CN110951678A - 一种促进猪卵母细胞体外成熟的培养液 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进猪卵母细胞体外成熟的培养液，培养液以不含HEPES的M199培养液为基础培养液，还添加有猪卵泡液、L‑半胱氨酸、丙酮酸钠、表皮生长因子、胰岛素、促性腺激素、绒毛膜促性激素和WNT5A细胞因子。使用该培养液对猪卵母细胞进行体外培养，可有效提高卵母细胞体外成熟的效率和质量，由此获得的成熟卵母细胞进行猪体外受精和体细胞核移植胚胎的生产，其囊胚发育率和质量也得到显著提高。

Description

一种促进猪卵母细胞体外成熟的培养液
技术领域
本发明属于家畜胚胎工程领域，具体涉及一种促进猪卵母细胞体外成熟的培养液。
背景技术
体外受精和体细胞核移植技术是家畜胚胎工程领域最常见的两项技术，可应用于良种家畜扩繁、动物模型构建、转基因动物生产等方面。然而，通过上述技术获得的胚胎存在诸多发育问题，包括囊胚发育率低、内细胞团细胞数目少、动物出生效率低等。导致这些问题的一大原因是卵母细胞体外成熟的培养体系不能准确还原母体提供的微环境，致使体外成熟的卵母细胞在发育潜能上显著弱于体内成熟的卵母细胞。
目前，在培养液中添加母体分泌的胚胎因子可以达到提高卵母细胞体外成熟率和质量的目的，这些因子包括激素、生长因子、细胞因子和其他组分等。因此，添加何种胚胎因子能有效改善卵母细胞的体外成熟仍是本领域技术人员重要的研究方向之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进猪卵母细胞体外成熟的培养液，在培养液中添加WNT5A细胞因子可有效提高猪卵母细胞体外成熟的效率和质量，获得的猪成熟卵母细胞进行猪体外受精和体细胞核移植胚胎的生产，其囊胚发育率和质量也得到显著提高。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现：
一种促进猪卵母细胞体外成熟的培养液，该体外成熟培养液由不含HEPES的M199基础培养液及添加至该基础培养液中的猪卵泡液、L-半胱氨酸、丙酮酸钠、表皮生长因子、胰岛素、促性腺激素、绒毛膜促性激素和WNT5A组成。
猪卵泡液、促性腺激素、绒毛膜促性激素可提供卵母细胞及卵丘颗粒细胞在母体中生长的微环境和激素水平，对于卵母细胞由未成熟的GV期发育为成熟的MII期至关重要。
表皮生长因子能够促进卵丘颗粒细胞的增殖，并分泌利于卵母细胞成熟的细胞因子；胰岛素能维持细胞内物质代谢，提高对糖的利用率；L-半胱氨酸具有抗氧化作用，可防止细胞免受氧自由基的损害；丙酮酸钠为细胞生长提供碳源，是糖代谢的底物。
WNT5A为非典型WNT信号通路的细胞因子，在猪卵巢和输卵管组织中均有较高水平的表达，可通过与卵母细胞质膜上的FZD5受体结合，促进卵胞质内Ca2+释放并激活MAPK信号通路，从而促进猪卵母细胞体外成熟率和质量。
进一步，所述体外成熟培养液包括体积分数为10～15％的猪卵泡液、1～2mg/mL的L-半胱氨酸、0.22～0.44mg/mL的丙酮酸钠、5～10ng/mL的表皮生长因子、50～100ng/mL的胰岛素、5～10IU/mL的促性腺激素、5～10IU/mL的绒毛膜促性激素和25～50ng/mL的WNT5A。
优选地，所述体外成熟培养液包括体积分数为10％的猪卵泡液、1mg/mL的L-半胱氨酸、0.44mg/mL的丙酮酸钠、10ng/mL的表皮生长因子、50ng/mL的胰岛素、5IU/mL的促性腺激素、5IU/mL的绒毛膜促性激素和25ng/mL的WNT5A。
进一步，所述体外成熟培养液还包括11.3ng/mL的卡那霉素。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1.本发明提供的猪卵母细胞体外成熟培养液，通过添加WNT5A细胞因子，可有效促进猪卵母细胞体外成熟率和质量，成熟率提高超过10％。
2.由本发明提供的猪卵母细胞体外成熟培养液获得的成熟卵母细胞，进行体外受精和体细胞核移植胚胎的生产后，这两类胚胎的囊胚发育率和质量均得到显著提高。
附图说明
图1为具有不同第一极体外排和卵周隙形态的猪体外成熟卵母细胞，在培养液添加WNT5A和不添加WNT5A两者中的比例变化，红色箭头指向第一极体，比例尺为50μm。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
通过转录组数据分析我们发现，猪卵巢和输卵管组织中均有较高水平的WNT5A表达，而卵母细胞同时表达有WNT5A的受体蛋白FZD5，由此推测WNT5A可能在猪卵母细胞成熟过程中扮演着重要的角色。因此，为使猪卵母细胞体外成熟培养液的组分更趋向于母体微环境的成分，本发明通过人为添加WNT5A等因子来达到促进猪卵母细胞体外成熟率和质量的目的。
