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一种卵母细胞体外成熟培养液及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种添加有趋化因子配体14(CXCL14)的猪卵母细胞体外成熟培养液，该培养液能提高卵母细胞体外成熟的质量。卵母细胞的质量与孤雌激活技术、体外受精技术、体细胞克隆技术紧密相关，提高体外成熟卵母细胞的质量对畜牧生产、医学生殖、生命科学研究等领域都有极其重要的作用。

Description

一种卵母细胞体外成熟培养液及其应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种卵母细胞体外成熟培养液及其应用。
背景技术
体外成熟的卵母细胞可用于制备克隆胚胎、体外受精胚胎、孤雌激活胚胎等，这些胚胎的制备和许多科学研究是紧密相关的，在畜牧生产、医学生殖、生命科学研究等领域有重要用途。但是在实际制备中，由于获取成本、技术等问题，体外成熟卵母细胞不能大量制备且质量差，使得体细胞核移植等技术在科研、生产各个领域并不能广泛应用。体细胞核移植技术，是将供体细胞移入去核的体外成熟卵母细胞中，使得核供体的遗传信息得到完全复制，利用该技术能够在畜牧生产上迅速大量获取各种优秀性状的畜禽动物后代。因此提高体外成熟卵母细胞的质量，有巨大的生产价值。而且，结合基因编辑技术，特别是CRISPR-Cas9技术，能够制备人类疾病动物模型和作为生物反应器生产具有医疗应用价值的药物。此外，在生命科学研究中，利用成熟卵母细胞制备的各种胚胎是重要的实验研究材料，可以帮助我们理解生命发生的各种机制，这有着巨大的意义。综上，卵母细胞体外培养技术的改善和优化，对于各种领域都是十分重要的。
由于卵母细胞体内成熟过程中，受到体内内环境及众多因素的影响，目前影响卵母细胞成熟的核心因子尚未可知。因而卵母细胞在体外成熟培养中，由于缺乏一些未知的必要成分，体外成熟的卵母细胞质量远低于体内正常成熟的卵母细胞，这限制了体细胞核移植胚胎、体外受精胚胎、孤雌胚胎的高效生产应用。目前普遍认为体外成熟的卵母细胞质量差的主要原因是体外成熟过程缺乏清除自由基的物质和一些成熟所必须的因子所导致。
CXCL14是一种在许多组织都有表达的细胞因子，可增强细胞的迁移能力和增殖能力，被证明有调节钙内流，激活卵丘细胞AP-1的作用等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种卵母细胞体外成熟培养液及其在卵母细胞体外成熟、体细胞克隆、孤雌胚胎、体外受精胚胎制备等领域的应用。
本发明的一个方面，提供了一种卵母细胞体外成熟培养液，该培养液中添加有CXCL14细胞因子。添加了CXCL14细胞因子的卵母细胞体外成熟培养液可以提高卵母细胞体外成熟的质量，获得高质量的体外成熟卵母细胞，为后续研究提供基础支持。
在某些实施方式中，该卵母细胞体外成熟培养液的组分为：以TCM-199基础培养液为基础，补充添加0.6mM半胱氨酸，0.1IU/mL人绒毛膜促性腺激素、0.1IU/mL孕马血清促性腺激素、10％胎牛血清、10％猪卵泡液及CXCL14细胞因子。
在某些实施方式中，该卵母细胞体外成熟培养液的组分为：以TCM-199基础培养液为基础，补充添加0.6mM半胱氨酸，0.1IU/mL人绒毛膜促性腺激素、0.1IU/mL孕马血清促性腺激素、10％胎牛血清、10％猪卵泡液及5-250ng/mL CXCL14细胞因子。
