；12小时：23.3%、26.3%；24小时：8.6%、10.8%；
体外老化6小时卵子体外受精后的囊胚率，不添加1-octanol与添加0.5mM 1-octanol分别为：28.4%、30.5%。
实施例8：正辛醇在延缓牛卵子体外老化中的应用
除了加入的正辛醇的浓度为0.1mM，胎牛血清浓度为5%，其余同实施例5。
孤雌囊胚率，不添加1-octanol与添加0.1mM 1-octanol分别为：
6小时：41.2%、42.4%；12小时：23.3%、24.6%；24小时：8.6%、8.9%；
体外老化6小时卵子体外受精后的囊胚率，不添加1-octanol与添加0.1mM 1-octanol分别为：28.4%、29.3%。
实施例9：正辛醇在延缓牛卵子体外老化中的应用
除了加入的正辛醇的浓度为4mM，胎牛血清浓度为20%，其余同实施例5。
孤雌囊胚率，不添加1-octanol与添加4mM 1-octanol分别为：
6小时：41.2%、39.1%；12小时：23.3%、18.2%；24小时：8.6%、5.4%；
体外老化6小时卵子体外受精后的囊胚率，不添加1-octanol与添加4mM 1-octanol分别为：28.4%、23.1%。
实验例1：正辛醇对体外不同老化时间牛COCs的孤雌发育的影响
将在体外成熟液中培养24h的COCs随机分为两个组，分别培养在TCM199+10%FBS与TCM199+10%FBS+1mM正辛醇（1-octanol）中老化培养（正辛醇组），分别于老化的0h、6h、12h和24h取一部分COCs，用0.1％透明质酸酶脱掉卵丘细胞，然后进行孤雌激活，进行体外培养。实验重复三次，对照组为：老化6h、12h和24h，正辛醇的浓度为0的相应的组别。
表1：1-octanol对牛体外老化COCs孤雌发育的影响
注：a,b,c,d相同栏内上标不同表示差异显著（p<0.05）。卵裂率和孵化囊胚率都是在卵子数的基础上计算的。
由上表可以看出：正辛醇对体外不同老化时间的牛卵子孤雌激活卵裂率没有显著性影响（P>0.05）。对于牛体外老化卵子孤雌激活囊胚率来说，体外老化6h的正辛醇组与对照组无显著性差异（P>0.05），并且与老化0h组也无显著性差异（P>0.05），但是随着老化时间的延长，体外老化12h与24h的正辛醇组显著高于对照组（P<0.05），但是均显著低于老化0h组（P<0.05）。
实验例2：正辛醇对体外不同老化时间牛COCs的体外受精胚胎发育的影响
将在体外成熟液中培养24h的COCs随机分为两个组，分别培养在TCM199+10%FBS与TCM199+10%FBS+1mM正辛醇（1-octanol）中老化培养（正辛醇组），分别于老化的0h、6h、12h和24h取一部分COCs进行体外受精，进行体外培养。实验重复三次，对照组为：老化6h、12h和24h，正辛醇的浓度为0的相应的组别。
表2：1-octanol对牛老化COCs体外受精胚胎发育的影响
注：a，b,c，d相同栏内上标不同表示差异显著（p<0.05）。卵裂率和孵化囊胚率都是在卵子数的基础上计算的。
由上表可以看出：对于体外老化6h、12h与24h的牛卵子体外受精率来说，正辛醇组与对照组无显著性差异（P>0.05），并且6h与12h的体外受精率与老化0h也无显著性差异（P>0.05），但体外老化24h的卵子体外受精率显著低于0h、6h、12h老化组（P<0.05）。对于体外老化6h、12h与24h的牛卵子体外受精囊胚率来说，老化6h的正辛醇组的囊胚率显著高于对照组（P<0.05），并且与老化0h组无显著性差异（P>0.05）。老化12h与24h的正辛醇组的囊胚率与对照组无显著性差异（P>0.05），并且均显著低于老化0h与6h组（P>0.05）。
实验例3：正辛醇对体外老化的牛裸卵孤雌发育的影响
实验结果见表3，体外老化12h的正辛醇组牛卵子孤雌激活卵裂率与对照组及老化0h组无显著性差异（P>0.05）。对于体外老化12h的牛卵子孤雌激活囊胚率来说，正辛醇组显著高于对照组（P<0.05），但是显著低于老化0h组（P<0.05）。其中，对照组指：培养液为TCM199+10%FBS+0mM正辛醇，并且体外老化12h的组别。
表3：正辛醇对体外老化牛裸卵孤雌发育的影响
注：a，b,c相同栏内上标不同表示差异显著（p<0.05）。卵裂率和囊胚率都是在卵子数的基础上计算的。
由上表可以看出：正辛醇能直接作用于卵子进而延缓其体外老化。
对比例1：正辛醇对体外老化牛卵子胞质内游离Ca2+水平的影响
将体外成熟24h的COCs，用0.1％透明质酸酶脱掉卵丘细胞，随机分为两个组，分别培养在TCM199+10%FBS+0mM正辛醇（对照组）与TCM199+10%FBS+1mM正辛醇中老化培养12h（正辛醇组），然后用10μmol/L Fluo-3/AM染色，分别观察分析其胞质内游离Ca2+水平。实验重复三次，结果如图1-1至图1-3所示，体外老化12h正辛醇组牛卵子胞质内游离Ca2+水平显著低于对照组（P<0.05）。
对比例2：PMA对体外老化牛卵子孤雌发育与胞质内游离Ca2+水平的影响
将在体外成熟液中培养24h的COCs，用0.1％透明质酸酶脱掉卵丘细胞，随机分为二个组分别培养在TCM199+10%FBS与TCM199+10%FBS+100nM PMA（佛波酯）中老化培养12h，然后一部分进行孤雌激活转到预平衡4h的CR1aa+3mg/mL BSA微滴中，每滴15-20枚，置于38.5℃，5%CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，另一部分进行胞质内游离Ca2+的检测。实验重复三次，结果如表4和图2-1至图2-3所示。对照组指：培养液为TCM199+10%FBS+0PMA，并且体外老化12h的组别，如图2-1。
