CN111088221B - 促进精子激活的组合物和一种精子激活液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及辅助生殖领域，公开了促进精子激活的组合物及一种精子激活液，所述精子激活液包括基本培养液和组合物，所述组合物包括ATP钠盐2～10mg/L、肝素5～15U/mL、黏着斑蛋白5～10μg/mL、丙二烯氧化物合酶1～2.5μg/mL、乙酰辅酶A乙酰基转移酶2 4～4.5μg/mL、膦脂酰丝氨酸0.9～1.1mmol/L、辅酶Q10 5.5～10.5μg/mL、亚麻酸3.5～6.5ng/mL和重组热休克蛋白HSPA8 0.45～0.5μg/mL；本发明还公开了该精子激活液的制备方法；本发明的精子激活液，能够极大地缩短精子注射和卵子体外操作的时间，提高受精率和囊胚形成率，直接或间接地提高妊娠率；同时，该精子激活液有效适用于体外受精辅助生殖技术中的卵母细胞胞浆内单精子显微注射技术(ICSI)和体外受精(IVF)过程中精子的激活和优选。

Description

促进精子激活的组合物和一种精子激活液及其制备方法
技术领域
本发明涉及辅助生殖领域，具体是促进精子激活的组合物和一种精子激活液及其制备方法。
背景技术
体外受精(in vitro fertilization，IVF)，又称试管婴儿，是一种辅助生殖治疗的方法，具体是指分别将卵子与精子取出后，进行体外受精，培养形成胚胎，再将胚胎移植回母体子宫内妊娠发育成胎儿。
在辅助生殖治疗周期中约有35-40％的不孕患者来自男性因素，而第二代试管婴儿是解决男性因素体外受精的主要技术。第二代试管婴儿，又叫卵母细胞胞浆内单精子显微注射(ICSI)，通俗的讲就是在显微镜下挑出一个活动力最强、最优秀的精子，然后将这个精子注射到卵子里面完成受精的技术，适用于重度少弱精的男性不育患者。但是，ICSI的平均受精率仅有70％左右，大约3％的ICSI周期发生完全受精失败。ICSI受精失败直接导致人卵子不能继续发育，辅助生殖治疗失败。
ICSI治疗失败的主要原因是男性精子活力差，精子活率低，前向运动能力差和精子畸形率高，而其根本原因在于精子细胞核DNA的完整性缺失以及线粒体DNA(mtDNA)受损，从而导致精子结构和功能异常。
目前，关于精子激活的研究主要是添加外源性物质，如咖啡因、氨基多糖类物质、己酮可可碱、生殖激素、血小板活化因子和维生素。但是，不同外源性物质的应用效果差异较大，且只能对精子产生短期刺激，因此并不能改善精子的结构和功能。
因此，我们亟需一种能够从根本上修复精子细胞结构、提高精子活力、延长精子体外存活时间、促进精子激活以及增强精子对卵母细胞的穿透受精能力，从而提高受精成功率、囊胚形成率和妊娠率的精子激活液。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种精子激活液及其制备方法，以达到修复精子细胞结构、提高精子活力、延长精子体外存活时间、促进精子激活以及增强精子对卵母细胞的穿透受精能力，从而缩短精子注射和卵子体外操作的时间，并且提高卵子的受精成功率、囊胚形成率和妊娠率的效果。
本发明的另一目的在于克服现有技术的不足，提供一种促进精子激活的组合物。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种促进精子激活的组合物，包括ATP钠盐、肝素、黏着斑蛋白、丙二烯氧化物合酶、乙酰辅酶A乙酰基转移酶2、膦脂酰丝氨酸、辅酶Q10、亚麻酸和重组热休克蛋白HSPA8。
所述ATP钠盐不仅能够为精子直接提供运动所需的能量物质，还有助于精子细胞中段部位的线粒体产能。
所述肝素能够通过结合精子表面的受体，激活受体偶联的信号传导系统，温和有效地提升精子细胞内线粒体的产能功能和促进钙离子内流，达到了诱发顶体反应，达到了改善精子的受精活力的效果。
