CN108486042A - 一种体外受精培养液及其制备方法 - Google Patents

一种体外受精培养液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于辅助生殖领域，具体涉及一种体外受精培养液及其制备方法。用于制备体外受精培养液的组合物由白藜芦醇、还原型谷胱甘肽和卵磷脂组成；所述白藜芦醇、还原型谷胱甘肽和卵磷脂的摩尔比为5～50：100～250：8000～12000。本发明的体外受精培养液可以提供稳定的受精环境，去除细胞产生的活性氧和精子在运动过程中产生的活性氧自由基，减少活性氧对精子和卵子的伤害，还能提高精子活力，修复细胞损伤，提高受精率和囊胚形成率，囊胚形成率≥90％。

Description

一种体外受精培养液及其制备方法
技术领域
本发明属于辅助生殖领域，具体涉及一种体外受精培养液及其制备方法。
背景技术
体外受精(In Vitro Fertilization)是指人的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为IVF。
精子和卵子在体外受精，需要受精培养液提供稳定的受精环境。精子和卵子在体外培养过程中会产生过量的活性氧对体外受精是有害的，精子特异性的细胞结构使得精子对活性氧更敏感，更容易收到活性氧的损害。活性氧的危害主要在于破环精子细胞形态，影响受精过程中的顶体反应。
在辅助生殖技术中需采集良好的精子和母体的卵细胞进行受精和先期培养，该培养过程与受精液密切相关，受精液的质量优劣决定是否能得到受精卵。体外受精液的目的主要是提供精子、卵子存活的营养和受精卵发育的营养，以及为精子、卵子及受精卵创建合理的成活和生长发育的环境。
目前使用的受精液调配的营养不全，或其物理或化学指标过余宽，在培养过程中容易使精子或卵细胞死亡、或精子获能不足活力较低、或卵细胞生存受到影响，如在精子活力试验中，精子保持活力的比率较低，或其比率接近或低于合格标准(保持活力率≥75％)。有些受精液的稠度较高，稳定性差其含有有害成份和炎细胞去除不干净，严重影响受精卵的发育成长。
目前，IVF全系培养液全靠进口，价格昂贵，为填补国内空白，研发辅助生殖培养液，逐步替代进口，降低辅助生殖的成本。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种体外受精培养液及其制备方法，本发明的体外受精培养液，可以提供稳定的受精环境，减少活性氧对精子和卵子的伤害，还能提高精子活力，修复细胞损伤，提高受精率和囊胚形成率。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
用于制备体外受精培养液的组合物，所述组合物由白藜芦醇、还原型谷胱甘肽和卵磷脂组成；所述白藜芦醇、还原型谷胱甘肽和卵磷脂的摩尔比为5～50：100～250：8000～12000。
活性氧(reactive oxidative species，ROS)/氧自由基导致的氧化应激会对精子造成损伤。本发明中采用白藜芦醇、还原型谷胱甘肽和卵磷脂用于制备体外受精培养液，可以提供稳定的受精环境，去除细胞产生的活性氧和精子在运动过程中产生的活性氧自由基，减少活性氧对精子和卵子的伤害，还能提高精子活力，修复细胞损伤，提高受精率和囊胚形成率。
白藜芦醇(Resveratrol，Res)，化学名为3,5,4′-三羟基1,2-二苯乙烯(3,5,4′-trihydroxystilbene)，是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。本发明将白藜芦醇用在体外受精培养液中可以去除细胞产生的活性氧，减少活性氧对精子和卵子的伤害。
还原型谷胱甘肽能参与体内氧化还原过程，在外受精培养液中起去除精子在运动过程中产生的活性氧自由基的作用，进一步减小活性氧对精子和卵子的伤害。
体外受精培养液中卵磷脂的存在，能够提高精子活力，修复细胞损伤。
进一步，所述白藜芦醇、还原型谷胱甘肽和卵磷脂的摩尔比为10～40：150～250：9000～11000。
作为一种优选，所述白藜芦醇、还原型谷胱甘肽和卵磷脂的摩尔比为20～40：200～250：9000～11000。
作为一种优选，所述白藜芦醇、还原型谷胱甘肽和卵磷脂的摩尔比为30：200：10000。
