CN110846272B - 一种卵母细胞培养液及提高卵母细胞质量的体外培养方法 - Google Patents

一种卵母细胞培养液及提高卵母细胞质量的体外培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110846272B
CN110846272B CN201911231323.0A CN201911231323A CN110846272B CN 110846272 B CN110846272 B CN 110846272B CN 201911231323 A CN201911231323 A CN 201911231323A CN 110846272 B CN110846272 B CN 110846272B
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
oocyte
fluid
follicular fluid
mature
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911231323.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110846272A (zh
Inventor
蔡更元
吴珍芳
李紫聪
招华兴
张宁
郑恩琴
顾婷
杨化强
洪林君
杨杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Agricultural University
Original Assignee
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Agricultural University filed Critical South China Agricultural University
Priority to CN201911231323.0A priority Critical patent/CN110846272B/zh
Publication of CN110846272A publication Critical patent/CN110846272A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110846272B publication Critical patent/CN110846272B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/0609—Oocytes, oogonia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/31—Pituitary sex hormones, e.g. follicle-stimulating hormone [FSH], luteinising hormone [LH]; Chorionic gonadotropins

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种卵母细胞培养液，该培养液中含有成熟的卵泡液。成熟的卵泡液相对于未成熟的卵泡液，成熟的卵泡液对卵母细胞体外成熟有积极作用的物质丰度更高，离成熟期越近的卵泡，它的卵泡液越能促进卵母细胞IVM，并改善其质量。使用体内成熟卵泡液作为卵母细胞体外成熟培养液的组分能有效提高卵母细胞的质量，并且能降低卵母细胞中的ROS含量。由此。不仅可以用来改善各种物种(如：牛、羊等)的卵母细胞体外成熟，提高制备优质的体外受精胚胎及克隆胚胎的生产率，还可供人类辅助生殖中卵母细胞体外培养成熟的运用提供参考，以改进现有的卵母细胞体外成熟的培养体系，从而促进生物医学的发展。

Description

一种卵母细胞培养液及提高卵母细胞质量的体外培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种卵母细胞培养液及提高卵母细胞质量的体外培养方法。
背景技术
猪体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)技术，在农业、生物医学、生命科学等领域有着十分重要的应用价值。在农业生产上，使用来自活体动物的体细胞作为体细胞核移植的供体细胞，可产生大量具有相同遗传信息的后代，这对保护遗传资源并改善育种生产有着积极作用。同时，转基因(TG)克隆猪在生物医学研究中有着广泛的应用前景。如：TG克隆猪已在异种移植用于产生器官移植物，作为人疾病模型来研究病因和治疗，并且作为生物反应器，以产生具有医疗应用价值的蛋白质。然而，尽管SCNT技术的应用广泛，但当前SCNT的效率相当低。在猪SCNT中，移植到代孕母猪体内的重构胚胎，仅有1％-5％能发育至出生。不仅如此，许多出生后的克隆仔猪表现异常，这导致克隆效率更加低下。究其原因，研究者普遍认为，是SCNT胚胎容易发生错误或不完全重编程造成的。一方面，是因为克隆胚胎核供体细胞的起始表观遗传修饰状态与配子的不同，使得基因异常表，X染色体异常失活。另一方面，卵母细胞质量是影响SCNT胚胎发育能力的重要因素。
