CN109628384A - 一种卵子冲洗液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种卵子冲洗液，其配方包括肝素钠1.5～3.5IU/mL，碳酸氢钠1～6mM/L、HEPES 10～26.5mM/L，无机盐氯化钠92.5～101.5mM/L、氯化钾4.45～4.95mM/L、二水氯化钙1.90～2.20mM/L、磷酸二氢钾0.30～0.44mM/L和七水硫酸镁0.15～0.20mM/L，硫酸庆大霉素0.01～0.05g/L，葡萄糖2.60～2.88mM/L，丙酮酸钠0.31～0.35mM/L，L‑乳酸钠10.5～10.9mM/L，人血清白蛋白5～10g/L。

Description

一种卵子冲洗液及其制备方法
技术领域
本发明属于人类辅助生殖领域，具体涉及一种卵子冲洗液以及制备所述卵子冲洗液的方法。
背景技术
人类辅助生殖领域中，卵子冲洗液作为一种体外缓冲液，用于从人卵泡中吸取卵子，冲洗和处理卵子等，以保持卵子在体外或培养箱外的活性。在临床中，无论是第一代技术试管婴儿(IVF-ET)还是第二代技术单精子胞浆注射(ICSI)，卵子冲洗液都是不可或缺的试剂。高效稳定的卵子冲洗液对获得足够数量可用卵子，保证试管婴儿周期顺利进行具有重要意义。
HEPES是一种两性离子缓冲剂，是目前为止在临床和生物学研究中可用的最佳通用缓冲器之一。其缓冲能力在pH 6.8到8.2之间有效。HEPES在pH缓冲及细胞培养领域中已经被广泛应用，包括组织培养。碳酸氢钠水溶液因水解而呈微碱性，在培养液中形成碳酸盐/碳酸氢盐缓冲体系。
肝素是由两种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用，临床上主要用于抗凝血、血栓性疾病、心血管手术、体外循环、血液透析等。在卵子收集过程中，取卵针刺破卵泡可能造成出血而产生血凝块。在卵子冲洗液中加入适量肝素可有效避免血凝块产生，以防止取卵针堵塞或给卵子拾取造成影响。
在卵子冲洗液中通过优化碳酸氢钠及HEPES的配比，能有效维持pH值，以保证卵子在体外或在培养箱外短暂操作时的环境稳定。同时，添加肝素钠能有效防止取卵时血凝块的产生，避免了取卵针的堵塞或拾取卵子时血凝块的干扰，使取卵过程更高效快捷，进而降低对卵子的损伤。
发明内容
本发明的目的是提供一种保持卵子在体外活性的卵子冲洗液，不仅能在培养箱外有效地维持pH值，也能减少取卵过程中血凝块的产生，为高效地取卵提供便利，从而尽可能地降低对卵子的损伤。
为实现上述目的，本发明的提供技术方案为：
一种卵子冲洗液，其以肝素钠为抗凝成分、以碳酸氢钠和HEPES为pH缓冲体系添加到含抗菌剂和酸碱指示剂及蛋白的基础盐溶液。
进一步地，所述的抗凝成分肝素钠含量为1.5～3.5IU/mL，pH缓冲体系中碳酸氢钠含量为1～6mM/L，HEPES含量为10～26.5mM/L。
更进一步地，所述基础盐溶液配方为无机盐氯化钠92.5～101.5mM/L、氯化钾4.45～4.95mM/L、二水氯化钙1.90～2.20mM/L、磷酸二氢钾0.30～0.44mM/L和七水硫酸镁0.15～0.20mM/L，硫酸庆大霉素0.01～0.05g/L，葡萄糖2.60～2.88mM/L，丙酮酸钠0.31～0.35mM/L，L-乳酸钠10.5～10.9mM/L，人血清白蛋白5～10g/L。
再进一步地，所述配方还包括pH指示剂酚红0.005～0.01g/L。
本发明的另一个目的是提供所述的卵子冲洗液在人类辅助生殖过程中卵子冲取中的应用。
本发明的再一个目的是提供一种制备卵子冲洗液的方法，将抗凝成分肝素钠和pH缓冲剂HEPES溶解于含抗菌剂和酸碱指示剂的基础盐溶液中配制而成。
进一步地，所述方法包括以下步骤：
a、按本发明所述配方称量所有固体成分并分开放置；
