CN113943698B

CN113943698B - 一种卵母细胞体外成熟培养的方法及其应用

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Publication number: CN113943698B
Application number: CN202111560965.2A
Authority: CN
Inventors: 丁方荣; 王海平; 王剑
Original assignee: Beijing Yili Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Beijing Yili Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2021-12-20
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2041-12-20
Also published as: CN113943698A

Abstract

本发明提供了一种卵母细胞体外成熟培养的方法及其应用。本发明的方法包括将非人动物的眼房水用于非人哺乳动物卵母细胞体外成熟。实验证实，经过该成熟方法成熟的卵母细胞，后续体外受精胚胎的发育率和核移植胚胎的发育率均明显高于对照组，显示该方法能有效提高体外卵母细胞成熟的质量。利用眼房水作为卵母细胞体外成熟培养的基础培养液，具有天然的优势，首先眼房水各种营养成分丰富，足以满足卵母细胞体外成熟所需的各种营养需求；其次，眼房水中含有的各种天然的生长因子，对于促进卵母细胞体外成熟与后期体外胚胎发育具有重要作用；再次，直接利用眼房水培养，可免去繁琐的培养液配制过程，有利于体外胚胎培养的大范围推广应用。

Description

一种卵母细胞体外成熟培养的方法及其应用

技术领域

本发明具体涉及一种卵母细胞体外成熟培养的方法及其应用。

背景技术

卵母细胞体外培养的成熟是动物人工辅助生殖技术中非常重要一个技术环节，随着体外受精、核移植等胚胎工程技术的研究和应用越来越广泛。

在体外卵母细胞成熟培养中，基础培养基、动物血清、激素、生长因子等因素，对卵母细胞体外成熟培养效果具有重要影响。大量的试验证明在动物卵母细胞体外培养中，动物卵母细胞培养成熟液中添加适量生长因子对卵母细胞成熟以及早期胚胎发育有重要作用。所添加的生长因子大多数是动物血清中所含有的物质，如EGF（表皮生长因子）、IGF-I（胰岛素样生长因子-I）、GDNF（神经胶质源营养因子）、LIF（白血病抑制因子）、SCF（干细胞因子）、VEGF（血管内皮生长因子）等，这些生长因子对卵母细胞的体外培养具有一定的促进作用。

卵母细胞体外培育的质量是决定胚胎生物工程研究和应用成败的关键前提因素之一，但至今卵母细胞体外培养的效果仍然不稳定。

发明内容

针对于背景技术中存在的问题与限制，本发明拟解决的技术问题是如何高效地进行卵母细胞体外成熟培养。

本发明所提供的一种卵母细胞体外成熟培养的方法，包括将非人动物的眼房水用于非人哺乳动物卵母细胞体外成熟。

上述方法中，所述非人动物的眼房水作为哺乳动物卵母细胞体外成熟培养时卵母细胞体外成熟液的组成成分。

上述方法中，所述生长因子为促卵泡素、促黄体素、雌激素和丙酮酸钠。

上述方法中，所述卵母细胞体外成熟液的配制方法如下：在眼房水中加入促卵泡素、促黄体素、雌激素和丙酮酸钠，使眼房水成熟液中促卵泡素的浓度为0.01IU/mL、促黄体素的浓度为0.1IU/mL、雌激素的浓度为1mg/mL、丙酮酸钠的浓度为0.2mM，过滤除菌，即得到卵母细胞体外成熟液。

上述方法中，所述非人动物的眼房水来自雌性家畜动物，包括且不限于牛、羊、猪等。

上述方法中，所述非人哺乳动物卵母细胞来自雌性家畜动物，包括且不限于牛、羊、猪等。

本发明还保护上述的卵母细胞体外成熟液。

上述卵母细胞体外成熟培养的方法或上述卵母细胞体外成熟液在动物人工辅助生殖中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种全新的卵母细胞体外成熟培养的方法。本发明经大量的实验研究证实，动物眼房水可以作为卵母细胞体外成熟液的基础液，经过该成熟方法成熟的卵母细胞，后续体外受精胚胎的发育率和核移植胚胎的发育率均明显高于对照组，显示该方法能有效提高体外卵母细胞成熟的质量。眼房水是一种由睫状体上皮细胞分泌的透明细胞外液，它维持眼内压和眼球的外形，并且负责营养没有血管生长的角膜、晶状体和小梁网，因此眼房水中含有大量的细胞所需营养物质，且眼房水中分布的蛋白质在数量和性质两方面都不同于血浆中的蛋白质。目前，在人眼的房水中己经发现了若干种生长因子，例如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、胰岛素样生长因子-1、血小板生长因子、血管内皮生长因子、转铁蛋白（Tf）等。利用眼房水作为卵母细胞体外成熟培养的基础培养液，具有天然的优势，首先眼房水各种营养成分丰富，足以满足卵母细胞体外成熟所需的各种营养需求；其次，眼房水中含有的各种天然的生长因子，对于促进卵母细胞体外成熟与后期体外胚胎发育具有重要作用；再次，直接利用眼房水培养，可免去繁琐的培养液配制过程，有利于体外胚胎培养的大范围推广应用。

附图说明

图1为BO洗精液的溶质浓度。

图2为BO受精液的溶质浓度。

图3为CR1aa培养液的溶质浓度。

图4为融合液的溶质浓度。

图5为卵母细胞体外受精实验数据，其中，a,b同列数据上标不同表示差异显著（p<0.05）。

图6为卵母细胞核移植实验数据，其中，a,b同列数据上标不同表示差异显著（p<0.05）。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、试剂。

以下实施例中，促卵泡素（FSH，货号F8174-1VL）、促黄体素（LH，货号L5269-1）、雌激素（E₂，货号E2758）、丙酮酸钠（P4562）、肝素（H3149）、透明质酸酶（H4272）、细胞松驰素B（C6762）、放线菌酮（C1988）均为Sigma-Aldrich公司产品。

以下实施例中，PBS液（磷酸缓冲盐溶液，phosphate buffer saline，货号14287-080）、M199基础培养基（11150059）、胎牛血清（FBS，货号10100-147）、0.25%胰蛋白酶（25200-056）均为ThermoFisher公司产品。

以下实施例中，牛胎儿细胞取自45日龄胎儿表皮组织。

2、溶液。

以下实施例中，眼房水成熟液（配方为：眼房水（基础液）+0.01IU/mL FSH+0.1IU/mL LH+1mg/mL E₂+0.2mM丙酮酸钠）的具体配制方法如下：在眼房水中加入促卵泡素（FSH）、促黄体素（LH）、雌激素（E₂）和丙酮酸钠，使眼房水成熟液中促卵泡素的浓度为0.01IU/mL、促黄体素的浓度为0.1IU/mL、雌激素的浓度为1mg/mL、丙酮酸钠的浓度为0.2mM，0.2μm滤器过滤除菌后分装，即得到眼房水成熟液。

以下实施例中，TCM199成熟液（配方为：M199（基础液）+10%FBS+0.01U/mL FSH+0.1IU/mL LH+1mg/mLE₂ +0.2mM丙酮酸钠）的具体配制方法为：在M199基础培养基中加入胎牛血清（FBS）、促卵泡素（FSH）、促黄体素（LH）、雌激素（E₂）和丙酮酸钠，使TCM199成熟液中胎牛血清的体积百分含量为10%、促卵泡素的浓度为0.01IU/mL、促黄体素的浓度为0.1IU/mL、雌激素的浓度为1mg/mL、丙酮酸钠的浓度为0.2mM，0.2μm滤器过滤除菌后分装，即得到TCM199成熟液。

以下实施例中，以下实施例中，BO洗精液的溶剂为水，溶质如图1。将图1中的试剂依次按照浓度要求加入水中，调PH值至7.2-7.4，0.2μm滤器过滤后分装，负4度冰箱保存，保质期1个月。

以下实施例中，BO受精液的溶剂为水，溶质如图2。将图2中的试剂依次按照浓度要求加入水中，调PH值至7.2-7.4，0.2μm滤器过滤后分装，负4度冰箱保存，保质期1个月。

以下实施例中，CR1aa培养液的溶剂为水，溶质如图3。将图3中的试剂依次按照浓度要求加入水中，调PH值至7.2-7.4，0.2μm滤器过滤后分装，负4度冰箱保存，保质期1个月。

以下实施例中，体外胚胎培养液（配方为：CR1aa+5%FBS）的具体配制方法为：在CR1aa中加入FBS，使体外胚胎培养液中FBS的体积百分含量为5%，即得到体外胚胎培养液。

以下实施例中，操作液（配方为：M199+10%FBS+7.5µg/mL细胞松驰素B）的具体配制方法为：在M199基础培养基中加入胎牛血清（FBS）和细胞松驰素B，使操作液中胎牛血清的体积百分含量为10%、细胞松驰素B的浓度为7.5µg/mL，即得到操作液。

以下实施例中，含有20%FBS的M199溶液（配方为：M199+20%FBS）的具体配制方法为：在M199基础培养基中加入胎牛血清（FBS），使操作液中胎牛血清的体积百分含量为20%，即得到含有20%FBS的M199溶液。

以下实施例中，含有10%FBS的M199溶液（配方为：M199+10%FBS）的具体配制方法为：在M199基础培养基中加入胎牛血清（FBS），使操作液中胎牛血清的体积百分含量为10%，即得到含有10%FBS的M199溶液。

以下实施例中，融合液的溶剂为水，溶质如图4。将图4中的试剂依次按照浓度要求加入水中，调PH值至7.2-7.4，0.2μm滤器过滤后分装，负4度冰箱保存，保质期1个月。

以下实施例中，激活液（含有5μg/ml细胞松驰素B+10μg/ml 放线菌酮）的具体配制方法为：在M199基础培养基中加入细胞松驰素B和放线菌酮，使激活液中细胞松驰素B的浓度为5μg/ml，放线菌酮的浓度为10μg/ml，即得到激活液。

实施例1 牛眼房水的采集及成熟培养液的配制。

牛场即将淘汰的母牛，对其进行同期发情处理，待其生理周期处于发情期，拉至屠宰场屠宰，屠宰前，对待宰母牛进行电击，击晕后立即进行眼房水的抽取，用5ml无菌注射器，针头从正对眼球45度角方向，轻柔插入眼房，抽取其中眼房水，直至眼球塌陷。然后将眼房水立即转移至无菌离心管中，封口后置于冰盒中，拉回实验室，在超净工作台中，配制眼房水成熟液。

眼房水成熟液的配方为：眼房水（基础液）+0.01IU/mL FSH+0.1IU/mL LH+1mg/mLE₂+0.2mM丙酮酸钠。

实施例2 牛卵母细胞的获取、体外成熟、体外受精胚胎和体细胞核移植胚胎的制备。

（1）牛卵母细胞的获取。

从屠宰厂收集成年牛的卵巢，置于30℃的生理盐水在4h内送到实验室，37℃的PBS液中清洗三遍后，以直径为0.7mm针头抽取直径为2-8mm的卵泡，在体视镜下挑取形态均匀、结构致密的卵丘-卵母细胞-复合体（COCs）。

（2）卵母细胞的成熟。

挑取的卵丘-卵母细胞-复合体随机分成两组，进行如下两种处理。

眼房水处理组：以眼房水成熟液（参见实施例1）进行成熟培养，具体为将卵丘-卵母细胞-复合体以50-60枚/孔放入含有眼房水成熟液的四孔板，在38.5℃、5%CO₂培养箱中成熟培养18-22h。

对照组：以TCM199成熟液进行成熟培养，具体为将卵丘-卵母细胞-复合体以50-60枚/孔放入含有TCM199成熟液的四孔板，在38.5℃、5%CO₂培养箱中成熟培养18-22h。

（3）体外受精程序及体外受精胚胎的培养。

用受精液在一次性塑料培养皿上形成体积为80〜100 μL的受精小滴，盖上石蜡油后放入38.5℃、5 % CO₂培养箱中预热2小时。

将储存在液氮罐中的冻精解冻，然后用洗精液洗涤获能后待用。

将步骤（2）中两种方式成熟培养22小时后的牛卵母细胞分别和洗涤获能后的精子一同放入受精小滴，在38.5℃、5 % CO₂的环境内精卵共孵育6-8小时，然后去除卵母细胞周围的卵丘细胞和残余精子，观察卵母细胞第二极体排出情况，并以此为依据按照式1统计卵母细胞受精率。

受精率=受精后排出第二极体的卵母细胞数/卵母细胞总数式1。

将受精后的卵母细胞移入体外胚胎培养液中，在38.5℃、5 % CO₂培养箱中培养，48小时后按照式2观察统计卵裂情况，7天按照式3观察统计囊胚发育情况。

卵裂率=培养48小时发育到4-8细胞的卵母细胞数/卵母细胞总数式2。

囊胚率=培养7天发育到囊胚阶段的卵母细胞数/卵母细胞总数式3。

以上实验均重复至少三次以上，数据以平均值表示，并对实验数据进行ANOVA显著性分析，p＜0.05被认为是差异显著。卵母细胞体外受精结果详见图5：以眼房水成熟液成熟的卵母细胞，其体外受精率平均达到78%，卵裂率平均达到75%，囊胚发育率平均达到55%，均显著性高于TCM199成熟液成熟的对照组卵母细胞。

（4）核移植程序及克隆胚胎的体外培养。

将步骤（2）中两种方式成熟培养18-20h后的卵母细胞分别放入0.1%透明质酸酶的管内振荡2-3min后，再用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞与卵母细胞完全脱离，选择形态完整，细胞质均匀并排出第一极体的卵母细胞为胞质受体，并以排出第一极体为标准，按照式4统计卵母细胞成熟率。

成熟率=成熟后排出第一极体的卵母细胞数/卵母细胞总数式4。

将上述带有第一极体的卵母细胞移入操作液中，在200倍显微镜下用将第一极体以及其下方的卵母细胞内的染色体一并吸除，再放入含有20%FBS的M199溶液中洗三遍后，得到去了核的卵母细胞，置于培养箱中备用。

将血清饥饿2-4d的牛胎儿细胞用0.25%胰蛋白酶消化2-4min后离心作为核供体细胞，用20µm直径玻璃管将直径为10-12µm的核供体细胞移入去了核的卵母细胞透明带内，然后将其放入融合液中平衡（现用现配）3-5分钟后放入融合槽内转动卵细胞使供体细胞与卵母细胞接触而与电场垂直，同时在场强为2.5kV/cm的直流脉冲场中，卵母细胞和核供体细胞进行电融合（融合仪为BTX公司的ECM-2001）后，迅速移入含有10%FBS的M199溶液中培养数小时后，按照式5计算融合率，并挑选融合得到的重构胚进行下一步激活处理。将重构胚放入激活液中5小时，待重构胚被激活后换入体外胚胎培养液在38.5℃、5%CO₂培养箱中培养液中培养，2天后按照式6观察统计卵裂情况，7天后按照式7观察统计囊胚发育情况。

融合率=重构胚数/核移植卵母细胞总数式5。

卵裂率=重构胚48小时后卵裂数/重构胚总数式6。

囊胚率=培养7天发育到囊胚阶段的重构胚/卵裂数式7。

以上实验均重复至少三次以上，数据以平均值表示，并对实验数据进行ANOVA显著性分析，p＜0.05被认为是差异显著。核移植实验结果详见图6：以眼房水成熟液成熟的卵母细胞，以脱卵丘后观察第一极体排出情况为成熟标准的情况下，其成熟率平均高达90%，核移植重构胚的融合率达到80%，48小时重构胚卵裂率平均达到70%，第7天囊胚发育率达到45%，均显著性高于TCM199成熟液成熟的对照组卵母细胞。

综上，动物眼房水可以作为卵母细胞体外成熟液的基础液，经过该成熟方法成熟的卵母细胞，后续体外受精胚胎的发育率和核移植胚胎的发育率均明显高于对照组，显示该方法能有效提高体外卵母细胞成熟的质量。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.一种卵母细胞体外成熟培养的方法，其特征在于：包括将非人动物的眼房水用于非人哺乳动物卵母细胞体外成熟。

2.根据权利要求1所述的卵母细胞体外成熟培养的方法，其特征在于：所述非人动物的眼房水作为哺乳动物卵母细胞体外成熟培养时卵母细胞体外成熟液的组成成分。

3.根据权利要求2所述的卵母细胞体外成熟培养的方法，其特征在于：所述卵母细胞体外成熟液为在眼房水中加入生长因子配制而成。

4.根据权利要求3所述的卵母细胞体外成熟培养的方法，其特征在于：所述生长因子为促卵泡素、促黄体素、雌激素和丙酮酸钠。

5.根据权利要求4所述的卵母细胞体外成熟培养的方法，其特征在于：所述卵母细胞体外成熟液的配制方法如下：在眼房水中加入促卵泡素、促黄体素、雌激素和丙酮酸钠，使眼房水成熟液中促卵泡素的浓度为0.01IU/mL、促黄体素的浓度为0.1IU/mL、雌激素的浓度为1mg/mL、丙酮酸钠的浓度为0.2mM，过滤除菌，即得到卵母细胞体外成熟液。

6.根据权利要求1-5任一项所述的卵母细胞体外成熟培养的方法，其特征在于：所述非人动物的眼房水来自雌性家畜动物。

7.根据权利要求1-5任一项所述的卵母细胞体外成熟培养的方法，其特征在于：所述非人哺乳动物卵母细胞来自雌性家畜动物。

8.权利要求2-6任一项中所述的卵母细胞体外成熟液。

9.权利要求1-7任一项所述的卵母细胞体外成熟培养的方法在动物人工辅助生殖中的应用。

10.权利要求8所述的卵母细胞体外成熟液在动物人工辅助生殖中的应用。