在某些实施方式中，该卵母细胞体外成熟培养液的组分为：以TCM-199基础培养液为基础，补充添加0.6mM半胱氨酸，0.1IU/mL人绒毛膜促性腺激素、0.1IU/mL孕马血清促性腺激素、10％胎牛血清、10％猪卵泡液及250ng/mL CXCL14细胞因子。
在某些实施方式中，该卵母细胞体外成熟培养液的组分为：以TCM-199基础培养液为基础，补充添加0.6mM半胱氨酸，0.1IU/mL人绒毛膜促性腺激素、0.1IU/mL孕马血清促性腺激素、10％胎牛血清、10％猪卵泡液及125ng/mL CXCL14细胞因子。
本发明的另一个方面，提供了所述卵母细胞体外成熟培养液在卵母细胞体外成熟培养中的应用。
本发明的第三个方面，提供了所述卵母细胞体外成熟培养液在孤雌胚胎技术领域的应用。
本发明的第四个方面，提供了所述卵母细胞体外成熟培养液在猪、小鼠、牛、羊、人或其他哺乳动物卵母细胞体外成熟培养中的应用。
本发明的第五个方面，提供了所述卵母细胞体外成熟培养液在体细胞克隆技术领域的应用。
本发明的第六个方面，提供了所述卵母细胞体外成熟培养液在体外受精胚胎制备技术领域的应用。
本发明的有益效果：
通过向基础成熟培养液中添加CXCL14细胞因子，可以有效降低卵母细胞在体外培养时的氧化应激反应，进而提高卵母细胞体外成熟培养的效率和质量，而卵母细胞质量的大幅度提升，对于体细胞克隆技术、孤雌胚胎技术、体外受精技术上的应用都有重要意义，对大动物克隆生产、人类辅助生殖医学、生物医学研究也意义非凡。
附图说明
图1为体内成熟(V_M_F)时期、体内未成熟(V_I_F)时期卵泡液中CXCL14蛋白水平的相对含量。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细的说明。
1、卵泡液定量蛋白质组学检测
为了找出卵母细胞体内成熟过程哪些因子发生了显著的变化，我们对体内成熟前后两种卵泡液进行定量蛋白质组学质谱检测。体内成熟卵泡液通过手术的方式，对发情母猪红肿的卵巢进行收集卵泡液(需有排卵点才收集)；体内未成熟卵泡液采自未发情母猪得卵巢，挑选直径为3～8mm的卵泡进行收集。然后用去高丰度蛋白试剂盒对两种卵泡液进行高丰度蛋白的去除，制备成上机样品后进行质谱技术以及二代测序技术对体内成熟过程的卵泡液等进行多组学检测。在定量蛋白质组学的结果中，我们发现成熟时期的卵泡液中CXCL14蛋白的相对水平是未成熟时期的近2倍(图1)。此外，成熟时期的卵泡，其直径是未成熟时期的3～5倍，这意味者CXCL14在两种卵泡液中的绝对含量差异可达50倍以上。这表明CXCL14在卵母细胞成熟过程中可能发挥了重要作用，并在后续的实验中进行进一步验证。
2、猪卵母细胞体外成熟培养液的配制
为进一步研究CXCL14细胞因子在卵母细胞的体外成熟中的作用，配制如下培养液：
a.基础成熟培养液(对照组)：以TCM-199基础培养液为基础，补充0.6mM半胱氨酸，0.1IU/mL人绒毛膜促性腺激素和0.1IU/mL孕马血清促性腺激素，10％(V/V)胎牛血清，10％(V/V)猪卵泡液。
b.CXCL14成熟培养液(实验组)：在对照组的基础成熟培养液中分别补充5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL的CXCL14细胞因子。
3、卵母细胞的体外成熟培养
用10ml的注射器从3～8mm的卵泡中抽出带有卵丘细胞的卵母细胞，挑选胞质均匀、形态正常、包裹有三层及以上的卵丘细胞的卵母细胞，分别置于添加有不同浓度CXCL14的卵母细胞体外成熟培养液或基础成熟培养液中，并放入38.5℃的培养箱中培养。待44h后，用透明质酸酶去掉卵丘-卵母细胞复合体中的卵丘细胞，再挑选出有极体、胞质均匀、形态正常的成熟卵母细胞，待下一步实验使用。