b、按先固体后液体，将除硫酸庆大霉素、酚红、碳酸氢钠和人血清白蛋白外的所有成分加入并溶解于超纯水中；
c、向步骤b获得的溶液加入硫酸庆大霉素及酚红，最后加入碳酸氢钠并溶解得基础液；
e、测量并调节上述基础液pH值在7.3±0.1，渗透压在260～290mOsm/kg；
f、将基础液经0.22μm过滤器过滤，按比例加入人血清白蛋白并分装、封口，2～8℃保存。
本发明所述的卵子冲洗液相对普通卵子冲洗液，不仅能在培养箱外有效地维持pH值，也能减少取卵过程中血凝块的产生，为高效地取卵提供便利，从而尽可能地降低对卵子的损伤。
附图说明
图1是显微镜下实验组中配方3的囊胚发育情况。
图2是显微镜下对照组1中囊胚发育情况。
图3是显微镜下照组2囊胚发育情况。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步对本发明进行说明，不能理解为是对本发明的限制，实施例中使用的材料、试剂，仪器设备如无特殊说明，均可从商业途径得到。
【实施例1】卵子冲洗液配方及制备方法：
A、卵子冲洗液配方：
B、配制方法：
a、按配方称取所有固体成分并分开放置；
b、按先固体后液体，碳酸氢钠最后加的原则，将除硫酸庆大霉素、酚红、碳酸氢钠和人血清白蛋白外的所有成分加入并溶解于超纯水中；
c、向步骤b中的溶液加入硫酸庆大霉素及酚红，最后加入碳酸氢钠并溶解得基础液；
d、测量并调节上述基础液pH值在7.3±0.1，渗透压在260～290mOsm/kg，并作好记录；
e、隔离器内用将基础液经0.22μm过滤器过滤，按比例加入人血清白蛋白并在隔离工作台内分装、封口，2～8℃保存。
【实施例2】卵子冲洗液的检测
1、pH值检测
取适量待测样品用pH计测量三次，取所得三个数据的平均值为结果，在7.3±0.1视为合格。
2、渗透压检测
渗透压仪校正后，取500μl待测样品到测试管中开始测试，当数值稳定后读出数据，按以上方法测出3个数据，取平均值为结果，在260～290mOsm/kg视为合格。
3、细菌内毒素检测
根据中华人民共和国药典2015版要求，用鲎试剂凝胶法进行检测，结果≤0.1EU/ml视为合格。
4、细胞毒性
按GB/T 16886.5的规定进行检测，细胞毒性分数不应超过1分。
5、致敏检测
按GB/T 16886.10的规定进行检测，应无致敏反应。
6、无菌试验
根据中华人民共和国药典2015版要要求，运用薄膜过滤法，待测样品经滤膜过滤后直接接种培养基培养14天，每天观察结果，应无菌。
7、皮内刺激
按GB/T 16886.10的规定进行检测，应无皮内刺激反应。
8、热原
根据中华人民共和国药典2015版要求，应无热原反应。
9、小鼠胚胎体外培养试验
(1)小鼠超数排卵
选取4～6周龄B6D2品系小鼠10IU/只注射PMSG，48h后10IU/只注射hCG，注射完hCG后即与同品系具有交配能力的雄鼠交配。
(2)准备胚胎体外培养皿
取无菌35mm皿，用待测样品做数滴50μl液滴作为测试组培养滴，用含70IU/ml内毒素的M16培养液做数滴50μl液滴作为阳性对照组，用普通M16培养液做数滴50μl液滴作为阴性对照组，表面覆盖培养用矿物油，放5％CO2，5％O2，90％N2，饱和湿度的培养箱中过夜平衡。
(3)受精卵收集
合笼后第二天早上检栓，见栓母鼠选取后处死，取其输卵管放于预热至37℃M2操作液中，将输卵管壶腹部膨大处刺破，收集絮状受精卵团至37℃透明质酸酶滴中消化颗粒细胞，待颗粒细胞完全脱落后将受精卵转移到37℃M2中清洗数次，挑取受精胚胎待用。
(4)测试组胚胎处理
上述胚胎随机平均分三组(测试组，阴性对照组，阳性对照组)，每组不少于50枚。测试组中胚胎在预热至37℃的供试卵子冲洗液孵育20分钟，再转移到经平衡的M16液滴中清洗数次。
(5)胚胎培养
将三组胚胎分别转移到经平衡后的M16培养液滴中，培养皿放于5％CO2，5％O2，90％N2，饱和湿度的培养箱中培养96h.