发明内容
本公开提供了一种卵母细胞体外培养液及培养方式，来提高卵母细胞体外培养的质量。
根据本公开的一个方面，提供了卵母细胞培养液，该培养液中含有成熟的卵泡液。成熟的卵泡液相对于未成熟的卵泡液，成熟的卵泡液对卵母细胞体外成熟(In vitromaturation,IVM)有积极作用的物质丰度更高，离成熟期越近的卵泡，它的卵泡液越能促进卵母细胞IVM，并改善其质量。且该成熟的卵泡液是来源于体内成熟的卵泡，并是从新鲜卵巢取出的，其卵泡液中营养物质更加丰富，更有利与卵母细胞在体外成熟的培养。
在某些实施方式中，培养液含有体积分数为5-20％的成熟卵泡液。成熟卵泡液浓度并不是越高越好，太高了的卵泡液对于卵母细胞的体外成熟和质量的提升效率不明显，也会减少成熟卵泡液的使用率，因此5-20％浓度的成熟卵泡液对于卵母细胞体外成熟是合适的。
在某些实施方式中，培养液含有体积分数为5％的成熟卵泡液。由此，5％浓度下的成熟卵泡液相较于5％浓度下的未成熟卵泡液，其卵裂率提高了28.85％，囊胚率提高了73.11％，囊胚细胞数提高了13.32％；且培养自24h时，可降低49.38％的活性氧含量；培养自44h时，可降低30.27％的活性氧含量。
在某些实施方式中，培养液含有体积分数为10％的成熟卵泡液。由此，10％浓度下的成熟卵泡液相较于10％浓度下的未成熟卵泡液，卵裂率提高了29.37％，囊胚率提高了84.36％，囊胚细胞数提高了17.11％；且培养自24h时，可降低53.74％的活性氧含量；培养自44h时，可降低34.94％的活性氧含量。
在某些实施方式中，培养液含有体积分数为15％的成熟卵泡液。由此，15％浓度下的成熟卵泡液相较于15％浓度下的未成熟卵泡液，卵裂率提高了28.27％，囊胚率提高了81.55％，囊胚细胞数提高了16.34％；且培养自24h时，可降低48.12％的活性氧含量；培养自44h时，可降低30.21％的活性氧含量。
在某些实施方式中，培养液含有体积分数为20％的成熟卵泡液。由此，20％浓度下的成熟卵泡液相较于20％浓度下的未成熟卵泡液，卵裂率提高了27.99％，囊胚率提高了78.68％，囊胚细胞数提高了16.34％；且培养自24h时，可降低48.05％的活性氧含量；培养自44h时，可降低31.20％的活性氧含量。
在某些实施方式中，培养液包括0.3～0.9mM半胱氨酸、0.05～0.2IU/ml人绒毛膜促性腺激素、0.05～0.2IU/ml孕马血清促性腺激素、体积分数5-20％胎牛血清、体积分数5-20％成熟卵泡液和基础培养基。
在某些实施方式中，培养液包括0.6mM半胱氨酸、0.1IU/ml人绒毛膜促性腺激素、0.1IU/ml孕马血清促性腺激素、体积分数10％胎牛血清、体积分数10％成熟卵泡液和基础培养基。由此，体积分数10％成熟卵泡液相较于体积分数10％未成熟卵泡液，卵裂率提高了29.37％，囊胚率提高了84.36％，囊胚细胞数提高了17.11％；且培养自24h时，可降低53.74％的活性氧含量；培养自44h时，可降低34.94％的活性氧含量。
在某些实施方式中，培养液包括0.3mM半胱氨酸、0.05IU/ml人绒毛膜促性腺激素、0.05IU/ml孕马血清促性腺激素、体积分数5％胎牛血清、体积分数5％成熟卵泡液和基础培养基。由此，体积分数5％成熟卵泡液相较于体积分数5％未成熟卵泡液，卵裂率提高了24.41％，囊胚率提高了72.27％，囊胚细胞数提高了15.96％；且培养自24h时，可降低49.12％的活性氧含量；培养自44h时，可降低32.12％的活性氧含量。
在某些实施方式中，培养液包括0.9mM半胱氨酸、0.2IU/ml人绒毛膜促性腺激素、0.2IU/ml孕马血清促性腺激素、体积分数10％胎牛血清、体积分数10％成熟卵泡液和基础培养基。由此，体积分数10％成熟卵泡液相较于体积分数10％未成熟卵泡液，卵裂率提高了18.15％，囊胚率提高了75.13％，囊胚细胞数提高了16.61％；且培养自24h时，可降低50.14％的活性氧含量；培养自44h时，可降低33.12％的活性氧含量。
根据本公开的另一个方面，提供了一种提高卵母细胞质量的体外培养方法，该方法是将卵母细胞置于上述的培养液中，并置于38.5℃培养箱中培养44小时后，取出备用。
本公开的有益效果：
使用体内成熟卵泡液作为卵母细胞体外成熟培养液的组分能有效提高卵母细胞的质量，并且能降低卵母细胞中的ROS含量。通过本发明，不仅可以用来改善各种物种(如：牛、羊等)的卵母细胞体外成熟，提高制备优质的体外受精胚胎及克隆胚胎的生产率，还可供人类辅助生殖中卵母细胞体外培养成熟的运用提供参考，以改进现有的卵母细胞体外成熟的培养体系，从而促进生物医学的发展。
附图说明