4、猪孤雌胚胎的构建及胚胎体外培养
a.猪孤雌胚胎的构建：将获得的体外成熟卵母细胞，放入电激活液中平衡约2min并洗六次，然后放入加有预先预热好的电激活液的融合槽中，510V、60μs、2DC激活卵母细胞。激活的卵母细胞在PZM胚胎培养液清洗3遍后放入加有PZM的四孔板中培养。PZM培养液成分如下：NaCl108.00mM、KCl 10.00mM、KH2PO40.35 mM、MgSO4·7H2O 0.40mM、NaHCO325.07mM、丙酮酸钠(Na-Pyruvate)0.20mM、乳酸钙2.00mM、牛磺酸(Hypotaurine)5.00mM、L-谷氨酰胺1.00mM、必需氨基酸20mL/L、非必需氨基酸10mL/L。
b.胚胎体外培养：胚胎构建好后，将胚胎置于放有PZM的四孔板中，转至38.5℃的饱和湿度培养箱中继续培养，分别在培养48h观察记录卵裂数据、168h后观察记录囊胚数据。
5、实验结果
(1)关于卵母细胞体外成熟过程补充CXCL14对卵母细胞质量的影响。采用添加了不同浓度CXCL14的“CXCL14成熟培养液”培养卵母细胞，并将经CXCL14处理过的成熟卵母细胞进行孤雌激活处理，相对对照组，125ng/mLCXCL14组卵裂率提高了6.59％，囊胚率提高了19.60％；250ng/mLCXCL14组卵裂率提高了4.51％，囊胚率提高了22.14％，囊胚平均细胞数提高了15.8％。此外，补充其他浓度的CXCL14也在不同程度上提高胚胎的囊胚率及囊胚细胞数。详细结果见下表1：
表1 CXCL14处理组卵母细胞对孤雌胚胎的影响结果
Figure BDA0003158776100000041
综上，使用CXCL14细胞因子作为卵母细胞体外成熟液的补充成分，能有效提高卵母细胞的质量。
通过技术的创新，不仅可以用来改善各种物种(如：人、小鼠、牛、羊等)的卵母细胞体外成熟，提高制备优质的孤雌胚胎及各种胚胎，还可供人类辅助生殖中卵母细胞体外培养成熟的运用提供参考，以改进现有的卵母细胞体外成熟的培养体系，从而促进实际生产应用以及生物医学的发展。
以上所述的内容仅是本发明的一些实施方式。对本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种卵母细胞体外成熟培养液，其中，所述的培养液在卵母细胞体外成熟基础培养液中添加了CXCL14细胞因子。
2.根据权利要求1所述的卵母细胞体外成熟培养液，其中，所述培养液的组分为：以TCM-199基础培养液为基础，补充添加0.6mM半胱氨酸，0.1IU/mL人绒毛膜促性腺激素、0.1IU/mL孕马血清促性腺激素、10％胎牛血清、10％猪卵泡液及CXCL14细胞因子。
3.根据权利要求2所述的卵母细胞体外成熟培养液，其中，所述的培养液中CXCL14细胞因子浓度为5-250ng/mL。
4.据权利要求3所述的卵母细胞体外成熟培养液，其中，所述的培养液中CXCL14因子浓度为250ng/ml或125ng/mL。
5.权利要求1-4任一项所述的卵母细胞体外成熟培养液在卵母细胞体外成熟培养中的应用。
6.权利要求1-4任一项所述的卵母细胞体外成熟培养液在孤雌胚胎技术领域的应用。
7.权利要求1-4任一项所述的卵母细胞体外成熟培养液在猪、小鼠、牛、羊、人或其他哺乳动物卵母细胞体外成熟培养中的应用。
8.权利要求1-4任一项所述的卵母细胞体外成熟培养液在体细胞克隆技术领域的应用。
9.权利要求1-4任一项所述的卵母细胞体外成熟培养液在体外受精胚胎制备技术领域的应用。
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