所述黏着斑蛋白(Vinculin)通过与多种黏着斑蛋白、细胞骨架蛋白以及细胞骨架F-肌动蛋白结合并作用，参与细胞化学的信号转导，达到了修复精子顶体结构和细胞骨架的作用。
由于脂质过氧化物和过氧化氢对生物有机体有毒，并且可以通过碳链增长反应产生额外的过氧化物，从而对蛋白质和DNA造成氧化损伤。
所述丙二烯氧化物合酶(AOS)作为一种抗氧化酶，对生物系统中的脂质过氧化物具有特异性，能够将游离或酯化的脂肪酸过氧化物或过氧化氢快速转化为其相应的环氧化物，再转化为酮醇，达到了阻止过氧化物产生，从而保护DNA和蛋白质的结构和功能的效果。
所述乙酰辅酶A乙酰基转移酶2(ACAT2)，是一种低含量的内质网膜蛋白，分布在线粒体中，能够参与脂肪酸代谢、调节线粒体细胞传导信号和凋亡信号，达到了促进精子产能和提高精子活力的效果。
所述磷脂酰丝氨酸，位于细胞膜内层，是细胞膜结构组分之一，有助于修复精子细胞膜受损部位。
所述辅酶Q10具有抗氧化，清除自由基功能，人类细胞制造能量必须有辅酶Q10参与，主要作用为驱动人体细胞产生能量，它能加速细胞更新，激发细胞活性，维持线粒体形态结构，从而大大促进细胞摄取营养物质的能力。
所述亚麻酸可直接作为细胞结构物质，达到了提高生物膜与酶结合活性的效果。
所述重组热休克蛋白HSPA8有助于保护细胞免受压力，还可以保护细胞免受热和氧化应激。
通过上述技术方案，所述ATP钠盐、肝素、辅酶Q10和乙酰辅酶A乙酰基转移酶2等成分可参与线粒体产能过程，达到了提高精子活力的效果；所述黏着斑蛋白、亚麻酸和磷脂酰丝氨酸能够修复受损精子细胞的结构；所述丙二烯氧化物合酶和重组热休克蛋白HSPA8能够消除精子细胞内过氧化物，达到了避免精子受氧化应激作用以及出现DNA损伤的效果。
一种精子激活液，包括基本培养液和组合物，所述组合物包括ATP钠盐2～10mg/L、肝素5～15U/mL、黏着斑蛋白5～10μg/mL、丙二烯氧化物合酶1～2.5μg/mL、乙酰辅酶A乙酰基转移酶24～4.5μg/mL、膦脂酰丝氨酸0.9～1.1mmol/L、辅酶Q105.5～10.5μg/mL、亚麻酸3.5～6.5ng/mL和重组热休克蛋白HSPA80.45～0.5μg/mL。
进一步的，所述基本培养液包括溶剂和溶质，所述溶剂包括水，所述溶质包括氯化钠85.1～101.6mmol/L、氯化钾1.74～4.69mmol/L、七水硫酸镁0.118～0.256mmol/L、磷酸二氢钾0.215～0.378mmol/L、二水氯化钙1.584～2.047mmol/L、氟化钠0.021～0.115mmol/L、葡萄糖0.105～2.781mmol/L、丙酮酸钠0.071～2.015mmol/L、乳酸钠2.417～10.823mmol/L和氨基酸0.667～6.284mmol/L。
进一步的，所述溶剂为超纯水。
通过上述技术方案，所述超纯水无内毒素和重金属，适用于作为溶剂。
进一步的，还包括人血白蛋白6～15mg/mL和杀菌剂9～11mg/L。
通过上述技术方案，所述人血白蛋白可螯合重金属，达到了避免精子激活液中重金属对精子产生毒性影响的效果；所述杀菌剂可有效抑制细菌生长，达到了避免所述精子激活液出现细菌污染的效果。
进一步的，所述杀菌剂包括硫酸庆大霉素。
通过上述技术方案，所述硫酸庆大霉素作为一种广谱抗生素，达到了有效抑制细菌生长的效果。
进一步的，所述氨基酸包括必需氨基酸和非必需氨基酸；所述必需氨基酸包括精氨酸、胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种；所述非必需氨基酸包括天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和牛磺酸中的一种或多种。
一种制备上述的精子激活液的方法，包括以下步骤：