图1为两种不同来源的卵巢，左侧为体内成熟的卵巢，箭头标注为排卵点；右侧为未成熟的卵巢。
图2，A为两种培养液培养的卵母细胞在24h、44h检测ROS含量的荧光图片；B为Image-Pro Plus软件计算荧光强度的相对比值。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
本公开实施例中的试剂除特殊说明，均来源于市售。
实施例一：
1、体内成熟卵泡液和未成熟卵泡液的处理。
猪体内成熟卵泡液(MFF)的处理：选取断奶第6天的经产母猪数头，采取卵巢，观察是否有排卵点，有排卵点的卵巢即表明其中的卵泡为成熟卵泡。然后将该卵巢用DPBS冲洗3次后，用带18号针头的10mL注射器抽出其中的卵泡液，室温下静置10min后，3000rpm/min离心15min，收集上清液，经过0.22μm针头滤器过滤后，分装在1.8mL冻存管中，液氮淬灭速冻，-80℃冰箱保存备用。
猪未成熟卵泡液(IFF)的处理：从屠宰场购买来的猪卵巢，选取卵泡直径大于8mm的卵泡，用带18号针头的10mL注射器抽出其中的卵泡液，室温下静置10min后，3000rpm/min离心15min，收集上清液，经过0.22μm针头滤器过滤后，分装在1.8mL冻存管中，液氮淬灭速冻，-80℃冰箱保存备用。
两种不同来源的卵泡见附图1。
2、配制猪卵母细胞体外成熟培养液及卵母细胞的体外成熟培养。
10％IFF培养液：卵母细胞体外成熟培养液的配制方法：在TCM-199培养基中补充0.6mM半胱氨酸，0.1IU/ml人绒毛膜促性腺激素和0.1IU/ml孕马血清促性腺激素，10％(V/V)胎牛血清，10％(V/V)未成熟猪卵泡液。
10％MFF培养液：卵母细胞体外成熟培养液的配制方法：在TCM-199培养基中补充0.6mM半胱氨酸，0.1IU/ml人绒毛膜促性腺激素和0.1IU/ml孕马血清促性腺激素，10％(V/V)胎牛血清，10％(V/V)成熟猪卵泡液。
从3mm-8mm的卵泡中抽出卵母细胞，挑选胞质均匀，并具有三层以上卵丘细胞的卵丘细胞-卵母细胞复合体，分别置于放有10％IFF、10％MFF培养液的四孔板中，然后转移至38.5℃培养箱中培养。44h后，使用透明质酸酶处理卵丘细胞-卵母细胞复合体，弃去卵丘细胞，挑选出具有极体，且胞质均匀、形状正常的卵母细胞备用。
3、猪克隆胚胎的构建及胚胎体外培养。
在10cm细胞培养皿中培养一板杜洛克公猪F6代成体成纤维细胞(在细胞板中约长满80～90％)作为克隆胚胎的供体细胞，将上述培养成熟的两种卵母细胞作为克隆胚胎的受体细胞，构建猪克隆胚胎，并转移至PZM培养液中。经过48h小时、168h培养后，10％MFF成熟卵泡液培养的卵母细胞制备的克隆胚胎相较对照组10％IFF，卵裂率提高了29.37％，囊胚率提高了84.36％，囊胚细胞数提高了17.11％，详细结果见下表：
Figure BDA0002303623420000041
4、猪卵母细胞活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)检测。
将两种培养液中培养成熟的卵母细胞培养24h、44h后，各取20枚，使用ROS检测试剂盒(购自上海翊圣生物科技有限公司)对卵母细胞内活性氧含量进行检测，并使用Image-Pro Plus软件对其荧光强度进行计算，与先前相比，10％MFF培养液得到的卵母细胞，培养自24h时，可降低53.74％的活性氧含量；培养自44h时，可降低34.94％的活性氧含量，结果见图2。
实施例二
1、体内成熟卵泡液和未成熟卵泡液的处理。
猪体内成熟卵泡液(MFF)的处理：选取断奶第6天的经产母猪数头，采取卵巢，观察是否有排卵点，有排卵点的卵巢即表明其中的卵泡为成熟卵泡。然后将该卵巢用DPBS冲洗3次后，用带18号针头的10mL注射器抽出其中的卵泡液，室温下静置10min后，3000rpm/min离心15min，收集上清液，经过0.22μm针头滤器过滤后，分装在1.8mL冻存管中，液氮淬灭速冻，-80℃冰箱保存备用。
猪未成熟卵泡液(IFF)的处理：从屠宰场购买来的猪卵巢，选取卵泡直径大于8mm的卵泡，用带18号针头的10mL注射器抽出其中的卵泡液，室温下静置10min后，3000rpm/min离心15min，收集上清液，经过0.22μm针头滤器过滤后，分装在1.8mL冻存管中，液氮淬灭速冻，-80℃冰箱保存备用。
2、配制猪卵母细胞体外成熟培养液及卵母细胞的体外成熟培养。
5％IFF培养液：卵母细胞体外成熟培养液的配制方法：在TCM-199培养基中补充0.6mM半胱氨酸，0.1IU/ml人绒毛膜促性腺激素和0.1IU/ml孕马血清促性腺激素，10％(V/V)胎牛血清，5％(V/V)未成熟猪卵泡液。
5％MFF培养液：卵母细胞体外成熟培养液的配制方法：在TCM-199培养基中补充0.6mM半胱氨酸，0.1IU/ml人绒毛膜促性腺激素和0.1IU/ml孕马血清促性腺激素，10％(V/V)胎牛血清，5％(V/V)成熟猪卵泡液。