表4：PMA对体外老化牛卵子孤雌发育的影响
注：a，b相同栏内上标不同表示差异显著（p<0.05）。卵裂率和囊胚率都是在卵子数的基础上计算的。
由上表可以看出：体外老化12h PMA组牛卵子孤雌激活卵裂率显著低于对照组（P<0.05），并且PMA组的孤雌激活囊胚率显著低于对照组（P<0.05）。
PMA对体外老化牛卵子胞质内游离Ca2+水平的影响见图2-1至图2-3，体外老化12h PMA组牛卵子胞质内游离Ca2+水平显著高于对照组（P<0.05）。
对比例3：BAPTA对体外老化牛卵子孤雌发育与胞质内游离Ca2+水平的影响
将体外成熟24h的COCs，用0.1％透明质酸酶脱掉卵丘细胞，随机分为二个组，分别培养在TCM199+10%FBS与TCM199+10%FBS+5μM BAPTA[乙烯基二氧双(邻次苯基氮基)四乙酸]中老化培养12h，然后一部分进行孤雌激活转到预平衡4h的CR1aa+3mg/mLBSA微滴中，每滴15-20枚，置于38.5℃，5%CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，另一部分进行胞质内游离Ca2+的检测。实验重复三次，结果如表5和图3-1至图3-3所示。对照组指：培养液为TCM199+10%FBS+0BAPTA，并且体外老化12h，如图3-1。
表5：BAPTA对体外老化牛卵子孤雌发育的影响
注：a，b相同栏内上标不同表示差异显著（p<0.05）。卵裂率和囊胚率都是在卵子数的基础上计算的。
由上表可以看出：体外老化12h BAPTA组牛卵子孤雌激活卵裂率 与对照组无显著性差异（P>0.05），但是BAPTA处理组的孤雌激活囊胚率显著高于对照组（P<0.05）。BAPTA对体外老化牛卵子胞质内游离Ca2+水平的影响见图3-1至图3-3，体外老化12h BAPTA组牛卵子胞质内游离Ca2+水平显著低于对照组（P<0.05）。
对比例4：培养液中Ca2+对体外老化牛卵子孤雌发育与胞质内游离Ca2+水平的影响
将体外成熟24h的COCs，用0.1％透明质酸酶脱掉卵丘细胞，随机分为三个组，分别培养在A[CR1aa（5mM Ca2+）+10%FBS+0mM正辛醇]、B[CR1aa（0mM Ca2+）+10%FBS+0mM正辛醇]与C[CR1aa（0mM Ca2+）+10%FBS+1mM正辛醇]中老化培养12h，然后一部分进行孤雌激活转到预平衡4h的CR1aa+3mg/mL BSA微滴中，每滴15-20枚，置于38.5℃，5%CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，另一部分进行胞质内游离Ca2+的检测。实验重复三次，结果如表6和图4-1至图4-4所示。对照组指：培养液为B[CR1aa（5mM Ca2+）+10%FBS+0mM正辛醇]，如图4-1。
表6：培养液中Ca2+对体外老化牛卵子孤雌发育的影响
注：a，b相同栏内上标不同表示差异显著（p<0.05）。卵裂率和囊胚率都是在卵子数的基础上计算的。
由上表可以看出：体外老化12h的各组牛卵子孤雌激活卵裂率无显著性差异（P>0.05），但是无钙的1-octanol组与无钙组孤雌激活囊胚 率显著高于对照组（5mM Ca2+）（P<0.05）。培养液中Ca2+对体外老化牛卵子胞质内游离Ca2+水平的影响见图4-1至图4-4，体外老化12h无钙的1-octanol组与无钙组牛卵子胞质内游离Ca2+水平显著低于对照组（5mM Ca2+）（P<0.05），但是无钙的1-octanol组与无钙组之间无显著性差异（P>0.05）。
由以上实验例和对比例可以得出：正辛醇通过抑制培养液中的Ca2+内流进而抑制牛体外老化卵子胞质内游离Ca2+水平的升高，从而延缓其体外老化。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述正辛醇的浓度为：0.1~4mM。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述正辛醇的浓度为：0.5~2mM。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述正辛醇的浓度为：1mM。
5.根据权利要求1~4任意一项所述的应用，其特征在于，所述正辛醇在哺乳动物卵母细胞体外成熟培养后，开始出现老化，继续进行体外培养的阶段中加入。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物卵母细胞体外成熟培养24h后，开始出现老化。
7.根据权利要求1~5任意一项所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物为牛，羊，猪或鼠。
8.根据权利要求5~7任意一项所述的应用，其特征在于，继续进行体外培养的阶段，所述正辛醇添加在含有胎牛血清的培养液中。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述胎牛血清的浓度为：5%~20%。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述胎牛血清的浓度为：10%。
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