S1.在百级条件下，按配比称量所述ATP钠盐、肝素、磷脂酰丝氨酸、亚麻酸、氯化钠、氯化钾、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、二水氯化钙、氟化钠、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、氨基酸和杀菌剂，并加入水中混合均匀，得到溶液I；
S2.按配比称量所述人血白蛋白、黏着斑蛋白、丙二烯氧化物合酶、乙酰辅酶A乙酰基转移酶2、辅酶Q10和重组热休克蛋白HSPA8，并加入所述溶液I中混合均匀，得到溶液Ⅱ；
S3.所述溶液Ⅱ经杀菌、分装处理后，得到所述精子激活液。
进一步的，S1～S2中，环境温度均为18～26℃，环境湿度均为40％～60％。
进一步的，S3中，所述灭菌具体为：使用滤膜对所述溶液Ⅱ进行过滤除菌，所述滤膜的孔径为0.10～0.22μm。
本发明的有益效果是：
1.本发明的一种精子激活液，通过添加所述ATP钠盐、肝素、辅酶Q10和乙酰辅酶A乙酰基转移酶2等成分参与线粒体产能过程，达到了提高精子活力的效果；通过添加所述黏着斑蛋白、亚麻酸和磷脂酰丝氨酸，达到了修复受损精子细胞的结构的效果；通过添加所述丙二烯氧化物合酶和重组热休克蛋白HSPA8消除精子细胞内过氧化物，达到了避免精子受氧化应激作用以及出现DNA损伤的效果。
2.本发明的一种精子激活液，能够修复精子结构、提高精子活力、延长精子体外存活时间、促进其获能以及增强其对卵母细胞的穿透能力，从而极大地缩短精子注射和卵子体外操作的时间，提高受精率和囊胚形成率，直接或间接地提高妊娠率。
3.本发明的一种精子激活液，能够有效适用于体外受精辅助生殖技术中的卵母细胞胞浆内单精子显微注射技术(ICSI)和体外受精(IVF)过程中精子的激活和优选。
具体实施方式
下面进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
采用本发明的精子激活液，实施以下5组实施例。
1.实施例1～5中精子激活液的组分及其含量(溶剂为超纯水)，如下表所示：
Figure BDA0002366483730000041
Figure BDA0002366483730000051
2.实施例1～5中精子激活液的制备方法，包括以下步骤：
S1.配制溶液I，包括以下步骤：
1)使配制所需器皿经过温度为250℃，时间30min的干热除热源；
2)在百级条件下，按配比称量所述ATP钠盐、肝素、磷脂酰丝氨酸、亚麻酸、氯化钠、氯化钾、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、二水氯化钙、氟化钠、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、氨基酸和杀菌剂，并加入水中混合均匀，得到溶液I；
S2.按配比称量所述人血白蛋白、黏着斑蛋白、丙二烯氧化物合酶、乙酰辅酶A乙酰基转移酶2、辅酶Q10和重组热休克蛋白HSPA8，并加入所述溶液I中混合均匀，得到溶液Ⅱ；
S3.使用孔径为0.22μm的滤膜对所述溶液Ⅲ进行过滤除菌后，进行无菌分装，得到所述精子激活液；
其中，S1～S2中，环境温度均为18～26℃，环境湿度均为40％～60％。
对照例1
采用本发明实施例1中的精子激活液与对照例1进行对比，对照例1中的组合物为：ATP钠盐、肝素、重组黏着斑蛋白(vaculin)、乙酰辅酶A乙酰基转移酶2(ACAT2)、磷脂酰丝氨酸、亚麻酸和重组热休克蛋白HSPA8，其他如用量、步骤和条件等与本发明实施例1均相同(本对照例相比于实施例1，组合物中不添加丙二烯氧化物合酶和辅酶Q10，用于证明本发明的精子激活液效果更好)。
对照例2
采用本发明实施例1中的精子激活液与对照例2进行对比，对照例2中的组合物为：ATP钠盐、丙二烯氧化物合酶(AOS)、乙酰辅酶A乙酰基转移酶2(ACAT2)、磷脂酰丝氨酸、辅酶Q10、亚麻酸和重组热休克蛋白HSPA8，其他如用量、步骤和条件等与本发明实施例1均相同(本对照例相比于实施例1，组合物中不添加肝素和重组黏着斑蛋白，用于证明本发明的精子激活液效果更好)。