从3mm-8mm的卵泡中抽出卵母细胞，挑选胞质均匀，并具有三层以上卵丘细胞的卵丘细胞-卵母细胞复合体，分别置于放有5％IFF、5％MFF培养液的四孔板中，然后转移至38.5℃培养箱中培养。44h后，使用透明质酸酶处理卵丘细胞-卵母细胞复合体，弃去卵丘细胞，挑选出具有极体，且胞质均匀、形状正常的卵母细胞备用。
3、猪克隆胚胎的构建及胚胎体外培养。
在10cm细胞培养皿中培养一板杜洛克公猪F6代成体成纤维细胞(在细胞板中约长满80～90％)作为克隆胚胎的供体细胞，将上述培养成熟的两种卵母细胞作为克隆胚胎的受体细胞，构建猪克隆胚胎，并转移至PZM培养液中。经过48h小时、168h培养后，5％MFF成熟卵泡液培养的卵母细胞制备的克隆胚胎相较对照组5％IFF，卵裂率提高了28.85％，囊胚率提高了73.11％，囊胚细胞数提高了13.32％，详细结果见下表：
Figure BDA0002303623420000061
4、猪卵母细胞活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)检测。
将两种培养液中培养成熟的卵母细胞培养24h、44h后，各取20枚，使用ROS检测试剂盒(购自上海翊圣生物科技有限公司)对卵母细胞内活性氧含量进行检测，并使用Image-Pro Plus软件对其荧光强度进行计算，与先前相比，5％MFF培养液得到的卵母细胞，培养自24h时，可降低49.38％的活性氧含量；培养自44h时，可降低30.27％的活性氧含量。
实施例三
1、体内成熟卵泡液和未成熟卵泡液的处理。
猪体内成熟卵泡液(MFF)的处理：选取断奶第6天的经产母猪数头，采取卵巢，观察是否有排卵点，有排卵点的卵巢即表明其中的卵泡为成熟卵泡。然后将该卵巢用DPBS冲洗3次后，用带18号针头的10mL注射器抽出其中的卵泡液，室温下静置10min后，3000rpm/min离心15min，收集上清液，经过0.22μm针头滤器过滤后，分装在1.8mL冻存管中，液氮淬灭速冻，-80℃冰箱保存备用。
猪未成熟卵泡液(IFF)的处理：从屠宰场购买来的猪卵巢，选取卵泡直径大于8mm的卵泡，用带18号针头的10mL注射器抽出其中的卵泡液，室温下静置10min后，3000rpm/min离心15min，收集上清液，经过0.22μm针头滤器过滤后，分装在1.8mL冻存管中，液氮淬灭速冻，-80℃冰箱保存备用。
2、配制猪卵母细胞体外成熟培养液及卵母细胞的体外成熟培养。
15％IFF培养液：卵母细胞体外成熟培养液的配制方法：在TCM-199培养基中补充0.6mM半胱氨酸，0.1IU/ml人绒毛膜促性腺激素和0.1IU/ml孕马血清促性腺激素，10％(V/V)胎牛血清，15％(V/V)未成熟猪卵泡液。
15％MFF培养液：卵母细胞体外成熟培养液的配制方法：在TCM-199培养基中补充0.6mM半胱氨酸，0.1IU/ml人绒毛膜促性腺激素和0.1IU/ml孕马血清促性腺激素，10％(V/V)胎牛血清，15％(V/V)成熟猪卵泡液。
从3mm-8mm的卵泡中抽出卵母细胞，挑选胞质均匀，并具有三层以上卵丘细胞的卵丘细胞-卵母细胞复合体，分别置于放有15％IFF、15％MFF培养液的四孔板中，然后转移至38.5℃培养箱中培养。44h后，使用透明质酸酶处理卵丘细胞-卵母细胞复合体，弃去卵丘细胞，挑选出具有极体，且胞质均匀、形状正常的卵母细胞备用。
3、猪克隆胚胎的构建及胚胎体外培养。
在10cm细胞培养皿中培养一板杜洛克公猪F6代成体成纤维细胞(在细胞板中约长满80～90％)作为克隆胚胎的供体细胞，将上述培养成熟的两种卵母细胞作为克隆胚胎的受体细胞，构建猪克隆胚胎，并转移至PZM培养液中。经过48h小时、168h培养后，15％MFF成熟卵泡液培养的卵母细胞制备的克隆胚胎相较对照组15％IFF，卵裂率提高了28.27％，囊胚率提高了81.55％，囊胚细胞数提高了16.34％，详细结果见下表：
Figure BDA0002303623420000071
4、猪卵母细胞活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)检测。
将两种培养液中培养成熟的卵母细胞培养24h、44h后，各取20枚，使用ROS检测试剂盒(购自上海翊圣生物科技有限公司)对卵母细胞内活性氧含量进行检测，并使用Image-Pro Plus软件对其荧光强度进行计算，与先前相比，15％MFF培养液得到的卵母细胞，培养自24h时，可降低48.12％的活性氧含量；培养自44h时，可降低30.21％的活性氧含量。
实施例四
1、体内成熟卵泡液和未成熟卵泡液的处理。
猪体内成熟卵泡液(MFF)的处理：选取断奶第6天的经产母猪数头，采取卵巢，观察是否有排卵点，有排卵点的卵巢即表明其中的卵泡为成熟卵泡。然后将该卵巢用DPBS冲洗3次后，用带18号针头的10mL注射器抽出其中的卵泡液，室温下静置10min后，3000rpm/min离心15min，收集上清液，经过0.22μm针头滤器过滤后，分装在1.8mL冻存管中，液氮淬灭速冻，-80℃冰箱保存备用。
