CN113604427B - 一种含丙酮酸激酶的人卵母细胞体外成熟培养液及培养方法 - Google Patents

一种含丙酮酸激酶的人卵母细胞体外成熟培养液及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了M型丙酮酸激酶在人卵母细胞体外成熟培养液中的应用，以及一种人卵母细胞体外成熟培养液，所述培养液包括卵母细胞基础培养液、M型丙酮酸激酶、胰岛素样生长因子、性激素、表皮生长因子、抗生素和维生素E。本发明在基础培养基中添加了M型丙酮酸激酶(PKM1和PKM2)，通过PKM1与PKM2之间的特定比值使IGF‑1维持低水平，再结合胰岛素样生长因子、EGF、维生素E和性激素等因子，从而达到促进卵母细胞的细胞核与细胞质的同步成熟，同时还提高了胚胎的授精率和发育潜力，有助于优化IVM过程，适合在各级医院推广使用，具有广阔的应用前景。

Description

一种含丙酮酸激酶的人卵母细胞体外成熟培养液及培养方法
技术领域
本发明属于生殖医学技术领域，具体涉及一种含丙酮酸激酶的人卵母细胞体外成熟培养液及培养方法
背景技术
未成熟卵母细胞体外成熟培养(in vitro maturation，IVM)技术是辅助生殖技术的一种，它是通过模拟体内卵母细胞的成熟环境，在体外对未成熟卵母细胞进行培养，使其发育为成熟的第二次减数分裂中期(MII)的卵母细胞，具有受精、发育为正常胚胎的能力。随着IVM技术在辅助生殖技术领域里的应用和发展，使不孕的育龄妇女尤其是顽固的卵泡成熟障碍患者，获得妊娠。
目前商品化的人未成熟卵母细胞体外成熟培养液，虽然含有HCG和促性腺激素、雌二醇，FSH、胎牛血清、人血白蛋白等，模拟人卵母细胞体内成熟的环境，但是存在妊娠成功率低，质量不稳定，价格昂贵。国外有研究报道，在卵母细胞培养液中加上生长因子、胰岛素生长因子-1(IGF-1)和表皮生长因子(EGF)可以促进卵母细胞成熟(Jimenez CR,ReprodDomest Anim,2018,53(5):1103-1113)；但有学者发现加入以上生长因子仍没有解决卵母细胞核和细胞质同步成熟等问题(K,Reprod Biol.2014,14(2):122-7)；近期的研究提出，低浓度的IGF-1不能促进卵母细胞核的成熟，且高浓度IGF-1抑制卵母细胞成熟(Cardilli DJ,et al.Vet Med Sci.2021,7(1):46-56)。目前造成IVM技术不成熟的主要原因是培养未成熟卵母细胞的成熟液不够成熟，同时，未成熟卵细胞的成熟时间也不确定，因为IVM体外培养时间过长或过短均可能使卵母细胞错过最佳授精时间，从而影响授精及妊娠。因而，配制高质量未成熟卵母细胞的体外培养成熟液和合理的培养时间是本领域要解决的关键问题。
丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)能使磷酸烯醇式丙酮酸和ADP变为丙酮酸和ATP，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，有M型和L型两种同工酶，M型又有M1及M2亚型。M1分布于心肌、骨骼肌和脑组织；M2分布于脑及肝脏等组织。L型同工酶主要存在于肝、肾及红细胞内。目前尚未发现将PK应用于人卵母细胞体外成熟培养液中。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种适用于人卵母细胞体外成熟的培养液。该培养液中含有M型丙酮酸激酶，能够提高卵母细胞体外发育能力，使得卵母细胞核和细胞质同步成熟能够同时成熟。
本发明采用以下技术方案实现本发明的目的：
第一个方面，本发明提供了M型丙酮酸激酶在人卵母细胞体外成熟培养液中的应用。
优选地，所述M型丙酮酸激酶包括丙酮酸激酶M1型和丙酮酸激酶M2型。
PKM1和PKM2分别是丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)M型同工酶的两个亚型M1型和M2型。丙酮酸激酶亚型PKM2包含外显子10，在增殖细胞(包括癌细胞)中大量存在，并促进有氧糖酵解；丙酮酸激酶亚型M1-PK包含外显子9，在分化细胞中高表达，并促进氧化磷酸化。PKM1和PKM2分别是氧化磷酸化和有氧糖酵解的关键酶，是ATP生成所必需的。葡萄糖代谢水平是由它们的绝对水平和PKM1/PKM2的比值决定的。PKM1和PKM2的水平及其比值在不同的细胞和组织中存在差异，PKM1与PKM2的表达水平还随着发育和分化而变化。
第二个方面，本发明提供一种人卵母细胞体外成熟培养液，所述培养液包括卵母细胞基础培养液、M型丙酮酸激酶、胰岛素样生长因子、性激素、表皮生长因子、抗生素和维生素E。
PKM1和PKM2均存在于卵母细胞中，发明人发现PKM1可能通过调控一些生长因子从而影响卵母细胞的质量和成熟，例如胰岛素和胰岛素生长因子。与卵母细胞的ATP和能量代谢密切相关，通过有氧糖酵解途径以PKM1:PKM2的水平调控胰岛素和胰岛素生长因子的水平。
优选地，所述M型丙酮酸激酶包括丙酮酸激酶M1型和丙酮酸激酶M2型，以卵母细胞基础培养液为基准计，丙酮酸激酶M1型和丙酮酸激酶M2型质量浓度之比为PKM1:PKM＝5～60:1。经试验证实，当PKM1:PKM＝5～60:1时，使IGF-1维持低水平表达，从而达到促进卵母细胞的细胞核与细胞质的同步成熟。
优选地，以卵母细胞基础培养液为基准计，所述丙酮酸激酶M1型的质量浓度为50～300mg/ml，丙酮酸激酶M2型的质量浓度为10～50mg/ml。
优选地，所述胰岛素样生长因子包括胰岛素样生长因子-1和胰岛素样生长因子-2，以卵母细胞基础培养液为基准计，胰岛素样生长因子-1的质量浓度为10～50ng/ml，胰岛素样生长因子-2的质量浓度为20～80ng/ml。PKM1促进IGF-1在未卵母细胞体外成熟培养中，当IGF-1质量浓度为10～50ng/ml，胰岛素样生长因子-2的质量浓度为20～80ng/ml，为细胞提供低能量代谢、低氧和低糖水平环境，从而促进卵母细胞核成熟。
优选地，所述性激素包括促卵泡生成素、黄体生成素促黄体生成素、人绒毛膜促性腺激素和雌激素，以卵母细胞基础培养液为基准计，促卵泡生成素的浓度为50～300mIU/ml，黄体生成素促黄体生成素的浓度为50～300mIU/ml、人绒毛膜促性腺激素的浓度为50～500mIU/ml、雌激素的浓度为50～500mIU/ml。本发明在所述培养基中添加性激素的目的在于，一方面可以促使卵母细胞核和细胞质同步成熟，另一方面可以提高卵母细胞体外受精后的胚胎发育潜能。
所述抗生素包括青霉素和链霉素，以卵母细胞基础培养液为基准计，青霉素的浓度为100～200IU/ml，链霉素的浓度为100～200μg/ml。
优选地，以卵母细胞基础培养液为基准计，所述表皮生长因子的质量浓度为10～50ng/ml；所述维生素E的质量浓度为10～50μmol/L。本发明在所述培养基中添加维生素E的目的在于，维生素E能够促性腺激素增加，促进各阶段的卵泡发育，调整免疫细胞功能，减少外界环境带来的应激损伤，促进卵母细胞质的成熟。
优选地，所述培养基还包括胎牛血清和人血白蛋白，以卵母细胞基础培养液为基准计，胎牛血清的浓度为10～50ng/ml、人血白蛋白浓度为20～80ml。
第三个方面，本发明提供了一种人卵母细胞体外成熟培养方法，包括以下步骤：将处于第1次减数分裂中期的人未成熟卵母细胞移入含有本发明培养液的液滴中，置于37℃、5％CO2培养箱中，培养24～48小时，待未成熟卵母细胞有第一极体释放，表明未成熟卵母细胞已成熟。发明人经试验将处于生发泡期(germinalvesicle,GV)与第1次减数分裂中期(metaphase I,MI)的卵母细胞进行比较时，发现处于MI期的卵母细胞所需时间更短，成熟时间均为33.6±12.4h，较GV期的卵母细胞时间更短。
本发明的有益效果为：本发明在基础培养基中添加了M型丙酮酸激酶(PKM1和PKM2)，通过PKM1与PKM2之间的特定比值使IGF-1维持低水平，再结合胰岛素样生长因子、EGF、维生素E和性激素等因子，从而达到促进卵母细胞的细胞核与细胞质的同步成熟，同时还提高了胚胎的授精率和发育潜力，有助于优化IVM过程，适合在各级医院推广使用，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为人未成熟卵母细胞体外成熟培养及成熟卵母细胞经历各时期的变化流程图。
图2为GV期和MI期未成熟卵母细胞、MII期成熟卵母细胞和ICSI授精后2原核形成图(×200)A图为GV期未成熟卵母细胞，可见生发泡；B图为MI期未成熟卵母细胞，无生发泡和第一极体；C图为MII期卵母细胞，可见第一极体，体外培养后；D图为IVM成熟ICSI授精卵后2原核形成。
图3为成熟卵母细胞授精后经历授精卵(图3A)、2细胞期(图3B)、4细胞期(图3C)、8细胞早期(优质胚胎期，图3D)、8细胞后期桑椹胚早期(致密化形成，图3E)、囊胚期早期(图3F)、囊胚期后期(图3G)的变化过程示意图。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
本发明中的PKM1和PKM2均为美国Sigma公司的市售商品(PKM1货号9002-23-1，PKM2货号9001-59-6)。
本发明中的缩写具体代表的含义如下：
PKM1(丙酮酸激酶M1型)
PKM2(丙酮酸激酶M2型)
IGF-1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)胰岛素样生长因子-1
IGF-2(insulin-like growth factor 2,IGF-2)胰岛素样生长因子-2
EGF(Epidermal Growth Factor,EGF)表皮细胞生长因子
FSH(Follicle-stimulating hormone,FSH))促卵泡生成素
LH(Luteinizing hormone,LH)黄体生成素促黄体生成素
HCG(human chorionic gonadotropin,HCG)人绒毛膜促性腺激素
E2(Estrogen,E2)雌激素
实施例1
本实施例提供一种人卵母细胞体外成熟培养液，各个实施例培养基中的各组分的浓度如下(PKM1与PKM2的浓度比为5:1)：
表1：培养基中的各组分的浓度
组分 实施例1
PKM1(mg/ml) 50
PKM2(mg/ml) 10
IGF-1(ng/ml) 10
IGF-2(ng/ml) 20
FSH(mIU/ml) 50
LH(mIU/ml) 50
HCG(mIU/ml) 50
E2(mIU/ml) 50
青霉素(IU/ml) 100
链霉素(μg/ml) 100
EGF(ng/ml) 10
维生素E(μg/ml) 10
胎牛血清(ng/ml) 25
人血白蛋白(ml) 40
效果验证
试验一：验证本发明培养液对人类未成熟的卵母细胞体外成熟度以及卵母细胞受精情况的影响。以卵母细胞的成熟率(以含有第一极体的卵母细胞百分率代表)、授精率(以双原核卵母细胞占有第一极体卵母细胞的百分率代表)作为检测指标，具体如下：
步骤1：获取人类未成熟的卵母细胞
经患者同意，通过使用16G取卵针，在阴道B超引导下经阴道卵泡穿刺取卵术，采集并获得的未成熟卵子。
将穿刺获取的卵泡液倒入培养皿中，置于6X～12X的解剖显微镜下检卵，将所有获得的卵冠丘复合物置于8％透明质酸酶液(SAGE，美国)中脱颗粒，然后在倒置显微镜下通过对卵母细胞形态的观察，进行卵母细胞成熟度的分级，分为生发泡期(germinalvesicle,GV)，即第1次减数分裂前期双线期，胞浆中能见到生发泡；第1次减数分裂中期(metaphaseI,MI)，生发泡和第一极体；第2次减数分裂中期(metaphase II,MII)，可见第一极体，为成熟卵母细胞标志。GV期和MI期为未成熟卵，收集GV期和MI期的卵母细胞用于本发明的后续实验。
步骤2：未成熟的卵母细胞体外培养
将GV期(图2A)和MI期(图2B)未成熟卵母细胞移入实施例1的培养液液滴中，放入37℃、5％CO2培养箱，每4～6小时观察一次，培养液每24～48小时换一次。记录未成熟卵成熟的时间。每个滴液50μl，并用矿物油覆盖，所用液体均已在37℃、5％CO2培养箱中平衡过夜。在倒置显微镜下观察和确认经过培养后的卵子成熟情况，如有第一极体释放，说明卵子已经成熟(图2C)，随即将成熟卵细胞置于37℃、6％CO2饱和湿度的恒温培养箱中，择时以ICSI方式进行体外授精。
步骤2：成熟卵母细胞体外授精
将成熟卵子置于IVF-30培养液中培养4～6小时后，行胞浆内单精子注射(ICSI)。制成精液的微滴，精液密度为1×106/mL，每个微滴中加入1～2个成熟的卵母细胞，37℃、6％CO2饱和湿度的恒温培养箱中孵育16～20小时；授精后16～20小时观察原核。
实验结果：
未成熟卵母细胞培养后成熟率情况实验结果如表2所示，共获GV期卵96颗，经过成熟培养后有64颗成熟，成熟率为66.67％(64/96)；获MI期卵120颗，经过成熟培养后有95颗成熟，成熟率为79.17％(95/120)。比较GV期和MI期未成熟卵培养后的成熟率，比较差异有统计学意义(P<0.05)；与G-IVF对照组比较，比较差异有统计学意义(P<0.001)。G-IVF对照组的处理方法：周期前诊断测试在一个周期内刺激卵巢产生几个卵子，从每个卵巢取出卵子，通过常规方法在实验室中对卵进行受精。
表2：GV期和MI期未成熟卵培养后的成熟率
组别 获卵数(颗) 成熟数(颗) 成熟率*(100％)
G-IVF组 80 43 53.75％
GV期 96 78 81.25％*#
MI期 120 108 90.00％*
“*”表示P<0.001G-IVF组分别与GV期与MI期未成熟卵培养后的成熟率比较；“#”表示P<0.05GV期与MI期未成熟卵培养后的成熟率比较。
未成熟卵细胞培养后成熟时间实验结果如表3所示，GV期成熟时间为59.7±15.6小时，其中所观察到的成熟时间最短为42小时，最长为145小时；MI期成熟33.6±12.4小时，其中所观察到的成熟时间最短为22小时，最长为105小时。GV期和MI期未成熟卵培养后成熟时间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。
表3：GV期和MI期未成熟卵培养后的成熟时间统计
组别 成熟时间*(小时x±s) 最短时间 最长时间 最多时间
GV期 59.7±15.6 42 145 48
MI期 33.6±12.4 22 105 26
*P<0.05GV期与MI期未成熟卵培养后的成熟率比较
未成熟卵成熟时间与成熟卵数目：GV期卵细胞以48小时成熟数最多占20.83％(20/96)，成熟时间主要集中在43～56小时，占62.5％(60/96)；MI期卵细胞以26小时成熟数最多占31.67％(38/120)，成熟时间主要集中在22～34小时，占75.0％(90/120)。
未成熟卵母细胞培养成熟后授精、卵裂、优质胚胎形成情况如表4所示：GV期卵培养成熟后行ICSI，授精率为75.00％(72/96)，卵裂率为86.46％(83/96)，优质胚胎率为：62.5％(60/96)；MI期卵培养成熟后行ICSI，授精率为85.83％(103/120)，卵裂率为94.17％(113/120)，优质胚胎率为：76.67％(92/120)。GV期和MI期卵成熟后授精率、分裂率、优胚率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。
表4：GV期和MI期未成熟卵成熟后授精率、卵裂率、优质胚胎率比较
组别 授精数 授精率* 卵裂率* 优质胚胎率*
G-IVF组 80 68.75％(55/80) 60.00％(48//80) 30.00％(24/80)
GV期 96 86.46％(83/96) 75.00％(72/96) 62.5％(60/96)#
MI期 120 94.17％(113/120) 85.83％(103/120) 76.67％(92/120)
*P<0.001，G-IVF组与GV期与MI期未成熟卵培养后授精率、卵裂率、囊胚形成率比较；#P<0.05，GV期与MI期未成熟卵培养后授精率、卵裂率、囊胚形成率比较。
注：授精率以双原核卵母细胞占有第一极体卵母细胞的百分率代表；
卵裂率以卵裂数占有第一极体卵母细胞的百分率代表；
优质胚胎率以I+II级胚胎数占有胚胎总数的百分率代表；
目前以第一极体释放为卵母细胞核成熟的标志；
卵母细胞质是通过授精、卵裂以及胚胎发育情况来评价。
优质胚胎的评价：胚胎评分标准：I级，卵裂球均匀、无胞质碎片；II级，卵裂球均匀、胞质碎片<10％或卵裂球不均匀、无碎片；III级，卵裂球大小不均匀、胞质碎片10～20％；IV级，胞质碎片20～50％；V级，胞质碎片>50％。优质胚胎为I、II级胚胎。
实施例2
实施例2与实施例1的唯一区别在于，PKM1与PKM2的浓度比为10:1，PKM1与PKM2的浓度分别为100mg/ml、10mg/ml。
实施例3
实施例3与实施例1的唯一区别在于，PKM1与PKM2的浓度比为20:1，PKM1与PKM2的浓度分别为200mg/ml、10mg/ml。
实施例4
实施例4与实施例1的唯一区别在于，PKM1与PKM2的浓度比为30:1，PKM1与PKM2的浓度分别为300mg/ml、10mg/ml。
实施例5
实施例5与实施例1的唯一区别在于，PKM1与PKM2的浓度比为40:1，PKM1与PKM2的浓度分别为400mg/ml、10mg/ml。
实施例6
实施例6与实施例1的唯一区别在于，PKM1与PKM2的浓度比为50:1，PKM1与PKM2的浓度分别为500mg/ml、10mg/ml。
实施例7
实施例7与实施例1的唯一区别在于，PKM1与PKM2的浓度比为60:1，PKM1与PKM2的浓度分别为600mg/ml、10mg/ml。
对比例1
对比例1与实施例1的唯一区别在于，PKM1与PKM2的浓度比为3:1，PKM1与PKM2的浓度分别为30mg/ml、10mg/ml。
对比例2
对比例2与实施例1的唯一区别在于，PKM1与PKM2的浓度比为70:1，PKM1与PKM2的浓度分别为700mg/ml、10mg/ml。
对比例3
对比例3与实施例1的唯一区别在于，未添加PKM1，仅含有PKM2。
对比例4
对比例4与实施例1的唯一区别在于，未添加PKM2，仅含有PKM1。
对比例5
对比例5与实施例1的唯一区别在于，未添加PKM1、PKM2。
将上述实施例2～7和对比例1、2的培养基进行效果验证(采用试验一的方法)，结果如表5、6所示：
表5：MI期未成熟卵使用实施例1～7和对比例1～7培养液培养后的成熟率
组别 获卵数(颗) 成熟数(颗) 成熟率(100％)
实施例1 120 106 88.33％
实施例2 122 112 91.80％
实施例3 118 115 97.45％
实施例4 127 109 85.82％
实施例5 108 89 82.40％
实施例6 96 78 81.25％
实施例7 101 81 80.19％
对比例1 113 45 39.82％
对比例2 98 39 39.79％
对比例3 125 40 32.00％
对比例4 94 34 36.17％
对比例5 118 38 32.20％
对比例6 102 36 35.29％
对比例7 96 32 33.33％
由表5可以看出，其他组分保持不变时，PKM1与PKM2之间的浓度比值会影响MI期未成熟卵的成熟度，当PKM1与PKM2之间的浓度比值范围在5～60:1时，MI期未成熟卵的成熟率均在80％以上，而对比例1～7未在该范围之内其成熟率则低于50％，成熟情况较差。实施例1～7中PKM1与PKM2之间的浓度比值均在5～60:1范围内，则成熟情况良好。另外，对比例1～7中由于缺少PKM1或/和PKM2，MI期未成熟卵的成熟率较低，低于40％。由此，可见，在体外培养液中添加PKM1与PKM2，能提高未成熟卵的成熟率。
实施例8～11培养液中各组分的浓度如下表6
表6：实施例8～11培养基中的各组分的浓度
组分 实施例8 实施例9 实施例10 实施例11
PKM1(mg/ml) 200 200 200 200
PKM2(mg/ml) 10 10 10 10
IGF-1(ng/ml) 20 30 40 50
IGF-2(ng/ml) 40 60 70 80
FSH(mIU/ml) 100 150 280 300
LH(mIU/ml) 280 150 100 300
HCG(mIU/ml) 400 300 100 500
E2(mIU/ml) 100 250 400 500
青霉素(IU/ml) 120 150 180 200
链霉素(μg/ml) 170 140 120 200
EGF(ng/ml) 20 30 40 50
维生素E(μg/ml) 40 20 30 50
胎牛血清(ng/ml) 15 20 25 50
人血白蛋白(ml) 10 20 30 80
将实施例8～11的培养液用于培养MI期未成熟卵细胞的体外培养，结果如表7所示：
表7：MI期未成熟卵使用实施例8～11培养液培养后的成熟率
组别 获卵数(颗) 成熟数(颗) 成熟率(100％)
实施例8 105 94 89.52％
实施例9 130 119 91.53％
实施例10 126 120 95.23％
实施例11 108 95 87.96％
由表7可以看出，本发明实施例8～7的培养液也能提高MI期未成熟卵的成熟率。
实施例12
本实施例提供一种含丙酮酸激酶的人卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，具体步骤如下：在卵母细胞常规培养液中添加一定浓度的PKM1、PKM2、IGF-1、IGF-2、ECG、青霉素、链霉素、FSH、LH、HCG、E2、胎牛血清、人血白蛋白、维生素E，轻轻混匀，静置2～3小时后，用0.22μm的过滤器抽滤消毒后，分装到2ml离心管中，4℃下储存，备用。
实施例13
本实施例提供一种人卵母细胞体外成熟培养方法，包括以下步骤：将处于第1次减数分裂中期的人未成熟卵母细胞移入含有权利要求1～9任一项所述培养液的液滴中，置于37℃、5％CO2培养箱中，培养24～48小时，待未成熟卵母细胞有第一极体释放，表明未成熟卵母细胞已成熟。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种人卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述培养液包括卵母细胞基础培养液、M型丙酮酸激酶、胰岛素样生长因子、性激素、表皮生长因子、抗生素和维生素E；所述M型丙酮酸激酶包括丙酮酸激酶M1型和丙酮酸激酶M2型，以卵母细胞基础培养液为基准计，丙酮酸激酶M1型和丙酮酸激酶M2型质量浓度之比为PKM1:PKM=5~60:1；所述胰岛素样生长因子包括胰岛素样生长因子-1和胰岛素样生长因子-2；所述性激素包括促卵泡生成素、黄体生成素促黄体生成素、人绒毛膜促性腺激素和雌激素；所述抗生素包括青霉素和链霉素；所述培养基还包括胎牛血清和人血白蛋白。
2.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，以卵母细胞基础培养液为基准计，所述胰岛素样生长因子-1的质量浓度为10~50ng/ml，所述胰岛素样生长因子-2的质量浓度为20~80ng/ml。
3.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，以卵母细胞基础培养液为基准计，所述促卵泡生成素的浓度为50~300mIU/ml，所述黄体生成素促黄体生成素的浓度为50~300mIU/ml、所述人绒毛膜促性腺激素的浓度为50~500mIU/ml、所述雌激素的浓度为50~500mIU/ml。
4.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，以卵母细胞基础培养液为基准计，所述青霉素的浓度为100~200IU/ml，所述链霉素的浓度为100~200µg/ml。
5. 如权利要求1所述的培养液，其特征在于，以卵母细胞基础培养液为基准计，所述表皮生长因子的质量浓度为10~50ng/ml；所述维生素E的质量浓度为10～50μmol/L ；所述胎牛血清的浓度为10~50 ng/ml、所述人血白蛋白浓度为20~80 ml。
6.一种人卵母细胞体外成熟培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将处于第1次减数分裂中期的人未成熟卵母细胞移入含有权利要求1~5任一项所述培养液的液滴中，置于37℃、5%CO2培养箱中，培养24~48小时，待未成熟卵母细胞有第一极体释放，表明未成熟卵母细胞已成熟。
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The ubiquitin ligase KBTBD8 regulates PKM1 levels via Erk1/2 and Aurora A to ensure oocyte quality;Yan-Ru Li等;《Aging (Albany NY)》;20190220;第11卷(第4期);摘要、第1111页右栏第2段、图1以及补充图1 *

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