(6)测试结果
培养96h后记录各组囊胚数
可接受标准：a、阳性对照组囊胚数统计学上显著低于阴性对照组囊胚数
b、阴性对照组囊胚数≥80％
根据以上操作步骤，各配方的卵子冲洗液的检测如下表1所示：
表1各配方的检测结果
检测项目 配方1 配方2 配方3 配方4 配方5
pH值 7.33 7.30 7.31 7.3 7.36
渗透压mOsm/kg 277 273 269 267 272
内毒素 合格 合格 合格 合格 合格
细胞毒素 合格 合格 合格 合格 合格
致敏检测 无致敏反应 无致敏反应 无致敏反应 无致敏反应 无致敏反应
无菌测试 无菌 无菌 无菌 无菌 无菌
皮内刺激 无皮内刺激 无皮内刺激 无皮内刺激 无皮内刺激 无皮内刺激
热原检测 无热原 无热原 无热原 无热原 无热原
鼠胚体外培养测试 92.23％ 93.65％ 95.54％ 95.23％ 92.38％
【实施例3】卵子冲洗液的牛胚胎实验
牛卵巢及卵子采集
卵巢采自屠宰场，用含有双抗的20-25℃生理盐水在3小时内送回实验室。卵巢用预热至37℃的生理盐水冲洗数次。将卵巢平均分为三部分，分别在三种不同的卵子冲洗液中收集卵子，第一种为本专利实施例1中所述卵子冲洗液，作为实验组；第二种为常用牛取卵液ASP(M-199+HEPES+L-Glu+肝素+2％胎牛血清)，作为对照1；第三种为普通市售商业人卵子冲洗液，作为对照2。方法为将卵巢置于90mm培养皿内，用11号刀片刺破卵泡，使卵泡液及卵子卵丘复合物释放到上述各液体中。收集到的卵子卵丘复合物在冲洗液中清洗数次备用。
卵母细胞成熟
上述卵子卵丘复合物在38.5℃、5％CO2和饱和湿度条件下培养箱中分别培养20～24h(成熟培养液：TCM199+15％FBS+PMSG+hCG+L-Glu)。
卵母细胞孤雌激活
牛卵母细胞成熟培养24h后，COC置0.1％透明质酸酶的T2液中，漩涡振荡3min，去除卵丘细胞。挑选排出第一极体且形态正常、胞质均一的卵母细胞用于激活。激活方法：5mmol/L ionomycin(离子霉素，Sigma)TCM199液处理5min，洗涤后置2mmol/L6-DMAP(6-二甲氨基嘌呤，Sigma)TCM199液，CO2箱培养4h，移入SOFaa培养液分别培养7天后观察结果。
观察和记录实验中卵子成熟和胚胎发育情况
用体视显微镜观察，结果表明，实验组(本专利实施例1中所述卵子冲洗液)成熟率及囊胚率均与ASP无明显差异，与市售一种常用商业人卵子冲洗液相比成熟率与囊胚率差异显著。具体如下表2所示。
表2卵子成熟及胚胎发育对比

Claims (10)

1.一种卵子冲洗液，包括抗凝成分肝素钠，含碳酸氢钠和HEPES的pH缓冲体系，含抗菌剂、酸碱指示剂及蛋白的基础盐溶液。
2.根据权利要求1所述的卵子冲洗液，其特征在于，所述的抗凝成分肝素钠含量为1.5～3.5IU/mL，pH缓冲体系中碳酸氢钠含量为1～6mM/L、HEPES含量为10～26.5mM/L。
3.根据权利要求2所述的卵子冲洗液，其特征在于，所述基础盐溶液配方为无机盐氯化钠92.5～101.5mM/L、氯化钾4.45～4.95mM/L、二水氯化钙1.90～2.20mM/L、磷酸二氢钾0.30～0.44mM/L和七水硫酸镁0.15～0.20mM/L，硫酸庆大霉素0.01～0.05g/L，葡萄糖2.60～2.88mM/L，丙酮酸钠0.31～0.35mM/L，L-乳酸钠10.5～10.9mM/L，人血清白蛋白5～10g/L。
4.根据权利要求3所述的卵子冲洗液，其特征在于，所述卵子冲洗液配方为氯化钠101.5mM/L、氯化钾4.69mM/L、二水氯化钙2.04mM/L、磷酸二氢钾0.37mM/L，七水硫酸镁0.2mM/L，碳酸氢钠5mM/L，HEPES 25mM/L，硫酸庆大霉素0.01g/L，丙酮酸钠0.33mM/L、L-乳酸钠10.7mM/L、葡萄糖2.78mM/L，人血清蛋白5g/L，肝素钠2.5IU/mL。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的卵子冲洗液，其特征在于，所述卵子冲洗液配方还包括酚红0.005～0.01g/L。
6.权利要求1所述的卵子冲洗液在人类试管婴儿技术中卵子冲取的应用。
7.一种制备卵子冲洗液的方法，其特征在于：将肝素钠和pH缓冲剂碳酸氢钠、HEPES溶解于含抗菌剂和酸碱指示剂及蛋白的基础盐溶液中配制而成。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a、按权利要求3所述配方称量所有固体成分并分开放置；
b、按先固体后液体，将除硫酸庆大霉素、酚红、碳酸氢钠和人血清白蛋白外的所有成分加入并溶解于超纯水中；
c、向步骤b获得的溶液加入硫酸庆大霉素及酚红，最后加入碳酸氢钠并溶解得基础液；
d、测量并调节上述基础液pH值在7.3±0.1，渗透压在260～290mOsm/kg；
e、将基础液经0.22μm过滤器过滤，按比例加入人血清白蛋白并分装、封口，2～8℃保存。
9.一种由权利要求8所述方法配制而成的卵子冲洗液。
10.如权利要求8所述方法配制而成的卵子冲洗液在人类试管婴儿技术中卵子的冲取应用。
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