猪未成熟卵泡液(IFF)的处理：从屠宰场购买来的猪卵巢，选取卵泡直径大于8mm的卵泡，用带18号针头的10mL注射器抽出其中的卵泡液，室温下静置10min后，3000rpm/min离心15min，收集上清液，经过0.22μm针头滤器过滤后，分装在1.8mL冻存管中，液氮淬灭速冻，-80℃冰箱保存备用。
2、配制猪卵母细胞体外成熟培养液及卵母细胞的体外成熟培养。
20％IFF培养液：卵母细胞体外成熟培养液的配制方法：在TCM-199培养基中补充0.6mM半胱氨酸，0.1IU/ml人绒毛膜促性腺激素和0.1IU/ml孕马血清促性腺激素，10％(V/V)胎牛血清，20％(V/V)未成熟猪卵泡液。
20％MFF培养液：卵母细胞体外成熟培养液的配制方法：在TCM-199培养基中补充0.6mM半胱氨酸，0.1IU/ml人绒毛膜促性腺激素和0.1IU/ml孕马血清促性腺激素，10％(V/V)胎牛血清，20％(V/V)成熟猪卵泡液。
从3mm-8mm的卵泡中抽出卵母细胞，挑选胞质均匀，并具有三层以上卵丘细胞的卵丘细胞-卵母细胞复合体，分别置于放有20％IFF、20％MFF培养液的四孔板中，然后转移至38.5℃培养箱中培养。44h后，使用透明质酸酶处理卵丘细胞-卵母细胞复合体，弃去卵丘细胞，挑选出具有极体，且胞质均匀、形状正常的卵母细胞备用。
3、猪克隆胚胎的构建及胚胎体外培养。
在10cm细胞培养皿中培养一板杜洛克公猪F6代成体成纤维细胞(在细胞板中约长满80～90％)作为克隆胚胎的供体细胞，将上述培养成熟的两种卵母细胞作为克隆胚胎的受体细胞，构建猪克隆胚胎，并转移至PZM培养液中。经过48h小时、168h培养后，20％MFF成熟卵泡液培养的卵母细胞制备的克隆胚胎相较对照组20％IFF，卵裂率提高了27.99％，囊胚率提高了78.68％，囊胚细胞数提高了16.34％，详细结果见下表：
Figure BDA0002303623420000081
4、猪卵母细胞活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)检测。
将两种培养液中培养成熟的卵母细胞培养24h、44h后，各取20枚，使用ROS检测试剂盒(购自上海翊圣生物科技有限公司)对卵母细胞内活性氧含量进行检测，并使用Image-Pro Plus软件对其荧光强度进行计算，与先前相比，20％MFF培养液得到的卵母细胞，培养自24h时，可降低48.05％的活性氧含量；培养自44h时，可降低31.20％的活性氧含量。
实施例五
1、体内成熟卵泡液和未成熟卵泡液的处理。
猪体内成熟卵泡液(MFF)的处理：选取断奶第6天的经产母猪数头，采取卵巢，观察是否有排卵点，有排卵点的卵巢即表明其中的卵泡为成熟卵泡。然后将该卵巢用DPBS冲洗3次后，用带18号针头的10mL注射器抽出其中的卵泡液，室温下静置10min后，3000rpm/min离心15min，收集上清液，经过0.22μm针头滤器过滤后，分装在1.8mL冻存管中，液氮淬灭速冻，-80℃冰箱保存备用。
猪未成熟卵泡液(IFF)的处理：从屠宰场购买来的猪卵巢，选取卵泡直径大于8mm的卵泡，用带18号针头的10mL注射器抽出其中的卵泡液，室温下静置10min后，3000rpm/min离心15min，收集上清液，经过0.22μm针头滤器过滤后，分装在1.8mL冻存管中，液氮淬灭速冻，-80℃冰箱保存备用。
2、配制猪卵母细胞体外成熟培养液及卵母细胞的体外成熟培养。
10％IFF培养液：卵母细胞体外成熟培养液的配制方法：在TCM-199培养基中补充0.3mM半胱氨酸，0.05IU/ml人绒毛膜促性腺激素和0.05IU/ml孕马血清促性腺激素，5％(V/V)胎牛血清，10％(V/V)未成熟猪卵泡液。
10％MFF培养液：卵母细胞体外成熟培养液的配制方法：在TCM-199培养基中补充0.3mM半胱氨酸，0.05IU/ml人绒毛膜促性腺激素和0.1IU/ml孕马血清促性腺激素，5％(V/V)胎牛血清，10％(V/V)成熟猪卵泡液。
从3mm-8mm的卵泡中抽出卵母细胞，挑选胞质均匀，并具有三层以上卵丘细胞的卵丘细胞-卵母细胞复合体，分别置于放有10％IFF、10％MFF培养液的四孔板中，然后转移至38.5℃培养箱中培养。44h后，使用透明质酸酶处理卵丘细胞-卵母细胞复合体，弃去卵丘细胞，挑选出具有极体，且胞质均匀、形状正常的卵母细胞备用。
3、猪克隆胚胎的构建及胚胎体外培养。
在10cm细胞培养皿中培养一板杜洛克公猪F6代成体成纤维细胞(在细胞板中约长满80～90％)作为克隆胚胎的供体细胞，将上述培养成熟的两种卵母细胞作为克隆胚胎的受体细胞，构建猪克隆胚胎，并转移至PZM培养液中。经过48h小时、168h培养后，10％MFF成熟卵泡液培养的卵母细胞制备的克隆胚胎相较对照组10％IFF，卵裂率提高了24.41％，囊胚率提高了72.27％，囊胚细胞数提高了15.96％，详细结果见下表：
Figure BDA0002303623420000101
