CN108118027B - 一种绵羊卵母细胞体外“双阶段”成熟方法及其预孵育液和试剂盒 - Google Patents
一种绵羊卵母细胞体外“双阶段”成熟方法及其预孵育液和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明“一种绵羊卵母细胞体外“双阶段”成熟方法及其预孵育液和试剂盒”，属于胚胎工程领域。所示预孵育液包括添加了C‑型钠肽和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的卵母细胞体外基础培养基TCM199。因此，本发明提供的C‑型钠肽预孵结合体外成熟的“双阶段”培养体系能够有效地促进绵羊卵母细胞核质同步成熟并提高卵母细胞体外发育能力，能够为绵羊体外胚胎生产提供优质的卵源和胚胎，更好的满足科研与生产的需要。
Description
技术领域
本发明涉及胚胎工程领域，具体涉及一种绵羊卵母细胞体外“双阶段”成熟方法及其预孵育液和试剂盒。
背景技术
绵羊卵母细胞体外成熟质量是影响体外受精、体外胚胎发育的一个关键因素，也是制约胚胎移植、胚胎干细胞以及转基因动物来源的主导因素，因此研究改善卵母细胞体外成熟体系成为提高卵母细胞质量的突破口。卵母细胞体外成熟历经一个多阶段、复杂、不连续的过程，涉及细胞核成熟、细胞质成熟以及颗粒细胞与卵母细胞相互作用的过程。
一直以来，研究者们都在尝试模拟卵母细胞生存和发育的生理内环境，改善卵母细胞体外成熟体系，为生产和科研提供优质卵源，进而提高胚胎体外生产效率。2008年，杨志杰等研究了在绵羊卵巢卵母细胞体外成熟基础培养液中添加不同浓度FCS对绵羊卵巢卵母细胞体外成熟培养及体外胚胎发育的影响，结果发现，在基础培养液中添加FCS可以显著提高卵母细胞的体外成熟率，而添加不同比例（10%、15%和20%）FCS对卵母细胞的成熟率的影响差异不显著。同时比较了体外不同的培养时间对绵羊卵母细胞的成熟的影响，并发现绵羊卵母细胞体外培养24 h和26 h成熟率(分别为73.3%和77.5%)显著高于体外培养18 h和20 h的卵母细胞成熟率(分别为62.5%和65.0%)，确定体外成熟的培养时间以24~26 h最佳。（杨志杰等.培养条件对绵羊卵巢卵母细胞体外成熟及受精的影响[J]. 甘肃农业大学学报，2008）。2010年，郭延华研究了在绵羊卵母细胞成熟液和胚胎发育液中添加100 ng/mlEGF，并通过比较极体排出率、胚胎发育能力及囊胚细胞数，结果发现，EGF对绵羊卵母细胞体外成熟和胚胎发育都有积极的影响。（郭延华. EGF对不同直径卵泡绵羊卵母细胞体外成熟、受精及胚胎发育的影响[J]. 石河子大学2010）。
张美佳等同年研究发现，小鼠的卵泡壁层颗粒细胞产生的生理性旁分泌因子C-型钠肽（C-type natriuretic peptide，CNP）通过作用于卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞的G蛋白偶联受体NPR2 (NPPC receptor 2, NPR2)，其受体NPR2主要在卵丘颗粒细胞上表达，激活鸟苷酸环化酶（guanosinecyclase, GC），引起cGMP合成量增加，cGMP通过卵丘细胞与卵母细胞之间的间隙连接转运至卵母细胞内抑制磷酸二酯酶3A（phosphodiesterase 3A，PDE3A）的活性，维持卵母细胞高水平的cAMP从而抑制卵母细胞减数分裂的恢复（MeijiaZhang, You-Qiang Su, Koji Sugiura, Guoliang Xia, and John J. Eppig. GranulosaCell Ligand NPPC and Its Receptor NPR2 Maintain Meiotic Arrest in MouseOocytes. Science. 2010）。2014年日本学者Hiradate等人在猪的卵丘卵母细胞复合体体外培养过程中，同样发现CNP抑制卵母细胞核减数分裂恢复过程中发挥了重要作用（Hiradate Y, Hoshino Y, Tanemura K, Sato E. C-type natriuretic peptideinhibits porcine oocyte meiotic resumption. Zygote. 2014）。然而，CNP对绵羊卵母细胞的影响和应用仍然未知。
