CN113025564A - 一种卵母细胞体外成熟培养液的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，包括以下步骤：(1)用PBS制备200mmol/L的肌肽溶液；(2)将步骤(1)中的肌肽溶液加入IVM未成熟卵培养液中，形成体外成熟培养液；(3)将步骤(2)所得的体外成熟培养液通过20‑25μm的滤膜进行过滤，最终得卵母细胞体外成熟培养液。肌肽能够有效促进未成熟卵母细胞的体外成熟及提高卵母细胞的质量。

Description

一种卵母细胞体外成熟培养液的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种卵母细胞体外成熟培养液的制备方法。
背景技术
卵母细胞体外成熟技术(in vitro maturation,IVM)是一项新的辅助生育技术，不经超促排卵或少量应用促性腺激素后从卵巢中获取未成熟卵，在体外经过适宜的条件进行成熟培养，使卵子成熟并具备受精能力。卵母细胞IVM技术不但能充分利用体外受精/胞浆内单精子注射(in vitro fertilization /intracytoplasmic sperm injection,IVF/ICSI)周期中的未成熟卵母细胞，而且能降低促性腺激素对卵巢的过度刺激，减少卵巢过度刺激综合征的发生，还能为年轻女性癌症患者提供生育保险，具有很好的发展前景。IVM作为一种有效治疗手段可应用于治疗多囊卵巢综合征、卵巢高反应及低反应患者、癌症患者生育力保存等,该技术已在全世界应用并有数千名健康婴儿出生。但IVM中卵母细胞的成熟率仍然较低，报道在40％-70％之间，受精率也不高，形成的胚胎发育潜能差，这些都是IVM妊娠成功率较常规IVF-ET技术低的重要原因。因此如何提高卵母细胞的体外成熟率及受精率，改善胚胎的发育潜能，成为困扰生殖医学界的大难题。
肌肽(carnosine)是由β-丙氨酸和L-组氨酸组成的天然二肽化合物，在哺乳动物体内广泛分布，如脑，骨骼肌，肝脏，肾脏等，浓度高达5-20mM。肌肽具有多种生物学功能，比如：抗氧化，抗糖基化，抗炎症，螯合金属离子，调节PH值。研究发现，肌肽对于阿兹海默症、帕金森综合症、高血压、糖尿病和脑中风均有治疗效果。近年来，研究发现肌肽还具有抗肿瘤的作用，目前报道过的有胃腺癌、人恶性胶质瘤、结肠癌、乳腺癌等。目前尚未有研究证明肌肽是否能改善卵母细胞体外成熟的结局。
发明内容
本申请提供一种卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，可以得到肌肽能改善卵母细胞体外成熟的结局。
本发明的技术是这样实现的：
一种卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，包括以下步骤：
(1)用PBS制备200mmol/L的肌肽溶液；
(2)将步骤(1)中的肌肽溶液加入IVM未成熟卵培养液中，形成体外成熟培养液；
(3)将步骤(2)所得的体外成熟培养液通过20-25μm的滤膜进行过滤，最终得卵母细胞体外成熟培养液。
进一步设置，步骤(2)中所述体外成熟培养液中肌肽浓度为30～200μ mol/L。
进一步设置，所述体外成熟培养液中肌肽浓度为100μmol/L。
进一步设置，步骤(2)中所述IVM未成熟卵培养液的基础培养液为ɑ -MEM培养液，含有5％胎牛血清、3ng/mL表皮生长因子、50mIU/mL重组卵泡刺激素、0.25mmol/L丙酮酸钠、0.5％青霉素、0.5％链霉素。
进一步设置，步骤(3)所述用滤膜孔径为22μm。
本发明的有益效果：肌肽能够有效促进小鼠未成熟卵母细胞的体外成熟及提高卵母细胞的质量，作用机制是通过降低ROS水平，提高抗氧化能力，改善线粒体的分布来提高卵母细胞质量的。因此，肌肽可以在制备促进卵母细胞成熟及提高卵母细胞发育潜能的药物、制备培养液中应用。
附图说明
图1为挑选可用小鼠卵母细胞和卵母细胞体外成熟情况；
图2为两组卵母细胞的ROS水平；
图3为两组卵母细胞的ROS荧光强度；
图4为两组单个卵母细胞的T-GSH浓度；
图5为两组卵母细胞的线粒体分布情况；
图6为两组卵母细胞的线粒体荧光强度。
具体实施方式
为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。
一种卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，包括以下步骤：
(1)用PBS制备200mmol/L的肌肽溶液；
(2)将步骤(1)中的肌肽溶液加入IVM未成熟卵培养液中，形成体外成熟培养液；肌肽浓度为30～200μmol/L，优选100μmol/L。其中还，所述 IVM未成熟卵培养液的基础培养液为ɑ-MEM培养液，含有5％胎牛血清、3 ng/mL表皮生长因子、50mIU/mL重组卵泡刺激素、0.25mmol/L丙酮酸钠、0.5％青霉素、0.5％链霉素。