4、猪卵母细胞活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)检测。
将两种培养液中培养成熟的卵母细胞培养24h、44h后，各取20枚，使用ROS检测试剂盒(购自上海翊圣生物科技有限公司)对卵母细胞内活性氧含量进行检测，并使用Image-Pro Plus软件对其荧光强度进行计算，与先前相比，10％MFF培养液得到的卵母细胞，培养自24h时，可降低49.12％的活性氧含量；培养自44h时，可降低32.12％的活性氧含量。
实施例六
1、体内成熟卵泡液和未成熟卵泡液的处理。
猪体内成熟卵泡液(MFF)的处理：选取断奶第6天的经产母猪数头，采取卵巢，观察是否有排卵点，有排卵点的卵巢即表明其中的卵泡为成熟卵泡。然后将该卵巢用DPBS冲洗3次后，用带18号针头的10mL注射器抽出其中的卵泡液，室温下静置10min后，3000rpm/min离心15min，收集上清液，经过0.22μm针头滤器过滤后，分装在1.8mL冻存管中，液氮淬灭速冻，-80℃冰箱保存备用。
猪未成熟卵泡液(IFF)的处理：从屠宰场购买来的猪卵巢，选取卵泡直径大于8mm的卵泡，用带18号针头的10mL注射器抽出其中的卵泡液，室温下静置10min后，3000rpm/min离心15min，收集上清液，经过0.22μm针头滤器过滤后，分装在1.8mL冻存管中，液氮淬灭速冻，-80℃冰箱保存备用。
2、配制猪卵母细胞体外成熟培养液及卵母细胞的体外成熟培养。
10％IFF培养液：卵母细胞体外成熟培养液的配制方法：在TCM-199培养基中补充0.9mM半胱氨酸，0.2IU/ml人绒毛膜促性腺激素和0.2IU/ml孕马血清促性腺激素，10％(V/V)胎牛血清，10％(V/V)未成熟猪卵泡液。
10％MFF培养液：卵母细胞体外成熟培养液的配制方法：在TCM-199培养基中补充0.9mM半胱氨酸，0.2IU/ml人绒毛膜促性腺激素和0.2IU/ml孕马血清促性腺激素，10％(V/V)胎牛血清，10％(V/V)成熟猪卵泡液。
从3mm-8mm的卵泡中抽出卵母细胞，挑选胞质均匀，并具有三层以上卵丘细胞的卵丘细胞-卵母细胞复合体，分别置于放有10％IFF、10％MFF培养液的四孔板中，然后转移至38.5℃培养箱中培养。44h后，使用透明质酸酶处理卵丘细胞-卵母细胞复合体，弃去卵丘细胞，挑选出具有极体，且胞质均匀、形状正常的卵母细胞备用。
3、猪克隆胚胎的构建及胚胎体外培养。
在10cm细胞培养皿中培养一板杜洛克公猪F6代成体成纤维细胞(在细胞板中约长满80～90％)作为克隆胚胎的供体细胞，将上述培养成熟的两种卵母细胞作为克隆胚胎的受体细胞，构建猪克隆胚胎，并转移至PZM培养液中。经过48h小时、168h培养后，10％MFF成熟卵泡液培养的卵母细胞制备的克隆胚胎相较对照组10％IFF，卵裂率提高了18.15％，囊胚率提高了75.13％，囊胚细胞数提高了16.61％，详细结果见下表：
Figure BDA0002303623420000111
4、猪卵母细胞活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)检测。
将两种培养液中培养成熟的卵母细胞培养24h、44h后，各取20枚，使用ROS检测试剂盒(购自上海翊圣生物科技有限公司)对卵母细胞内活性氧含量进行检测，并使用Image-Pro Plus软件对其荧光强度进行计算，与先前相比，10％MFF培养液得到的卵母细胞，培养自24h时，可降低50.14％的活性氧含量；培养自44h时，可降低33.12％的活性氧含量。
在其他实施例中，卵母细胞的培养液还适用于牛，羊、人等卵母细胞体外成熟的培养。
以上所述的内容仅是本发明的一些实施方式。对本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种卵母细胞培养液，其特征在于，所述的培养液中含有成熟的卵泡液；
所述成熟的卵泡液的制取方法为：选取断奶第6天的经产母猪，采取卵巢，观察是否有排卵点，有排卵点的卵巢即表明其中的卵泡为成熟卵泡，然后将该卵巢用DPBS冲洗，再用针头抽出其中的卵泡液，室温下静置，离心处理后收集上清液，然后过滤；
所述的培养液包括0.3～0.9mM半胱氨酸、0.05～0.2IU/ml人绒毛膜促性腺激素、0.05～0.2IU/ml孕马血清促性腺激素、体积分数5-20％胎牛血清、体积分数5-20％成熟卵泡液和基础培养基。
2.根据权利要求1所述的卵母细胞培养液，其特征在于，所述的培养液含有体积分数为5％的成熟卵泡液。
3.根据权利要求1所述的卵母细胞培养液，其特征在于，所述的培养液含有体积分数为10％的成熟卵泡液。
4.根据权利要求1所述的卵母细胞培养液，其特征在于，所述的培养液含有体积分数为15％的成熟卵泡液。
5.根据权利要求1所述的卵母细胞培养液，其特征在于，所述的培养液含有体积分数为20％的成熟卵泡液。