(一)试剂来源和制备
不含HEPES的M199基础培养液为赛默飞世尔科技公司的产品，WNT5A(鼠源)为默克密理博公司的产品，其他未注明的均为西格玛奥德里奇公司的产品。
a.猪卵泡液
猪的新鲜卵巢组织取自湖北省武汉市中粮肉食品有限公司(采集时间：2018年9月～2019年10月)，置于38℃生理盐水保温瓶中，4h内运至实验室。随后用装有12G针头的注射器抽吸卵巢表面2～8mm卵泡的卵泡液，并将卵泡液打入50mL离心管，放入38℃恒温箱，静置30min。卵丘颗粒细胞-卵母细胞复合体(COCs)会沉在离心管底部，取上层卵泡液3000rpm离心30min，再将上清液用0.22μm滤器过滤，获得无菌的猪卵泡液。
b.猪卵母细胞体外成熟培养液
含WNT5A的体外成熟培养液(处理组)：在不含HEPES的M199基础培养液中添加10％的猪卵泡液、1mg/mL的L-半胱氨酸、0.44mg/mL的丙酮酸钠、10ng/mL的表皮生长因子、50ng/mL的胰岛素、5IU/mL的促性腺激素、5IU/mL的绒毛膜促性激素、11.3ng/mL卡那霉素和不同浓度(1、5、10、25、50、100ng/mL)的WNT5A，随后的试验验证工作以添加25ng/mL的WNT5A作为处理组的一个实施例。
不含WNT5A的体外成熟培养液(对照组)：在不含HEPES的M199基础培养液中添加10％的猪卵泡液、1mg/mL的L-半胱氨酸、0.44mg/mL的丙酮酸钠、10ng/mL的表皮生长因子、50ng/mL的胰岛素、5IU/mL的促性腺激素、5IU/mL的绒毛膜促性激素和11.3ng/mL卡那霉素。
c.PZM3溶液
将3.156g的氯化钠、1.053g的碳酸氢钠、0.373g的氯化钾、0.024g的磷酸二氢钾、0.049g的七水合硫酸镁、0.308g的乳酸钙、0.011g的丙酮酸钠、0.073g的L-谷氨酰胺、0.273g的次牛磺酸、10mL的BME氨基酸溶液、5mL的MEM非必须氨基酸溶液、0.025g的庆大霉素、0.033g的青霉素、0.025g的链霉素和1.500g牛血清白蛋白溶于500mL的超纯水中，调pH至7.2～7.4，调渗透压至295～300mOsm。
d.PVA-TL HEPES溶液
将6.663g的氯化钠、0.237g的氯化钾、0.168g的碳酸氢钠、0.041g的磷酸二氢钠、1.868mL的乳酸钠、0.102g的六水合氯化镁、0.294g的二水合氯化钙、2.383g的HEPES、0.022g的丙酮酸钠、0.025g的庆大霉素、0.065g的青霉素、0.100g的聚乙烯醇、2.186g的山梨糖醇和0.010g的酚红溶于1L的超纯水中，调pH至7.2～7.4，调渗透压至295～300mOsm。
e.电融合液
电融合液的组分包括0.3mol/L的甘露醇、1mmol/L的二水合氯化钙、0.1mmol/L的六水合氯化镁、0.5mmol/L的HEPES，调pH至7.2～7.4。
f.mTBM溶液
将0.661g的氯化钠、0.224g的氯化钾、0.110g的二水合氯化钙、0.242的三氨基甲烷、0.198g的葡萄糖、0.055g的丙酮酸钠、0.067g的咖啡因和0.200g的牛血清白蛋白溶于100mL的超纯水中，调pH至7.2～7.4，调渗透压至295～300mOsm。
(二)猪卵母细胞的体外成熟培养
a.GV期卵母细胞的采集和培养
猪卵巢取自湖北省武汉市中粮肉食品有限公司(采集时间：2018年9月～2019年10月)，置于38℃生理盐水保温瓶中，4h内运至实验室。随后用装有12G针头的注射器抽吸卵巢表面2～8mm卵泡(GV期)的卵泡液，并将卵泡液打入50mL离心管，放入38℃恒温箱，静置30min。COCs会沉在离心管底部，倒掉上层卵泡液，加入等体积的PVA-TL HEPES溶液，颠倒重悬COCs后将液体倒入100mm培养皿中，以口径500μm的玻璃针在体视显微镜下挑选形态良好的COCs。
处理组：将含不同浓度WNT5A的体外成熟培养液加入四孔板中，每孔加500μL并覆盖石蜡油，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中预热5h。将COCs在含不同浓度WNT5A的体外成熟培养液中洗涤三次，然后移入含不同浓度WNT5A体外成熟培养液的四孔板中，每500μL放入50枚COCs，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养42h。