对照例3
采用本发明实施例1中的精子激活液与对照例3进行对比，对照例3中的组合物为：肝素、重组黏着斑蛋白(vaculin)、丙二烯氧化物合酶(AOS)、磷脂酰丝氨酸、辅酶Q10、亚麻酸和重组热休克蛋白HSPA8，其他如用量、步骤和条件等与本发明实施例1均相同(本对照例相比于实施例1，组合物中不添加ATP钠盐和乙酰辅酶A乙酰基转移酶2，用于证明本发明的精子激活液效果更好)。
对照例4
采用本发明实施例1中的精子激活液与对照例3进行对比，对照例3中的组合物为：ATP钠盐、肝素、重组黏着斑蛋白(vaculin)、丙二烯氧化物合酶(AOS)、乙酰辅酶A乙酰基转移酶2(ACAT2)和辅酶Q10，其他如用量、步骤和条件等与本发明实施例1均相同(本对照例相比于实施例1，组合物中不添加磷脂酰丝氨酸、亚麻酸和重组热休克蛋白HSPA8，用于证明本发明的精子激活液效果更好)。
试验效果
1.为了验证本发明的精子激活液的效果，对实施例1～5以及对照例1～4所得的精子激活液进行了检测，检测项目包括pH值、渗透压、细菌内毒素、精子活力、精子质膜完整性、精子顶体完整性和精子线粒体活性，检测方法如下：
-pH值检测：取一定量成品用血气分析仪进行检测，记录三次的检测值并取平均值作为精子激活液的最终pH值，在7.10～7.40范围内为合格；
-渗透压检测：取25μL液体滴入0.5mL EP管，放入渗透压仪(冰点渗透压仪)探头等待检测值稳定，读出数值；同样方法检测三遍取平均值，即可得到该精子激活液的渗透压，在255～295mOsm/Kg范围内为合格；
-细菌内毒素检测：采用中国药典内毒素的检测方法中的鲎试剂动态显色法进行，判定为<0.15EU/mL合格；
-精子活力检测：精子活力是指精液中呈直线前进运动精子占总精子的百分率，采用精子质量分析仪检测；
-质膜完整性检测：采用低渗肿胀法检测精子质膜的完整性，方法参照李晓霞(2013)，即滴片后在200×相差显微镜下观察精子尾部形态，精子尾部形成一个圆环的为精子质膜完整的精子，没有形成圆环的则为质膜损伤(不完整)的精子，每次计数至少200条精子；
-顶体完整性检测：采用考马斯亮蓝G-250染色法检测精子顶体完整性，方法参照李晓霞(2013)，即染色后用自来水冲洗，自然干燥，在1000×油镜下统计顶体膜完整率及破损率：顶体区为蓝色且顶体边缘光滑的精子为具有完整顶体的精子，顶体区不着色或着色较淡的精子为顶体破损的精子，至少观察200条精子；
-线粒体活性检测：用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(Beyotime)检测精子的线粒体膜电位，精子的染色程序按照试剂盒说明进行，具体为：
(1)按照每50μLJC-1(200×)加入8mL超纯水混匀后，再加入2mLJC-1染色缓冲液(5×)混匀，即为JC-1染色工作液；以每1mLJC-1染色缓冲液(5×)加入4mL蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1×)；取100μL精子密度约为107个/mL的精液，加入100μLJC-1染色工作液，37℃下孵育30min；然后用JC-1染色缓冲液(1×)离心洗涤，再重悬于JC-1染色缓冲液(1×)，使精子密度达到107个/mL。
(2)取5μL染色后的精子悬液滴在载玻片上，然后盖上盖玻片，于荧光显微镜的蓝光下观察，记录有线粒体活性(高膜电位)的精子数(在精子尾部中段有微黄或桔红色荧光)和无线粒体活性(低膜电位)的精子数(精子尾部中段产生绿色荧光)，至少观察200个精子。
结果如下表所示：
Figure BDA0002366483730000071