(3)将步骤(2)所得的体外成熟培养液通过20-25μm的滤膜进行过滤，优选，滤膜孔径为22μm，最终得卵母细胞体外成熟培养液。
进一步设置，步骤(2)中所述体外成熟培养液中肌肽浓度为30～200μ mol/L。
进一步设置，所述体外成熟培养液中肌肽浓度为100μmol/L。
进一步设置，步骤(2)中所述IVM未成熟卵培养液的基础培养液为ɑ -MEM培养液，含有5％胎牛血清、3ng/mL表皮生长因子、50mIU/mL重组卵泡刺激素、0.25mmol/L丙酮酸钠、0.5％青霉素、0.5％链霉素。
进一步设置，步骤(3)所述用滤膜孔径为22μm。
实施例1
(1)不同浓度肌肽对卵母细胞体外成熟的影响。
将孕马血清促性腺激素腹腔注射雌性昆明小鼠进行促排，10IU/只，2d后取出卵巢，用透明质酸酶进行消化，分离出卵母细胞，挑选GV期卵母细胞作为实验材料(见图1)。将GV期卵母细胞加入含0、10、30、50、100和200 μmol/L浓度肌肽的IVM培养液中进行处理，置于37℃二氧化碳培养箱中培养24h，观察并统计卵母细胞卵周间隙和第一极体排出情况，筛选出对未成熟卵母细胞促进体外成熟的最优肌肽浓度。
由表1可知，GV期卵母细胞在对照组(不含肌肽)中体外成熟率为44.44％， 10μmol/L肌肽组为51.55％，与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。30、50、 100和200μmol/L肌肽组GV期卵母细胞的体外成熟率均显著高于对照组 (P<0.05)。与10μmol/L肌肽组相比，仅100μmol/L肌肽组差异具有统计学意义(P<0.05)。表明添加100μmol/L肌肽的IVM培养液是促进卵母细胞体外成熟的最适浓度。
表1不同浓度肌肽对小鼠卵母细胞体外成熟的影响
Figure 554852DEST_PATH_IMAGE001
注：与0μmol/L肌肽相比，*P<0.05；与10μmol/L肌肽相比，#P<0.05。
实施例2
(2)检测卵母细胞内活性氧水平和总谷胱甘肽的含量。
①活性氧染色
GV期卵母细胞在100μmol/L肌肽和无肌肽IVM培养液中体外培养成熟后，用DCFH-DA避光孵育30min，孵育后用无血清培养液洗涤充分去除未进入细胞的DCFH-DA。将细胞转移至培养液微滴中，激光共聚焦显微镜观察并拍照。
由图2可知，对照组卵母细胞中的ROS水平高于肌肽组，对两组的平均 ROS荧光信号强度比较发现，见图3(与Control组比较，**P<0.01)，对照组的ROS约为肌肽组的2.04倍，差异具有极显著统计学意义(P<0.01)。
②总谷胱甘肽的测定
GV期卵母细胞在100μmol/L肌肽和无肌肽IVM培养液中体外培养成熟后，用总谷胱甘肽(T-GSH)/氧化型谷胱甘肽(GSSG)测定试剂盒(南京建成)对总谷胱甘肽进行测定。
对单个卵母细胞的总谷胱甘肽测定结果表明，见图4(与Control组比较， **P<0.01)，肌肽组为0.61±0.02mol/L，对照组仅0.39±0.02mol/L，肌肽组是对照组的1.56倍，差异具有极显著统计学意义(P<0.01)。
实施例3
(3)利用免疫荧光技术检测卵母细胞内超微结构的改变。
①皮质颗粒的分布
GV期卵母细胞在100μmol/L肌肽和无肌肽IVM培养液中体外培养成熟后，卵母细胞在含4％多聚甲醛的PBS中固定，用封闭液洗涤，再在含0.1％ TritonX-100的PBS中渗透，渗透后用封闭液洗涤，用FITC-PNA避光孵育30 min，孵育后洗涤，将卵母细胞的位置固定并封片。激光共聚焦显微镜观察并拍照。
由表2可知，肌肽组的皮质颗粒III级的比例高达98.18％，高于对照组的84.55％，且差异具有极显著的统计学意义(P<0.01)。III级说明皮质颗粒已完成迁移，或者说皮质颗粒已释放。
表2两组卵母细胞皮质颗粒的分布情况
Figure 347358DEST_PATH_IMAGE002
注：与Control比较，**P<0.01。
②线粒体分布定位
GV期卵母细胞在100μmol/L肌肽和无肌肽IVM培养液中体外培养成熟后，用MitoTracker Red避光孵育30min，染色后加入PBS洗涤。4％多聚甲醛室温固定20min。激光扫描共聚焦显微镜下648nm处，1000倍油镜下观察线粒体定位情况并拍照。
两组卵母细胞的线粒体分布均以均匀分布为主，见图5，其中肌肽组卵母细胞的胞质中央区域荧光强度高于周边区域，表明线粒体在胞质中央区域浓集，与体内成熟的卵母细胞相似，且肌肽组的荧光强度高于显著高于对照组 (P<0.05，图6，与Control组比较，*P<0.05)。
结论：以上结果可知肌肽能够有效促进未成熟卵母细胞的体外成熟及提高卵母细胞的质量，作用机制是通过降低ROS水平，提高抗氧化能力，改善线粒体的分布来提高卵母细胞质量的。因此，肌肽可以在制备促进卵母细胞成熟及提高卵母细胞发育潜能的药物、制备培养液中应用。