对照组：将不含WNT5A的体外成熟培养液加入四孔板中，每孔加500μL并覆盖石蜡油，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中预热5h。将COCs在不含WNT5A的体外成熟培养液中洗涤三次，然后移入不含WNT5A体外成熟培养液的四孔板中，每500μL放入50枚COCs，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养42h。
b.MII期卵母细胞的收集
取0.5mL离心管，加入400μL含0.1％(w/v)透明质酸酶的无HEPES M199基础培养液，随后将培养成熟的COCs放入离心管中，38.5℃消化5min，1000rpm离心1min。以口径200μm的玻璃针吸取离心管底部的COCs，在PVA-TL HEPES溶液中洗涤三次，充分脱去卵母细胞透明带上的卵丘颗粒细胞。最后在体视显微镜下用玻璃针吹吸卵母细胞，挑选排出第一极体的卵母细胞，即为成熟的MII期卵母细胞。以上方法在处理组和对照组中均适用。
试验结果：由表1可知，与对照组相比，含25～50ng/mL WNT5A的培养液能显著促进猪卵母细胞排出第一极体，获得成熟卵母细胞的效率提升超过10％。由图1可知，与对照组相比，含25ng/mL WNT5A的培养液能使第一极体完全排出且卵周隙扩大的猪成熟卵母细胞(Ⅲ类)比例明显提高超过20％。
表1添加不同浓度WNT5A的猪卵母细胞体外成熟培养液生产成熟卵母细胞的效率统计
Figure BDA0002339065990000051
注：每组实验都重复五次；成熟率以平均值±标准差形式展示；同一栏内数据，上标不同字母表示差异显著(P<0.05，单因素ANOVA方差分析)。
(三)猪体外受精胚胎的生产
a.猪冻精的解冻和稀释
在50mL离心管中加入25mL mTBM，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中预热24h。从液氮罐中取1支猪冻精(2018年10月购自百钧达科技发展有限公司)，50℃水浴16s解冻。再将精液注入10mL预热的mTBM溶液中，混匀后37℃水浴5min。随后1500rpm离心5min，弃上清。再加入100μL mTBM溶液重悬沉淀，做梯度稀释后用细胞计数板对精子密度进行统计，并将剩余的悬液稀释至精子密度为1×106个/mL，获得猪体外受精精液的工作液。
b.猪体外受精胚胎的制备
在60mm培养皿中做50μL mTBM液滴若干，覆盖石蜡油，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中预热24h。挑选处理组(含25ng/mL WNT5A)和对照组的成熟卵母细胞，分别在mTBM溶液中洗涤三次后，加入mTBM液滴中，每个液滴放入30枚卵母细胞。随后每个液滴再注入50μL体外受精精液的工作液，并在38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中放置4～6h，以达到精卵结合的目的。
c.猪体外受精胚胎的培养
在四孔板中加入PZM3溶液，每孔500μL，覆盖石蜡油，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中预热24h。受精结束后，以口径150μm的玻璃针吹吸受精卵，充分去除粘附在透明带上的精子。随后分别将处理组和对照组的受精卵放入PZM3中洗涤三次，再注入四孔板的PZM3溶液中，每孔放置30～50枚受精卵，并在38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养6天，于第6天统计囊胚发育率。
d.猪体外受精囊胚细胞数和内细胞团细胞数的检测
收集处理组和对照组发育至第6天的体外受精囊胚，通过免疫荧光染色技术标记囊胚的细胞核和内细胞团细胞，具体做法如下：将两组囊胚分别在固定液中室温静置30min，洗涤液洗涤三次，并移入透化液中室温静置30min。再次洗涤三次后，移入封闭液中室温静置2h，并直接移入含0.5％(v/v)SOX2抗体(内细胞团细胞的标记蛋白，抗体购自SantaCruz公司)的抗体稀释液中，4℃孵育24h。再次洗涤三次后，移入含0.1％(v/v)荧光二抗的抗体稀释液中，室温孵育1h。最后将囊胚放在滴有含DAPI(细胞核染液)封片液的载玻片上进行压片，并在荧光显微镜下统计囊胚细胞数(DAPI阳性着色细胞核数目)和内细胞团细胞数(SOX2阳性着色细胞核数目)。上述未注明出处的试剂均购自上海碧云天生物技术有限公司。
试验结果：由表2可知，与对照组相比，含25ng/mL WNT5A的培养液能明显促进猪体外受精胚胎发育为囊胚的效率，同时提高体外受精囊胚的细胞数和内细胞团细胞数，显示出囊胚整体发育质量的提升。