6.根据权利要求1所述的卵母细胞培养液，其特征在于，所述的培养液包括0.6mM半胱氨酸、0.1IU/ml人绒毛膜促性腺激素、0.1IU/ml孕马血清促性腺激素、体积分数10％胎牛血清、体积分数10％成熟卵泡液和基础培养基。
7.根据权利要求1所述的卵母细胞培养液，其特征在于，所述的培养液包括0.3mM半胱氨酸、0.05IU/ml人绒毛膜促性腺激素、0.05IU/ml孕马血清促性腺激素、体积分数5％胎牛血清、体积分数5％成熟卵泡液和基础培养基。
8.一种提高卵母细胞质量的体外培养方法，其特征在于，将卵母细胞置于权利要求1-7任一项所述的培养液中，并置于38.5℃培养箱中培养44小时后，取出备用。
CN201911231323.0A 2019-12-05 2019-12-05 一种卵母细胞培养液及提高卵母细胞质量的体外培养方法 Active CN110846272B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911231323.0A CN110846272B (zh) 2019-12-05 2019-12-05 一种卵母细胞培养液及提高卵母细胞质量的体外培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911231323.0A CN110846272B (zh) 2019-12-05 2019-12-05 一种卵母细胞培养液及提高卵母细胞质量的体外培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110846272A CN110846272A (zh) 2020-02-28
CN110846272B true CN110846272B (zh) 2022-11-04

Family

ID=69607878

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911231323.0A Active CN110846272B (zh) 2019-12-05 2019-12-05 一种卵母细胞培养液及提高卵母细胞质量的体外培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110846272B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113249305A (zh) * 2021-06-04 2021-08-13 华南农业大学 卵母细胞体外成熟培养液添加剂、培养液及其应用
CN113444683B (zh) * 2021-07-12 2022-11-04 华南农业大学 提高卵母细胞体外成熟质量的添加剂、培养方法及应用
CN113583942A (zh) * 2021-07-12 2021-11-02 华南农业大学 促进卵母细胞体外成熟的添加剂及其应用
CN113604427B (zh) * 2021-08-27 2023-08-25 东莞市妇幼保健院 一种含丙酮酸激酶的人卵母细胞体外成熟培养液及培养方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000022098A1 (en) * 1998-10-12 2000-04-20 Geron Bio-Med Limited Porcine oocytes with improved developmental competence
CN105838668A (zh) * 2016-05-04 2016-08-10 中国农业大学 小卵泡卵母细胞的体外成熟培养液及其应用
WO2016206086A1 (zh) * 2015-06-26 2016-12-29 深圳市第二人民医院 一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和培养方法
CN107099500A (zh) * 2017-05-03 2017-08-29 广西大学 一种提高猪卵母细胞体外成熟率的培养液及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000022098A1 (en) * 1998-10-12 2000-04-20 Geron Bio-Med Limited Porcine oocytes with improved developmental competence
WO2016206086A1 (zh) * 2015-06-26 2016-12-29 深圳市第二人民医院 一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法和培养方法
CN105838668A (zh) * 2016-05-04 2016-08-10 中国农业大学 小卵泡卵母细胞的体外成熟培养液及其应用