Claims (5)

1.一种卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用PBS制备200mmol/L的肌肽溶液；
(2)将步骤(1)中的肌肽溶液加入IVM未成熟卵培养液中，形成体外成熟培养液；
(3)将步骤(2)所得的体外成熟培养液通过20-25μm的滤膜进行过滤，最终得卵母细胞体外成熟培养液。
2.根据权利要求1中一种卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述体外成熟培养液中肌肽浓度为30～200μmol/L。
3.根据权利要求2中一种卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，其特征在于，所述体外成熟培养液中肌肽浓度为100μmol/L。
4.根据权利要求1中一种卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述IVM未成熟卵培养液的基础培养液为ɑ-MEM培养液，含有5％胎牛血清、3ng/mL表皮生长因子、50mIU/mL重组卵泡刺激素、0.25mmol/L丙酮酸钠、0.5％青霉素、0.5％链霉素。
5.根据权利要求1中一种卵母细胞体外成熟培养液的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述用滤膜孔径为22μm。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020127669A1 (en) * 2000-05-31 2002-09-12 Knipp Gregory T. Novel compositions for the expression of the human peptide histidine transporter 1 and methods of use thereof
CN101790306A (zh) * 2007-02-17 2010-07-28 哈佛学院董事会 用于进行组织保存的组合物以及方法
US20130029368A1 (en) * 2011-07-29 2013-01-31 Steven Kattman Metabolic maturation in stem cell-derived tissue cells
CN104928236A (zh) * 2015-07-06 2015-09-23 中国农业科学院特产研究所 一种卵母细胞体外成熟培养液及培养方法
CN111518749A (zh) * 2020-04-09 2020-08-11 成都艾伟孚生物科技有限公司 一种未成熟卵母细胞的体外培养液及其制备方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020127669A1 (en) * 2000-05-31 2002-09-12 Knipp Gregory T. Novel compositions for the expression of the human peptide histidine transporter 1 and methods of use thereof
CN101790306A (zh) * 2007-02-17 2010-07-28 哈佛学院董事会 用于进行组织保存的组合物以及方法
US20130029368A1 (en) * 2011-07-29 2013-01-31 Steven Kattman Metabolic maturation in stem cell-derived tissue cells
CN104928236A (zh) * 2015-07-06 2015-09-23 中国农业科学院特产研究所 一种卵母细胞体外成熟培养液及培养方法
CN111518749A (zh) * 2020-04-09 2020-08-11 成都艾伟孚生物科技有限公司 一种未成熟卵母细胞的体外培养液及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAROLINA CAMARGO ROCHA等: "Carnosine as malondialdehyde scavenger in stallion seminal plasma and its role in sperm function and oxidative status", 《THERIOGENOLOGY》 *
包云等: "改善卵母细胞体外成熟结局的研究进展", 《医药前沿》 *

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