表2使用处理组和对照组的成熟卵母细胞获得体外受精囊胚的效率和细胞数统计
Figure BDA0002339065990000071
注：每组实验都重复三次；囊胚率和细胞数以平均值±标准差形式展示；同一栏内数据，上标不同字母表示差异显著(P<0.05，独立样本t检验)。
(四)猪体细胞核移植胚胎的生产
a.猪供体胎儿成纤维细胞的培养
从液氮罐中取1支5代以内的大白公猪胎儿成纤维细胞(2015年12月采自华中农业大学种猪测定中心)，38℃水浴解冻，加入1mL DMEM培养液混匀，1000rpm离心5min，弃上清。用4mL含10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，并均匀接种于24孔板中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。待成纤维细胞长满后，吸弃培养液，加入500μL含0.1％胎牛血清的DMEM培养液再次培养3天。使用前用500μL含0.25％(w/v)胰蛋白酶的PBS缓冲液消化细胞，待细胞变圆不再贴壁后，用500μL含10％胎牛血清的DMEM培养液终止消化，离心弃上清后获得体细胞核移植所用的供体细胞。
b.猪体细胞核移植胚胎的构建和激活
挑选处理组(含25ng/mL WNT5A)和对照组的成熟卵母细胞，分别放入含7.5μg/mL细胞松弛素B和10％(v/v)胎牛血清的M199培养液液滴中，随后在显微操作仪下采用盲吸法对卵母细胞进行去核操作，即用内径为25～30μm的玻璃针吸取第一极体及周围的卵胞质。随后将供体细胞注入上述液滴中，用玻璃针挑选直径为20～25μm的细胞注入去核卵母细胞的透明带下。注核后的体细胞核移植重构胚需在预热的PZM3溶液中静置20min，再进行供体细胞与卵胞质的电融合和激活操作。重构胚需在预热的电融合液中洗涤三次，再置于含电融合液的1mm宽电融合槽中，并将重构胚的供体细胞和去核卵母细胞膜接触面与两电极呈一条线排列。融合参数为电压1.2kV/cm，直流电电击2次，脉冲时间为30μs。
c.猪体细胞核移植胚胎的培养
在四孔板中加入PZM3溶液，每孔500μL，覆盖石蜡油，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中预热24h。两组重构胚进行电融合后，分别在PZM3溶液中洗涤三次并放入四孔板中静置1h，随后挑选成功融合的重构胚，移入新的含PZM3溶液的四孔板中。每孔放置30～50枚体细胞核移植重构胚，并在38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养6天，于第6天统计囊胚发育率。
d.猪体细胞核移植囊胚细胞数和内细胞团细胞数的检测
收集处理组和对照组发育至第6天的体细胞核移植囊胚，通过免疫荧光染色技术标记囊胚的细胞核和内细胞团细胞，具体做法与体外受精囊胚的检测步骤一致。
试验结果：由表3可知，与对照组相比，含25ng/mL WNT5A的培养液能明显提高猪体细胞核移植胚胎发育为囊胚的效率，同时提高体细胞核移植囊胚的细胞数，显示出囊胚整体发育质量的部分提升。
表3使用处理组和对照组的成熟卵母细胞获得体细胞核移植囊胚的效率和细胞数统计
Figure BDA0002339065990000081
注：每组实验都重复三次；囊胚率和细胞数以平均值±标准差形式展示；同一栏内数据，上标不同字母表示差异显著(P<0.05，独立样本t检验)。

Claims (3)

1.一种促进猪卵母细胞体外成熟的培养液，其特征在于，所述培养液以不含HEPES的M199培养液为基础培养液，添加体积分数为10～15%的猪卵泡液、1～2mg/mL的L-半胱氨酸、0.22～0.44mg/mL的丙酮酸钠、5～10ng/mL的表皮生长因子、50～100ng/mL的胰岛素、5～10IU/mL的促性腺激素、5～10IU/mL的绒毛膜促性激素和25～50ng/mL的WNT5A。
2.根据权利要求1所述的一种促进猪卵母细胞体外成熟的培养液，其特征在于，所述培养液包括体积分数为10%的猪卵泡液、1mg/mL的L-半胱氨酸、0.44mg/mL的丙酮酸钠、10ng/mL的表皮生长因子、50ng/mL的胰岛素、5IU/mL的促性腺激素、5IU/mL的绒毛膜促性激素和25ng/mL的WNT5A。
3.根据权利要求1或2所述的一种促进猪卵母细胞体外成熟的培养液，其特征在于，所述培养液还包括11.3ng/mL的卡那霉素。
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