绵羊卵母细胞常规体外成熟虽然能够使卵母细胞在体外环境下完成减数分裂，但很难达到核质同步成熟，影响体外胚胎生产效率。因此，核质同步成熟成为亟待解决的问题。为了更好的模拟体内环境，需要进一步优化绵羊卵母细胞体外成熟培养体系，更好的服务科研和生产需要。同时，在常规的卵母细胞体外培养过程中，大多采用3～6 mm的中等大小卵泡的卵母细胞进行试验或应用。而本领域公知：小卵泡的卵母细胞被认为是发育能力低、质量差的卵母细胞，很少在实验或生产中被应用，但在卵巢上具有大量的小卵泡，如何提高小卵泡中卵母细胞的体外发育能力，对于挖掘雌性动物的生殖潜力具有重要的意义，也是本领域现存的一项难题。
发明内容
为了解决本领域存在的上述问题，本发明基于C-型钠肽抑制卵母细胞减数分裂恢复的原理，本发明提供了一种通过延长胞质成熟时间，建立绵羊卵母细胞“双阶段”体外成熟系统（即使用所述的预孵育液对绵羊卵母细胞进行预孵育，然后添加促成熟合剂进行体外成熟培养）的方法，本发明的“双阶段”体外成熟系统促进绵羊卵母细胞核质趋于同步成熟，提高绵羊卵母细胞体外发育能力及其后期胚胎的质量。
本发明的技术方案如下：
本发明的第一方面提供一种用于绵羊卵母细胞体外成熟的预孵育液，其特征在于，包括添加了C-型钠肽和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的卵母细胞体外基础培养基TCM199。
进一步地，所述C-型钠肽在所述卵母细胞体外基础培养基TCM199中的终浓度为150 nM -200 nM；和/或，
所述聚乙烯吡咯烷酮（PVP）在所述卵母细胞体外基础培养基TCM199中的终浓度为0.5 mg/ml -1.0 mg/ml。
具体地，所述C-型钠肽在所述卵母细胞体外基础培养基TCM199中的终浓度选自下述浓度之一：150 nM、160 nM、170 nM、180 nM、190 nM、或200 nM；
和/或，
所述聚乙烯吡咯烷酮（PVP）在所述卵母细胞体外基础培养基TCM199中的终浓度选自下述浓度之一：0.5 mg/ml、0.6 mg/ml、0.7 mg/ml、0.8 mg/ml、0.9 mg/ml、1.0 mg/ml。
本发明的第2个方面提供一种用于绵羊卵母细胞体外成熟的试剂盒，包括所述的预孵育液。
进一步地，所述的试剂盒还包括用于绵羊卵母细胞体外成熟的常规试剂；例如，所述常规试剂为促成熟合剂；所述促成熟合剂包括体积比为20% 的FBS，0.2 IU/ml 的FSH，和0.1 IU/ml LH。
具体地，所述常规试剂还可以是常规体外成熟液；所述常规体外成熟液包括：TCM199、体积比为10%的FBS、 0.05IU/mlFSH、0.05IU/mlLH、1ug/ml E2、100 U /mL 青霉素、和100 U /mL 链霉素。
本发明的第3个方面提供一种绵羊卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，包括：采用所述的预孵育液对待处理细胞进行预孵育；和/或，采用所述的试剂盒对待处理细胞进行体外成熟处理。
在具体的实施例中，所述预孵育包括：将所述待处理细胞置于所述预孵育液中培养4h；预孵育的目的在于提高绵羊卵母细胞的胞质成熟的质量；
优选地，所述预孵育还包括：在进行所述培养4h之前，用所述预孵育液将所述待处理细胞清洗3次；这一步的作用是使培养的细胞更好适应预孵育液环境。
在进一步的实施例中，所述预孵育还包括：在进行所述培养4h之前，所述预孵育液预先在CO2培养箱中平衡2h以上；这一步的作用是使预孵育液的气体环境接近培养箱的气体环境。
进一步优选地，所述培养4h的培养条件为含5% CO2的空气，温度38.6℃，饱和湿度。
更进一步地，所述一种绵羊卵母细胞体外“双阶段”成熟方法还包括：在进行所述预孵育后，直接添加促成熟合剂进行体外成熟培养；促成熟合剂的作用是使卵母细胞恢复减数分裂过程，达到最后的核质同步成熟；