CN107099500A (zh) * 2017-05-03 2017-08-29 广西大学 一种提高猪卵母细胞体外成熟率的培养液及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
The consequences of porcine IVM medium supplementation with follicular fluid become reflected in embryo quality, yield and gene expression patterns;Piotr Pawlak 等;《Scientific Reports》;20181017;第8卷;摘要，第1页第1段至第10页最后1段 *
The new system of shorter porcine oocyte in vitro maturation (18 hours) using ≥8 mm follicles derived from cumulus-oocyte complexes;Seong-SungKwak 等;《Theriogenology》;20140115;第81卷(第2期);摘要，第2.2节 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110846272A (zh) 2020-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110846272B (zh) 一种卵母细胞培养液及提高卵母细胞质量的体外培养方法
Ferré et al. Recent advances in bovine in vitro embryo production: reproductive biotechnology history and methods
CN102140435A (zh) 一种提高水牛体外胚胎生产效率的方法
Olivera et al. Bone marrow mesenchymal stem cells as nuclear donors improve viability and health of cloned horses
CN102899286A (zh) C型钠肽在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用
CN110951678B (zh) 一种促进猪卵母细胞体外成熟的培养液
CN103184189A (zh) 一种杂交和牛的培育方法
CN107142239A (zh) 提高牛体外受精胚胎培养效率的方法
CN107365738B (zh) 一种奶牛与黄牛异种体外受精胚胎的制备方法
CN108060117B (zh) 一种提高猪克隆胚胎发育效率的方法
Hansen Some challenges and unrealized opportunities toward widespread use of the in vitro-produced embryo in cattle production
WO2018205641A1 (zh) 一种抗寒及瘦肉型转基因猪及其制备方法
Binyameen et al. Recent trends in bovine reproductive biotechnologies.
CN109897820B (zh) 一种延缓体外培养卵子老化的方法
CN114592075B (zh) 一种黄鳝生殖细胞异种移植及移植后嵌合性腺的检测方法
KR101390536B1 (ko) 수정란 이식기술을 이용한 고능력 한우의 대량생산방법
CN115786343A (zh) 一种猪Zfy基因的RNA干扰片段、表达载体及其应用
CN113583943A (zh) 一种卵母细胞体外成熟培养液及其应用
CN114410573A (zh) 一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂及其应用
CN113151159A (zh) 一种卵母细胞体外成熟培养液添加剂及其应用
Umdor et al. Enhancement of developmental competence of immature oocytes supplemented with growth factors in culture media
CN102242151A (zh) 一种利用显微授精技术生产转基因兔的方法
CN113249304B (zh) 萝卜硫素在制备牛卵母细胞体外成熟液中的应用
CN112914784B (zh) 牛胚胎分割的方法
RU2778147C1 (ru) Питательная среда для культивирования ооцитов крупного рогатого скота in vitro

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant