CN111518749A - 一种未成熟卵母细胞的体外培养液及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及辅助生殖技术领域，公开了一种未成熟卵母细胞的体外培养液，包括基本培养液和组合物，所述基本培养液包括溶剂和溶质，所述溶剂包括水，所述溶质包括维生素、能量物质、无机盐和氨基酸；所述组合物包括丁内酯‑Ⅰ 0.01～1mg/L、雌二醇0.001～2mg/L、促卵泡素0.001～1IU/L、促黄体生成素0.001～1IU/L、表皮生长因子0.001～1IU/L、类胰岛素生长因子0.001～1mg/L和人绒毛膜促性腺激素0.001～1IU/L；本发明还公开了该体外培养液的制备方法和应用；本发明除了添加基础物质以外，通过添加所述能量物质、组合物和维生素，达到了使未成熟卵母细胞的胞核和胞质同步成熟，并且提高受精率和优质胚胎率的效果。

Description

一种未成熟卵母细胞的体外培养液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及辅助生殖技术领域，具体是一种未成熟卵母细胞的体外培养液及其制备方法和应用。
背景技术
体外受精(in vitro fertilization，IVF)，又称试管婴儿，是一种辅助生殖治疗的方法，具体是指分别将卵子与精子取出后，进行体外受精，培养形成胚胎，再将胚胎移植回母体子宫内妊娠发育成胎儿。
自1978年第一例试管婴儿出生起，辅助生殖技术(ART)取得了长足的进步。起初，辅助生殖技术是通过获取女性正常生理周期中的成熟卵子进行体外受精，而女性一个排卵周期只成熟并排除一枚卵子，因其数量太少而导致辅助生殖治疗成功率很低。于是出现了促排卵控制技术，这是通过注射激素(通常需要2～3周)使多个卵泡同时发育，从而取出多枚成熟卵，这大大增加了辅助生殖治疗的成功率。但是，注射激素存在很多的副作用，例如出现乳房压痛、情绪波动和恶心等反应，严重者会引发卵巢过度刺激综合征(OHSS)，出现血栓栓塞、肾功能损伤和成人呼吸窘迫症等并发症，甚至会导致死亡。对此，众多学者一直在探讨如何降低助孕过程中的OHSS发生率和提高临床妊娠率，未成熟卵母细胞的体外成熟培养(in vitro maturation，IVM)技术应运而生。
但是，现有的体外培养液只提供了最基本的卵母细胞成熟所需的能量物质和技术，其虽然能够使卵母细胞发育成熟，但由于缺乏对卵母细胞减数分裂的调控物质，使得卵母细胞仅仅是形态的成熟，而其实际的胞质储备不足，导致了卵母细胞后续的受精能力和卵裂能力的降低。
中国专利文献CN201911148648.2，申请日20191121，名称为：一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其制备方法与应用，公开了一种体外成熟培养液，包括基础培养液TCM-199、青霉素、链霉素、NaHCO3、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、聚乙烯醇、丙酮酸钠、胰岛素、半胱氨酸、表皮生长因子、猪卵泡液、孕马血清促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素和雷美替胺。
上述专利文献通过添加雷美替胺，可提高卵母细胞体外成熟质量、提高卵丘细胞扩散指数、降低卵母细胞活性氧水平和提高谷胱甘肽水平，达到了提高体外受精胚胎卵裂率、囊胚率和囊胚总细胞数的效果。但是关于一种能够使未成熟卵母细胞的胞核和胞质同步成熟，并且提高受精率和优质胚胎率的技术方案，则尚未提出。
因此，我们亟需一种能够使未成熟卵母细胞的胞核和胞质同步成熟，并且提高受精率和优质胚胎率的体外培养液。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种未成熟卵母细胞的体外培养液及其制备方法和应用，以至少达到使未成熟卵母细胞的胞核和胞质同步成熟，并且提高受精率和优质胚胎率的效果。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于体外培养未成熟卵母细胞的组合物，包括丁内酯-Ⅰ、雌二醇、促卵泡素、促黄体生成素、表皮生长因子、类胰岛素生长因子和人绒毛膜促性腺激素。
其中，由于卵母细胞成熟的过程从概念上分为胞核成熟与胞质成熟，而形态学通过第一极体的排出，即胞核的成熟来定义卵母细胞的成熟；但成熟卵母细胞的受精、卵裂能力更多取决于胞质的物质储备，所以卵母细胞的胞质成熟度会直接影响卵母细胞的繁殖能力。所述丁内酯-Ⅰ(BL-I)能可逆性抑制体外培养的卵母细胞的核成熟，具体为：当BL-I起到抑制作用时，未成熟卵能够缓慢的排出第一极体，从而人为增加胞质的成熟时间；而当抑制作用消除后，核成熟过程明显加速，并且抑制作用越强，加速效应就越明显，最终达到了在不影响胞核成熟的条件下，使胞核和胞质同步成熟的效果。
所述类胰岛素生长因子(IGF)通过与特异性的靶细胞表面受体IGF-IR结合，能够促进颗粒细胞增殖并维持芳香化酶的功能，从而提高了雌激素的合成，并且促进了卵泡进一步发育；而随着雌激素的增多，卵泡对激素的敏感性增强，最终达到了促使卵泡迅速生长的效果。
所述雌二醇(E2)是一种类固醇激素，能够促进卵泡等雌性生殖器官发育，随着卵泡的生长，雌激素的分泌量逐渐增加，而雌激素的分泌能够起到调节自分泌的作用，进一步促进E2分泌，从而进一步促进卵泡发育；同时，E2还能够促进颗粒细胞的增殖，并促进颗粒细胞合成类胰岛素生长因子I，并且促进细胞间缝隙连接通道形成。因此，所述雌二醇能够通过上述过程增加卵母细胞与颗粒细胞的物质传递，达到促进卵母细胞成熟的效果。
所述表皮生长因子(EGF)、促黄体生成素(Luteinizing hormone，LH)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)能够降低抑制卵母细胞成熟的信号物质cAMP的浓度，达到了使卵母细胞恢复减数分裂，从而促进卵母细胞成熟的效果；并且，所述促黄体生成素还能够引起卵丘扩展，从而中断卵丘与卵母细胞的连接，达到了在降低颗粒细胞对卵母细胞成熟的抑制作用的同时，减少卵母细胞退化的效果，形成了排卵和受精的必需条件。
所述促卵泡素(FSH)能够促进卵母细胞的成熟，并且减少减数分裂异常的发生率。
一种未成熟卵母细胞的体外培养液，包括基本培养液和组合物，所述组合物包括丁内酯-Ⅰ0.01～1mg/L、雌二醇0.001～2mg/L、促卵泡素0.001～1IU/L、促黄体生成素0.001～1IU/L、表皮生长因子0.001～1IU/L、类胰岛素生长因子0.001～1mg/L和人绒毛膜促性腺激素0.001～1IU/L。
进一步的，所述体外培养液还包括人血白蛋白4500～6500mg/L和庆大霉素6.0～15.0mg/L。
通过上述技术方案，所述人血白蛋白可螯合重金属，达到了避免所述体外培养液中出现重金属对卵母细胞产生毒性影响的效果，所述庆大霉素作为一种广谱抗生素，达到了有效抑制细菌生长的效果。
进一步的，所述基本培养液包括溶剂和溶质；所述溶剂包括水，所述溶质包括维生素、能量物质、无机盐和氨基酸。
进一步的，所述溶剂为超纯水，因其不含内毒素和重金属，适用于作为溶剂。
进一步的，所述维生素包括D-泛酸钙0.01～1.5mg/L、氯化胆碱0.01～1.5mg/L、叶酸0.01～1.1mg/L、肌醇0.01～2.5mg/L、烟酰胺0.01～2.0mg/L、盐酸吡哆醛0.01～2.0mg/L、核黄素0.01～0.14mg/L、硫胺素0.01～1.1mg/L和抗坏血酸0.01～100mg/L。
其中，所述D-泛酸钙是辅酶A的重要组成部分，它参与介导丙酮酸生成乙酰辅酶A，并进入三羧酸循环，进行氧化磷酸化，从而刺激三羧酸循环，间接增加谷氨酸(谷胱甘肽的前体)的细胞存储，最终达到了在卵母细胞的成熟过程中，通过谷胱甘肽的合成增加胚胎后续的发育能力的效果。
所述氯化胆碱不仅是细胞的结构物质，还是神经鞘磷脂和卵磷脂的重要组成成分，以及维持膜结构、功能和信号传导的重要物质。
所述叶酸在细胞的蛋白质分解及新蛋白质合成的过程中起辅酶的作用，并且对脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)的合成也起重要作用。
所述肌醇在膜磷脂的合成、受精过程中原核的形成、磷脂酰肌醇第二信使系统中都扮演着重要的角色；而磷脂酰肌醇信使途径负责调节多种的激素及生长因子，能够增强LH、FSH和EGF在卵母细胞成熟过程中的作用。
所述烟酰胺参与细胞内的氧化还原反应，包括糖酵解以及大部分的柠檬酸循环过程。
所述核黄素是两种辅酶的前体，这两种辅酶在能量合成中起重要作用；同时，所述核黄素还能够作为氢载体，帮助脂肪和碳水化合物的代谢，以产生腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)形式的能量。
所述抗坏血酸具有促进淋巴母细胞生成和促进机体产生干扰素的作用，达到了提高免疫力和抗病毒的效果；另外，所述抗坏血酸作为一种抗氧化剂，不仅能够还原胞内的活性氧(ROS)成分以降低其对细胞的伤害，还能够通过降低纺锤体的异常率以及DNA的损伤率以达到提高优质胚胎率的效果。
进一步的，所述能量物质包括D-葡萄糖38～1010mg/L、丙酮酸钠8～1800mg/L和乳酸钠530～2200mg/L。
进一步的，所述无机盐包括氯化钙180～220mg/L、氯化钾370～420mg/L、硫酸镁90～495mg/L、氯化钠4900～6820mg/L、碳酸氢钠1230～2250mg/L和水合磷酸二氢钠0.1～130mg/L。
由于所述体外培养液中葡萄糖或丙酮酸钠的含量过高时，会对卵母细胞的成熟产生抑制作用；而含量过低时，会导致胞质和胞核不同步成熟发育；同时，葡萄糖的浓度会直接影响到所述体外培养液的渗透压。
通过上述技术方案，在向所述能量物质中添加D-葡萄糖和丙酮酸钠的同时限定其浓度，并且通过所述无机盐控制渗透压，达到了在为卵母细胞的成熟过程提供能量的同时，避免上述不利影响产生的效果。
进一步的，所述氨基酸包括必需氨基酸80.7～436mg/L和非必需氨基酸62.61～976mg/L；
所述必需氨基酸包括异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸；
所述非必需氨基酸包括酪氨酸、精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、组氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸。
通过上述技术方案，添加所述半胱氨酸，其不仅具有抗氧化作用，还对放射性物质和重金属具有螯合作用，达到了对重金属和活性氧两种有害物质进行控制的效果。
一种未成熟卵母细胞的体外培养液的制备方法，包括以下步骤：
S1.在百级条件下，按配比称量所述无机盐、氨基酸、维生素、能量物质和庆大霉素，并加入水中混合均匀，得到溶液I；
S2.按配比称量所述人血白蛋白和组合物，并加入所述溶液I中混合均匀，得到溶液Ⅱ；
S3.所述溶液Ⅱ经灭菌和分装处理，得到所述体外培养液。
进一步的，S1～S2中，环境温度均为18～26℃，环境湿度均为40％～60％。
进一步的，S3中，所述灭菌具体为：使用滤膜对所述溶液Ⅱ进行过滤除菌，所述滤膜的孔径为0.10～0.22μm。
一种未成熟卵母细胞的体外培养液在体外培养未成熟卵母细胞上的应用。
本发明的有益效果是：
1.本发明的一种未成熟卵母细胞的体外培养液，无需添加血清，并且所有组分的成分单一、功效明确，不存在潜在的污染成分。
2.本发明的一种未成熟卵母细胞的体外培养液，通过添加所述表皮生长因子、促黄体生成素和人绒毛膜促性腺激素，达到了恢复卵母细胞的减数分裂，从而促进卵母细胞成熟的效果。另外，所述促黄体生成素还能够促进卵丘的扩散，从而中断卵丘与卵母细胞的连接，达到了在降低颗粒细胞对卵母细胞成熟的抑制作用的同时，减少卵母细胞退化的效果。
3.本发明的一种未成熟卵母细胞的体外培养液，通过阶段性的添加所述丁内酯-Ⅰ，能够可逆性抑制卵母细胞核的成熟，从而人为增加胞质的成熟时间，达到了在不影响胞核成熟的条件下，使胞核和胞质同步成熟的效果。
4.本发明的一种未成熟卵母细胞的体外培养液，通过添加所述抗坏血酸，不仅能够还原胞内的活性氧(ROS)成分以降低其对细胞的伤害，还能够通过降低纺锤体的异常率以及DNA的损伤率以达到提高优质胚胎率的效果。
5.本发明的一种未成熟卵母细胞的体外培养液，能够增加卵母细胞内环磷酸腺苷的含量，从而促进胞质的成熟。
6.本发明的一种未成熟卵母细胞的体外培养液，能够促进胞质的代谢，并且增强胞质内线粒体、mRNA和蛋白质的储备。
7.本发明的一种未成熟卵母细胞的体外培养液，能够中和卵母细胞成熟过程中产生的毒性物质。
具体实施方式
下面进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
采用本发明的一种未成熟卵母细胞的体外培养液，实施以下5组实施例。
1.实施例1～5中体外培养液的组分及其含量(溶剂为超纯水)，如下表所示：
Figure BDA0002444331660000051
Figure BDA0002444331660000061
2.实施例1～5中体外培养液的制备方法，包括以下步骤：
S1.配制溶液I，包括以下步骤：
1)使配制所需器皿经过温度为250℃，时间30min的干热除热源；
2)在百级条件下，按配比称量氯化钙、氯化钾、硫酸镁、氯化钠、碳酸氢钠、水合磷酸二氢钠、精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、D-泛酸钙(B5)、氯化胆碱、叶酸(B9)、肌醇(B8)、烟酰胺(B3)、盐酸吡哆醛(B6)、核黄素(B2)、硫胺素(B1)、抗坏血酸(C)、D-葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠和庆大霉素，并加入水中混合均匀，得到溶液I；
S2.按配比称量人血白蛋白、丁内酯-Ⅰ(BL-I)、雌二醇、类胰岛素生长因子、表皮生长因子、促卵泡素、人绒毛膜促性腺激素和促黄体生成素，并加入溶液I中混合均匀，得到溶液Ⅱ；
S3.使用孔径为0.22μm的滤膜对溶液Ⅱ进行过滤除菌后，进行无菌分装，得到体外培养液；
其中，S1～S2中，环境温度均为18～26℃，环境湿度均为40％～60％。
对照例1
采用本发明实施例1中的体外培养液与对照例2进行对比，对照例2中的组合物为：丁内酯-Ⅰ、雌二醇、促卵泡素、促黄体生成素和人绒毛膜促性腺激素，其他条件如组分、用量、步骤和条件等与本发明实施例1均相同(本对照例相比于实施例1，组合物中不添加IGF和EGF，用于证明本发明的体外培养液的效果更好)。
对照例2
采用本发明实施例1中的体外培养液与对照例3进行对比，对照例3中的组合物为：丁内酯-Ⅰ、雌二醇、表皮生长因子和类胰岛素生长因子，其他条件如组分、用量、步骤和条件等与本发明实施例1均相同(本对照例相比于实施例1，组合物中不添加FSH、LH和hCG，用于证明本发明的体外培养液的效果更好)。
对照例3
采用本发明实施例1中的体外培养液与对照例4进行对比，对照例4中的组合物为：丁内酯-Ⅰ、促卵泡素、促黄体生成素、表皮生长因子、类胰岛素生长因子和人绒毛膜促性腺激素，其他条件如组分、用量、步骤和条件等与本发明实施例1均相同(本对照例相比于实施例1，组合物中不添加E2，用于证明本发明的体外培养液的效果更好)。
对照例4
采用本发明实施例1中的体外培养液与对照例5进行对比，对照例5中的葡萄糖为19mg/L，丙酮酸钠为4mg/L，其他条件如组分、用量、步骤和条件等与本发明实施例1均相同(本对照例相比于实施例1，葡萄糖和丙酮酸钠的浓度明显降低，用于证明本发明的体外培养液的效果更好)。
对照例5
采用本发明实施例1中的体外培养液与对照例6进行对比，对照例6中的葡萄糖为2020mg/L，丙酮酸钠为3600mg/L，其他条件如组分、用量、步骤和条件等与本发明实施例1均相同(本对照例相比于实施例1，葡萄糖和丙酮酸钠的浓度明显升高，用于证明本发明的体外培养液的效果更好)。
对照例6
采用本发明实施例1中的体外培养液与对照例7进行对比，对照例7中的维生素为D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素和硫胺素，其他条件如组分、用量、步骤和条件等与本发明实施例1均相同(本对照例相比于实施例1，维生素中不添加抗坏血酸，用于证明本发明的体外培养液的效果更好)。
对照例7
采用本发明实施例1中的体外培养液与对照例7进行对比，对照例7中的组合物为：雌二醇、促卵泡素、促黄体生成素、表皮生长因子、类胰岛素生长因子和人绒毛膜促性腺激素，其他条件如组分、用量、步骤和条件等与本发明实施例1均相同(本对照例相比于实施例1，组合物中不阶段性添加BL-I，用于证明本发明的体外培养液的效果更好)。
试验效果
1.为了验证本发明的体外培养液的效果，对实施例1～5以及对照例1～7所得的体外培养液进行了检测，检测项目包括pH值、渗透压、细菌内毒素和重金属含量，检测方法如下：
-pH值检测：取一定量成品用血气分析仪进行检测，记录三次的检测值并取平均值作为体外培养液的最终pH值，在7.00～7.40范围内为合格；
-渗透压检测：取25μL液体滴入0.5mL EP管，放入渗透压仪(冰点渗透压仪)探头等待检测值稳定，读出数值；同样方法检测三遍取平均值，即可得到该体外培养液的渗透压，在250～275mOsmol/kg范围内为合格；
-细菌内毒素检测：采用中国药典内毒素的检测方法中的鲎试剂动态显色法进行，判定为<0.2EU/mL合格；
-重金属含量检测：按照《中华人民共和国药典2015年版》中重金属测定方法进行重金属含量检测，判定为≤3μg/mL合格。
结果如下表所示
Figure BDA0002444331660000081
Figure BDA0002444331660000091
由上表可知，所有实施例和对照例的pH均在7.0～7.4之间，渗透压处于250～275mOsmol/kg，内毒素和重金属含量均不超标，符合卵母细胞发育环境的基本技术指标。
2.为了验证本发明的体外培养液对受精和囊胚形成的影响，对实施例1～5和对照组1～7的体外培养液进行了体外鼠胚试验，各组均包括以下步骤：
A1.超数排卵/取卵：选择6～8周龄雌鼠，经腹腔注射PMSG 10IU/只；48h后取小鼠卵巢，切碎后取得未成熟卵细胞，并置于预平衡(37℃、6％CO2、5％O2)过夜的未成熟卵母细胞的体外培养液中，培养24h，在期间观察并取出排除一极体的卵细胞，用于下述实验；
A2.小鼠取精/精子获能：通过手术从雄鼠附睾及输精管直接取精，将精子置于预平衡温度的缓冲液中，上游60min；
A3.体外受精/受精率：将排除一极体的卵母细胞置于预平衡(37℃、6％CO2、5％O2)的受精培养液中(10枚卵母细胞/微滴)，并添加获能后的精子使精子终浓度在2×105/mL～5×105/mL；精卵共孵育6～8h，完成受精工作；利用胚胎培养液清洗两次受精卵后，将受精卵清洗转移到事先平衡的新的胚胎培养液微滴中，于37℃、6％CO2、5％O2以及饱和湿度的培养箱中培养16h，直至2细胞期胚胎形成；对所有的卵子受精情况进行检测分析，发育至2细胞期的属于正常受精卵，停滞在1细胞期的属于未受精或受精失败的卵子，分析得出受精率；继续培养至96h，对形成囊胚的数量进行分析，得出2细胞囊胚形成率；
A4.体外培养/囊胚形成率：于37℃、6％CO2、5％O2以及饱和湿度的培养箱中培养继续培养正常受精的胚胎至96h囊胚期，对胚胎发育情况进行形态观察分析，得出囊胚形成率。
结果如下表所示：
Figure BDA0002444331660000092
Figure BDA0002444331660000101
由上表可知，与实施例1相比，对照例1～7的排除一极体卵数、成熟率、受精数、受精率、囊胚形成数和囊胚形成率均显著降低，这说明添加D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、硫胺素等维生素，以及丁内酯-Ⅰ、雌二醇、促卵泡素、促黄体生成素、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、人绒毛膜促性腺激素等物质能够提高未成熟卵母细胞的成熟率，并且能够使卵母细胞获得更好的后续发育能力，能够获得更高的囊胚形成率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于体外培养未成熟卵母细胞的组合物，其特征在于，包括丁内酯-Ⅰ、雌二醇、促卵泡素、促黄体生成素、表皮生长因子、类胰岛素生长因子和人绒毛膜促性腺激素。
2.一种未成熟卵母细胞的体外培养液，其特征在于，包括基本培养液和组合物，所述组合物包括丁内酯-Ⅰ0.01～1mg/L、雌二醇0.001～2mg/L、促卵泡素0.001～1IU/L、促黄体生成素0.001～1IU/L、表皮生长因子0.001～1IU/L、类胰岛素生长因子0.001～1mg/L和人绒毛膜促性腺激素0.001～1IU/L。
3.根据权利要求2所述的一种未成熟卵母细胞的体外培养液，其特征在于，还包括人血白蛋白4500～6500mg/L和庆大霉素6.0～15.0mg/L。
4.根据权利要求3所述的一种未成熟卵母细胞的体外培养液，其特征在于，所述基本培养液包括溶剂和溶质；所述溶剂包括水，所述溶质包括维生素、能量物质、无机盐和氨基酸。
5.根据权利要求4所述的一种未成熟卵母细胞的体外培养液，其特征在于，所述维生素包括D-泛酸钙0.01～1.5mg/L、氯化胆碱0.01～1.5mg/L、叶酸0.01～1.1mg/L、肌醇0.01～2.5mg/L、烟酰胺0.01～2.0mg/L、盐酸吡哆醛0.01～2.0mg/L、核黄素0.01～0.14mg/L、硫胺素0.01～1.1mg/L和抗坏血酸0.01～100mg/L。
6.根据权利要求4所述的一种未成熟卵母细胞的体外培养液，其特征在于，所述能量物质包括D-葡萄糖38～1010mg/L、丙酮酸钠8～1800mg/L和乳酸钠530～2200mg/L。
7.根据权利要求4所述的一种未成熟卵母细胞的体外培养液，其特征在于，所述无机盐包括氯化钙180～220mg/L、氯化钾370～420mg/L、硫酸镁90～495mg/L、氯化钠4900～6820mg/L、碳酸氢钠1230～2250mg/L和水合磷酸二氢钠0.1～130mg/L。
8.根据权利要求4所述的一种未成熟卵母细胞的体外培养液，其特征在于，所述氨基酸包括必需氨基酸80.7～436mg/L和非必需氨基酸62.61～976mg/L；
所述必需氨基酸包括异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸；
所述非必需氨基酸包括酪氨酸、精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、组氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸。
9.制备如权利要求4～8任一项所述的一种未成熟卵母细胞的体外培养液的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.在百级条件下，按配比称量所述无机盐、氨基酸、维生素、能量物质和庆大霉素，并加入水中混合均匀，得到溶液I；
S2.按配比称量所述人血白蛋白和组合物，并加入所述溶液I中混合均匀，得到溶液Ⅱ；
S3.所述溶液Ⅱ经灭菌和分装处理，得到所述体外培养液。
10.权利要求2～8任一项所述的一种未成熟卵母细胞的体外培养液在体外培养未成熟卵母细胞上的应用。
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