优选地，所述体外成熟培养时间为26h，培养条件为：培养环境为38.5℃，5% CO2：95% 空气、饱和湿度；
更优选地，所述促成熟合剂在添加前预先在CO2培养箱中平衡2 h以上；这一步的作用是使促成熟合剂的气体环境接近培养箱的气体环境；
进一步优选地，所述待处理细胞指胞质均匀、卵丘细胞比较完整的卵丘卵母细胞复合体。
本发明提供了一种用于抑制绵羊卵母细胞核减数分裂的C-型钠肽预孵育液。是在卵母细胞体外基础培养基TCM199中添加了终浓度为150-200nM CNP和0.5-1.0 mg/ml PVP。
本发明还提供了一种绵羊卵母细胞体外“双阶段”成熟的新方法。本发明利用所述的C-型钠肽预孵育液对绵羊卵母细胞进行预孵育4 h，然后添加促成熟合剂进行额外26 h体外成熟培养。这种方法能够延长细胞质成熟的时间，促进卵母细胞积累丰富的母源mRNA和蛋白质，尽可能达到核质同步成熟。
本发明的一些实施例中，所述预孵育的步骤具体为将包括将胞质均匀、卵丘细胞比较完整的卵丘卵母细胞复合体用所述C-型钠肽预孵育液清洗3次，然后放入预先在CO2培养箱中平衡2h以上的所述C-型钠肽预孵育液中培养4h；培养条件为：含5% CO2的空气，温度38.6℃，饱和湿度。所述体外成熟培养具体为将预先在CO2培养箱中平衡2 h以上的促成熟合剂直接加入预孵育液中进行额外26h成熟培养；培养环境为38.5℃，5% CO2：95% 空气、饱和湿度；所述促成熟合剂成分为：20% (v:v) FBS+0.2 IU/ml FSH＋0.1 IU/ml LH。
本发明中，所述C-型钠肽预孵育液能够抑制减数分裂提前恢复，相对延长了胞质成熟时间，促进卵母细胞母源mRNA和蛋白质的合成积累，在一定程度上促进了核质同步成熟，从而提高卵母细胞的体外成熟质量。
经体外胚胎生产实验数据表明，与常规的体外成熟方法相比，经本发明的体外“双阶段”成熟系统获得的胚胎囊胚率和囊胚质量都显著提高，并且本发明“双阶段”体外成熟系统能够显著提高小卵泡来源的卵母细胞发育能力，增加了绵羊卵巢上卵泡的利用效率。
综上所述，本发明利用C-型钠肽和PVP共同构建的体外“双阶段”成熟系统有效提高了绵羊卵母细胞体外发育能力。C-型钠肽作为一种生理性减数分裂抑制，与其他化学减数分裂抑制剂如，Roscovitine、次黄嘌呤、丁内酯Ⅰ、磷酸二酯酶３和６-DMAP相比，C-型钠肽对卵母细胞和胚胎无毒无害，安全有效，更有利于胚胎的健康发育，而且与常规“两步法”相比，本发明的方法不需要将卵丘卵母细胞复合体移出培养液滴，且具有操作简便、降低成本等优点。采用本发明CNP预孵育绵羊COCs 4 h然后体外成熟26 h的“双阶段”体外成熟系统，卵母细胞的成熟质量和后期胚胎的发育能力均获得显著提高，采用本发明“双阶段”体外成熟预孵育液、试剂盒或方法培养的囊胚发育率提高了至少约10-20%。更重要的是，本发明的“双阶段”成熟方法或预孵育液或试剂盒在提高小卵泡方面具有十分显著的提升体外发育能力的效果，可使卵泡直径<3.0 mm的小卵泡体外成熟的胚胎卵裂率、囊胚率分别达到71.94%和30.19%。因此，本发明“双阶段”体外成熟系统能够显著提高绵羊卵母细胞体外发育能力，有望在胚胎体外生产和科研中广泛使用，并在绵羊胚胎体外生产上具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但并不限制本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中使用的操作均为常规方法，所采用的试剂均可以商购获得。
主要仪器设备
CO2 培养箱、恒温台、体视显微镜、超净台。
主要试剂
FSH(Follicle stimulating hormone，促卵泡激素)、LH(Luteinizing hormone，黄体生成素)、E2(Estradiol，雌二醇)、FBS(Fetal bovine serum，胎牛血清)、TCM199、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、SOF培养液(配方见附表2)，所有试剂均购自Sigma 公司。