由上表可知，实施例1～5以及对照例1～4的pH均在7.10～7.40范围内；实施例1～5以及对照例1～4的渗透压均在255～295mOsm/Kg范围内；
对照例1～4中精子激活液的细菌内毒素为0.011～0.014，相比于实施例1提高了83.33％～133.33％；前向运动精子比例为31％～35％，相比于实施例1降低了55.13％～60.26％；质膜完整率为80％～85％，相比于实施例1降低了10.53％～15.79％；顶体完整率为80％～85％，相比于实施例1降低了7.61％～13.04％；线粒体活性为57％～65％，相比于实施例1降低了26.14％～35.23％。
2.为了验证本发明的精子激活液对受精和囊胚形成的影响，进行了体外鼠胚试验，包括以下步骤：
A1.超数排卵/取卵：选择6～8周龄雌鼠，经腹腔注射PMSG 10IU/只；48h后，经腹腔注射hCG 10IU/只；14h后，对小鼠输卵管壶腹部进行输卵管冲洗，取出成熟的卵子并置于事先平衡过夜的培养液中，剔除异常卵子，得到正常卵子；
A2.小鼠取精/精子获能：通过手术从雄鼠附睾及输精管直接取精，将精子置于事先平衡过夜的精子激活液中，于37℃、6％CO2、5％O2以及饱和湿度的培养箱中培养1～1.5h，得到获能优选后的精子；
A3.体外受精/受精率：将获能后密度为1×106/mL的10μL精子与100枚成熟的卵子共培养于200μL的精子激活液微滴中6～8h，完成受精工作；利用胚胎培养液清洗两次受精卵后，将受精卵清洗转移到事先平衡的新的胚胎培养液微滴中，于37℃、6％CO2、5％O2以及饱和湿度的培养箱中培养16h，直至2细胞期胚胎形成；对所有的卵子受精情况进行检测分析，发育至2细胞期的属于正常受精卵，停滞在1细胞期的属于未受精或受精失败的卵子，分析得出受精率；
A4.体外培养/囊胚形成率：于37℃、6％CO2、5％O2以及饱和湿度的培养箱中培养继续培养正常受精的胚胎至96h囊胚期，对胚胎发育情况进行形态观察分析，得出囊胚形成率。
结果如下表所示：
Figure BDA0002366483730000081
Figure BDA0002366483730000091
由上表可知，本发明的精子激活液在培养过程中，组分ATP钠盐、肝素、黏着斑蛋白、丙二烯氧化物合酶、乙酰辅酶A乙酰基转移酶2、膦脂酰丝氨酸、辅酶Q10、亚麻酸和重组热休克蛋白HSPA8之间是相辅相成的，任何一种关键组分的缺失都会直接影响卵子受精率和囊胚形成率，导致卵子受精率低于79％，囊胚形成率低于71％。因此，精子激活液中组合物中的各组分对受精率和囊胚形成率都有明显的促进作用，精子经该精子激活液处理后的受精率和囊胚形成率分别可达94％～100％，92％～98％。
因此，本发明的一种精子激活液能够修复精子结构、提高精子活力、延长精子体外存活时间、促进精子激活以及增强精子对卵母细胞的穿透受精能力，从而缩短精子注射和卵子体外操作的时间，并且提高卵子的受精成功率、囊胚形成率和妊娠率的效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (5)

1.一种精子激活液，其特征在于，包括基本培养液和组合物，所述组合物包括ATP钠盐2～10mg/L、肝素5～15U/mL、黏着斑蛋白5～10μg/mL、丙二烯氧化物合酶1～2.5μg/mL、乙酰辅酶A乙酰基转移酶24～4.5μg/mL、膦脂酰丝氨酸0.9～1.1mmol/L、辅酶Q105.5～10.5μg/mL、亚麻酸3.5～6.5ng/mL和重组热休克蛋白HSPA80.45～0.5μg/mL；