主要生物材料
绵羊卵母细胞来自屠宰场的卵巢。
第1组实施例、本发明的预孵育液
本组实施例提供一种用于绵羊卵母细胞体外成熟的预孵育液。本组所有的实施例都具有如下共同特征：所述预孵育液包括添加了C-型钠肽和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的卵母细胞体外基础培养基TCM199。
在一些具体的实施例中，所述C-型钠肽在所述卵母细胞体外基础培养基TCM199中的终浓度为150 nM -200 nM。
在另一些实施例中，所述聚乙烯吡咯烷酮（PVP）在所述卵母细胞体外基础培养基TCM199中的终浓度为0.5 mg/ml -1.0 mg/ml。
在进一步的实施例中，所述C-型钠肽在所述卵母细胞体外基础培养基TCM199中的终浓度选自下述浓度之一：150 nM、160 nM、170 nM、180 nM、190 nM、或200 nM；和/或，
在其它进一步的实施例中，所述聚乙烯吡咯烷酮（PVP）在所述卵母细胞体外基础培养基TCM199中的终浓度选自下述浓度之一：0.5 mg/ml、0.6 mg/ml、0.7 mg/ml、0.8 mg/ml、0.9 mg/ml、1.0 mg/ml。
在更具体的实施例中，所述孵育液的具体配方如下表1所示：
所述C-型钠肽指：C型利尿钠肽（C-type natriuretic peptide;CNP）或C型利钠肽，具有本领域技术人员常规理解的含义。
聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone, PVP）具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
具体的实施例中，所述卵母细胞体外基础培养基TCM199可以商购获得，例如，可以直接从Sigma或Gibco公司购买。
第2组实施例、本发明的试剂盒
本组实施例提供一种用于绵羊卵母细胞体外成熟的试剂盒。本组所有的实施例都具有如下共同特点：所述试剂盒包括第1组实施例任一所述的预孵育液。
在进一步的实施例中，所述试剂盒还包括用于绵羊卵母细胞体外成熟的常规试剂；例如，所述常规试剂为促成熟合剂；所述促成熟合剂包括体积比为20% 的FBS，0.2 IU/ml 的FSH，和0.1 IU/ml LH。
在本组具体的实施例中，所述常规试剂还可以是常规体外成熟液；所述常规体外成熟液包括：TCM199、体积比为10%的FBS、 0.05IU/mlFSH、0.05IU/mlLH、1ug/ml E2、100 U/mL 青霉素、和100 U /mL 链霉素。
第3组实施例、本发明的成熟方法
本组实施例提供一种绵羊卵母细胞体外“双阶段”成熟方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述成熟方法包括：采用第1组实施例任一所述的预孵育液对待处理细胞进行预孵育；和/或，采用第2组实施例任一所述的试剂盒对待处理细胞进行体外成熟处理。
在本组具体的实施例中，所述预孵育包括：将所述待处理细胞置于所述预孵育液中培养4h；预孵育的目的在于提高绵羊卵母细胞的胞质成熟的质量；
在本组优选的实施例中，所述预孵育还包括：在进行所述培养4h之前，用所述预孵育液将所述待处理细胞清洗3次；这一步的作用是使培养的细胞更好适应预孵育液环境。
在本组更优选的一些实施例中，所述预孵育还包括：在进行所述培养4h之前，所述预孵育液预先在CO2培养箱中平衡2h以上；这一步的作用是使预孵育液的气体环境接近培养箱的气体环境。
在进一步优选的实施例中，所述培养4h的培养条件为含5% CO2的空气，温度38.6℃，饱和湿度。
在更进一步的实施例中，所述成熟方法，还包括：在进行所述预孵育后，直接添加促成熟合剂进行体外成熟培养；促成熟合剂的作用是使卵母细胞恢复减数分裂过程，达到最后的核质同步成熟；
优选地，所述体外成熟培养时间为26h，培养条件为：培养环境为38.5℃，5% CO2：95% 空气、饱和湿度；
更优选地，所述促成熟合剂在添加前预先在CO2培养箱中平衡2 h以上；这一步的作用是使促成熟合剂的气体环境接近培养箱的气体环境；
进一步优选地，所述待处理细胞指胞质均匀、卵丘细胞比较完整的卵丘卵母细胞复合体。
实验例、本发明绵羊卵母细胞的体外成熟具体操作及效果验证
1.绵羊卵母细胞的成熟培养
绵羊卵母细胞经常规体外成熟和本发明提供的体外“双阶段”成熟，步骤如下：
1）常规体外成熟：
步骤1. 卵母细胞的采集：采用无菌10 mL注射器12#针头从卵巢表面抽取直径为3～6 mm的卵泡，采卵前需在注射器中预先抽取1~2mL采卵液，在体视显微镜下挑选出胞质均匀、卵丘细胞比较完整的卵丘卵母细胞复合体（Cumulus Oocyte Complexes，COCs）用于体外成熟（In Vitro Maturation，IVM）。
步骤2.卵母细胞成熟培养：挑选胞质均匀、卵丘细胞比较完整的卵丘卵母细胞复合体放入常规体外成熟液中（TCM199＋10%（v/v）FBS + 0.05IU/ml FSH＋0.05IU/ml LH＋1ug/ml E2+ 100 U /mL 青霉素+100 U /mL 链霉素）进行体外24 h成熟培养,培养密度为25枚/100uL。培养环境为38.5℃，5% CO2：95% 空气、饱和湿度。
2）“双阶段”成熟：卵母细胞的制备方法如下：
步骤1. 卵母细胞的采集：采用无菌10 mL注射器12#针头从卵巢表面抽取直径为3～6 mm的卵泡，采卵前需在注射器中预先抽取1~2mL采卵液，在体视显微镜下挑选出胞质均匀、卵丘细胞比较完整的卵丘卵母细胞复合体（Cumulus Oocyte Complexes，COCs）用于体外成熟（In Vitro Maturation，IVM）。
步骤2. CNP预孵育绵羊卵母细胞：将挑选的COCs用第1组实施例任一所述的预孵育液和/或第2组实施例任一所述的试剂盒中的预孵育液清洗2-3次，然后转入预先在 CO2培养箱中平衡2-4 h的所述预孵育液中孵育4 h，所述预孵育液的具体成分如上述实施例中的表1所示。
培养密度为25枚/50uL培养环境为38.5℃，5% CO2：95% 空气、饱和湿度。
步骤3. 卵母细胞的成熟培养：将预先在CO2培养箱中平衡2-4 h的促成熟合剂50uL直接添加到CNP预孵育液滴中，进行额外26 h的体外成熟培养，促成熟合剂成分为：20%(v:v) FBS+0.2 IU/ml FSH＋0.1 IU/ml LH。培养密度为25枚/100uL，培养环境为38.5℃，5% CO2：95% 空气、饱和湿度。
2. 绵羊卵母细胞的体外受精
将绵羊冻精在39℃下解冻，解冻后精液轻轻加入平衡2 h含有1ml上游液（受精液）的2个离心管底部，放入培养箱中上游45min后, 吸取上部精液移入1. 5 mL的离心管，以1400 r/ min 离心4 min，弃上清, 加入1 mL受精液再次离心，弃大部分上清，留约100 µL，将精液沉淀轻轻吹打混匀，进行精子计数，根据精子密度要求，将稀释好的精子混悬液加入受精液滴内与卵母细胞共同孵育。受精液为：SOF＋2％发情羊血清+6 IU/ml 肝素钠。
表2 SOF培养液的组成成分
在孵育精子的同时，将常规体外成熟和本发明提供体外“双阶段”成熟的卵母细胞分别在0.1％的透明质酸酶液中冲洗，以去除部分卵丘细胞。将卵母细胞用受精液洗涤3次，然后将20枚成熟卵母细胞放入50μl的受精液滴中。
3. 绵羊胚胎的体外培养
精卵共孵育20 h后，将受精卵移入胚胎培养液中，培养液为SOF+BSA，将50枚受精卵移入500μl培养液的四孔培养板中，培养条件为5%CO2，5% O2，90%N2，温度为38.6℃。受精后48 h和144 h分别检查胚胎的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞核DNA碎片化程度。结果详见表2。
4. 囊胚质量检测
为了评估囊胚质量，本发明比较了两种成熟方法来源的卵母细胞获得囊胚DNA碎片段的存在。将“双阶段”体外成熟，即CNP预孵育4 h然后体外成熟26 h的卵母细胞获得囊胚和常规24 h成熟卵母细胞获得囊胚分别进行TUNEL和PI染色共染。结果详见表3。
表3.本发明预孵育液对绵羊卵母细胞成熟受精后的胚胎发育能力及囊胚发育质量的影响
注：表中同列数据A,B表示差异极显著（P<0.01）;a,b表示差异显著（P<0.05）
由表2可知，本发明CNP预孵育COCs 4 h然后体外成熟26 h的“双阶段”体外成熟系统体外胚胎的囊胚率（58.91%）显著高于（P<0.05）常规成熟24 h体外成熟获得的胚胎（34.52%）；“双阶段”体外成熟系统体外胚胎的卵裂率（96.31%）显著高于常规成熟组的（82.62%，P<0.05）。此外，由表2可知，本发明CNP预孵育COCs 4 h然后体外成熟26 h的“双阶段”体外成熟系统体外囊胚细胞核DNA碎片化（6.19 %）极显著低于（P<0.01）常规成熟24 h体外成熟获得的囊胚（16.27%）。提示经“双阶段”体外成熟系统培养的绵羊卵母细胞具有较强的发育能力。
采用表1中任一组配方的预孵育液处理得到的绵羊卵母细胞的胚胎发育能力及囊胚发育质量都能获得与表3所示数据类似的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞核DNA碎片化率，每组数值之间上下相差不超过0.1，为节约本文篇幅，在此不再一一赘述。
5．“双阶段”成熟方法提高了小卵泡来源卵母细胞的体外发育能力
在本案例中我们也采取了卵泡直径<3.0 mm小卵泡中的卵母细胞进行培养，卵母细胞的制备方法为同实验例2中的步骤1~3。绵羊卵母细胞体外受精与体外培养方法同实验例2中的2~3。实验结果见表3。
表4. 本发明“双阶段”成熟方法对小卵泡来源COCs体外发育能力的影响
注：表中同列数据不同上标表示差异显著（P<0.05）
由表4可知，本发明CNP预孵育COCs 4 h然后体外成熟26 h的“双阶段”体外成熟系统培养小卵泡（<3.0 mm）来源卵母细胞获得的胚胎卵裂率、囊胚率（分别为71.94%和30.19%）显著高于（P<0.05）常规成熟24 h组小卵泡来源卵母细胞获得的胚胎卵裂率和囊胚率（分别为59.62%和19.68%）。对小卵泡来源的卵母细胞的体外发育有明显的促进作用。
采用表1中任一组配方的预孵育液处理得到的小卵泡，各项胚胎发育能力相关指标都能获得如表4所示数据类似的卵裂率、囊胚率，每组数值之间上下相差不超过0.1，为节约本文篇幅，在此不再一一赘述。
Claims (10)
1.一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，包括：采用用于绵羊卵母细胞体外成熟的试剂盒对待处理细胞进行预孵育和体外成熟培养；所述用于绵羊卵母细胞体外成熟的试剂盒包括预孵育液和用于绵羊卵母细胞体外成熟的常规试剂；所述预孵育液为添加了终浓度为150 nM -200 nM的C-型钠肽和终浓度为0.5 mg/ml -1.0 mg/ml的聚乙烯吡咯烷酮的卵母细胞体外基础培养基TCM199；
所述预孵育包括：将所述待处理细胞置于所述预孵育液中培养4h；所述体外成熟培养时间为26h，培养条件为：培养环境为38.5℃，5% CO2：95% 空气、饱和湿度；
所述绵羊小卵泡卵母细胞为卵泡直径<3 .0mm小卵泡中的卵母细胞。
2.根据权利要求1所述的一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，其特征在于，所述C-型钠肽在所述卵母细胞体外基础培养基TCM199中的终浓度选自下述浓度之一：150 nM、160 nM、170 nM、180 nM、190 nM、或200 nM；
所述聚乙烯吡咯烷酮在所述卵母细胞体外基础培养基TCM199中的终浓度选自下述浓度之一：0.5 mg/ml、0.6 mg/ml、0.7 mg/ml、0.8 mg/ml、0.9 mg/ml、1.0 mg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，其特征在于，所述常规试剂为促成熟合剂；所述促成熟合剂包括体积比为20% 的FBS，0.2 IU/ml 的FSH，和0.1 IU/ml LH。
4.根据权利要求1所述的一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，其特征在于，所述常规试剂还可以是常规体外成熟液；所述常规体外成熟液包括：TCM199、体积比为10%的FBS、0.05IU/ml FSH、0.05IU/ml LH、1ug/ml E2、100 U /mL 青霉素、和100 U /mL 链霉素。
5.根据权利要求1所述的一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，其中，所述预孵育还包括：在进行所述培养4h之前，用所述预孵育液将所述待处理细胞清洗3次。
6.根据权利要求5所述的一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，所述预孵育还包括：在进行所述培养4h之前，所述预孵育液预先在CO2培养箱中平衡2h以上。
7.根据权利要求5所述的一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，其特征在于，所述培养4h的培养条件为含5% CO2的空气，温度38.6℃，饱和湿度。
8.根据权利要求1-3、5-7任一所述的一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，其特征在于，还包括：在进行所述预孵育后，直接添加促成熟合剂进行体外成熟培养。
9.根据权利要求8所述的一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，其特征在于，所述促成熟合剂在添加前预先在CO2培养箱中平衡2 h以上。
10.根据权利要求1所述的一种绵羊小卵泡卵母细胞体外“双阶段”成熟方法，其特征在于，所述待处理细胞指胞质均匀、卵丘细胞比较完整的卵丘卵母细胞复合体。
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Citations (5)
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|---|---|---|---|---|
| JP2004173635A (ja) * | 2002-11-28 | 2004-06-24 | National Agriculture & Bio-Oriented Research Organization | 卵母細胞の培養方法及び発育方法 |
| WO2008100424A2 (en) * | 2007-02-09 | 2008-08-21 | University Of Hawaii | Animals and cells with genomic target sites for transposase-mediated transgenesis |
| CN102899286A (zh) * | 2012-09-18 | 2013-01-30 | 中国农业大学 | C型钠肽在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用 |
| CN103923878A (zh) * | 2013-01-15 | 2014-07-16 | 河北农业大学 | 一种绵羊卵母细胞体外成熟培养方法 |
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| Effects of synthetic polymers on in vitro maturation of sheep oocytes and subsequent developmental capacity after parthenogenetic activation or fertilization;Guo Bo Quan等;《Small Ruminant Research》;20170610;第153-157页 * |
| 褪黑素和CNP对绵羊卵母细胞体外成熟的影响及过表达AANAT的研究;田秀芝;《中国博士学位论文全文数据库》;20170815(第08期);第D050-22页 * |
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