所述基本培养液包括溶剂和溶质；所述溶剂包括水，所述溶质包括氯化钠85.1～101.6mmol/L、氯化钾1.74～4.69mmol/L、七水硫酸镁0.118～0.256mmol/L、磷酸二氢钾0.215～0.378mmol/L、二水氯化钙1.584～2.047mmol/L、氟化钠0.021～0.115mmol/L、葡萄糖0.105～2.781mmol/L、丙酮酸钠0.071～2.015mmol/L、乳酸钠2.417～10.823mmol/L、氨基酸0.667～6.284mmol/L、人血白蛋白6～15mg/mL和硫酸庆大霉素9～11mg/L。
2.根据权利要求1所述的精子激活液，其特征在于，所述氨基酸包括必需氨基酸和非必需氨基酸；
所述必需氨基酸包括精氨酸、胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯基丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸中的一种或多种；
所述非必需氨基酸包括天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、N(2)-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和牛磺酸中的一种或多种。
3.制备如权利要求1～2任一项所述的精子激活液的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.在百级条件下，按配比称量所述ATP钠盐、肝素、磷脂酰丝氨酸、亚麻酸、氯化钠、氯化钾、七水硫酸镁、磷酸二氢钾、二水氯化钙、氟化钠、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠、氨基酸和杀菌剂，并加入水中混合均匀，得到溶液I；
S2.按配比称量所述人血白蛋白、黏着斑蛋白、丙二烯氧化物合酶、乙酰辅酶A乙酰基转移酶2、辅酶Q10和重组热休克蛋白HSPA8，并加入所述溶液I中混合均匀，得到溶液Ⅱ；
S3.所述溶液Ⅱ经杀菌、分装处理后，得到所述精子激活液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S1～S2中，环境温度均为18～26℃，环境湿度均为40％～60％。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S4中，所述灭菌具体为：使用滤膜对所述溶液Ⅱ进行过滤除菌，所述滤膜的孔径为0.10～0.22μm。
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CN101310729A (zh) * 2007-05-23 2008-11-26 辽宁省辽宁绒山羊育种中心 牛羊无动物源冻精稀释液及牛羊冷冻精液的制作方法
CN103327982A (zh) * 2011-02-01 2013-09-25 日本水产株式会社 性功能改善剂
EP3148557A4 (en) * 2014-05-29 2017-12-27 Pacific Brands Use of allene oxide synthase for semen preservation and assisted reproduction
CN104164401A (zh) * 2014-08-12 2014-11-26 沈阳洁瑞生物技术有限公司 精子洗涤液及其制备方法
CN104195105B (zh) * 2014-08-19 2017-10-27 杭州安体科技有限公司 一种提高人精子活力的体外培养体系试剂盒及其使用方法
CN107988149A (zh) * 2017-11-22 2018-05-04 瑞柏生物（中国）股份有限公司 一种精子活力液及其制备方法
CN108486042A (zh) * 2018-04-03 2018-09-04 成都艾伟孚生物科技有限公司 一种体外受精培养液及其制备方法

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