本发明的目的之二在于提供一种体外受精培养液，包括白藜芦醇、还原型谷胱甘肽、卵磷脂和基本培养液；所述白藜芦醇、还原型谷胱甘肽、卵磷脂和基本培养液的摩尔比为5～50：100～250：8000～12000：183000～18400。
作为一种优选，所述白藜芦醇、还原型谷胱甘肽、卵磷脂和基本培养液的摩尔比为20～40：200～250：9000～11000：183000～18400。
作为一种优选，所述白藜芦醇、还原型谷胱甘肽、卵磷脂和基本培养液的摩尔比为30：200：10000：183500。
进一步，所述基本培养液包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸氢钠、葡萄糖、氨基酸、乳酸钠、丙酮酸钠、EDTA和杀菌剂。
所述氨基酸包括必需氨基酸和非必需氨基酸。
进一步，所述氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸氢钠、葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸和EDTA的摩尔比为89.94～109.92：5～6.08：1～2.5：0.11～0.2：0.9～1.8：0.6～0.7：0.9～1.1：9.2～15.3：9.2～15.3：1.2～3.8：0.009～0.012。
作为一种优选，所述氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸氢钠、葡萄糖、氨基酸、乳酸钠、丙酮酸钠和EDTA的摩尔比为99.93：5.53：1.8：0.15：1：0.64：1：10.51：10.51：1.2～3.8：0.01。
进一步，在100ml体外受精培养液中杀菌剂的含量为45-55mg/L。
作为一种优选，在100ml体外受精培养液中杀菌剂的含量为50mg/L。
本发明的目的之三在于提供一种所述的体外受精培养液的制备方法，包括以下步骤：
1)在百级条件下配制，按上述比例依次将氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸氢钠、葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、EDTA和硫酸庆大霉素加到水介质中，混合后得溶液I；
2)将溶液I经无菌真空抽滤，再通入体积分数为6-7％的CO2气体10～20min，密闭封装即得。
进一步，在制备中环境温度为18℃～26℃，湿度为40～60％。
进一步，步骤2)中无菌真空抽滤的滤膜为0.2μm的滤膜。
作为一种优选，制备过程中所用的水介质为无热源的超纯水。
作为一种优选，步骤2)中通入体积分数为6％的CO2气体。
在本发明的制备方法中通入6-7％CO2保护气，在6-7％CO2保护气作用下，无机盐缓冲成分不宜分解，有助于快速调节PH值，延长有效期。
具体的一种体外受精培养液的制备方法，包括以下步骤：
1)以下步骤均应在百级环境下进行，烧杯在配置过程中都需要盖上玻璃盖子，环境温度：18℃～26℃，湿度:40～60％；
2)向烧杯中加入适宜体积的去热源超纯水，按照配方依次称量加入各药品，使用玻璃棒搅拌加速各物质溶解；
3)用去热源的超纯水定容至100ml，将真空抽滤装置装好，小心将配置好的溶液倒入无菌过滤杯，真空抽滤；
4)将充气装置移入抽滤好的溶液中，打开气体阀门，接通通气装置，调节合适的气体流量，通入体积分数为6％的CO2气体15min，密闭封装。
本发明的有益效果在于：
1)本发明的体外受精培养液，采用白藜芦醇、还原型谷胱甘肽和卵磷脂用于制备体外受精培养液，可以提供稳定的受精环境，去除细胞产生的活性氧和精子在运动过程中产生的活性氧自由基，减少活性氧对精子和卵子的伤害，还能提高精子活力，修复细胞损伤，提高受精率和囊胚形成率，囊胚形成率≥90％。
2)本发明体外受精培养液的制备方法操作简单，配制过程在百级条件下进行，配制所用溶剂为无热源的超纯水，配制的受精液的内毒素含量低，通入6～7％的CO2与碳酸氢钠在溶液中形成碳酸盐缓冲对，pH稳定。
具体实施方式
以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1体外受精培养液
物料 百级条件
氯化钠 99.93mmol/L
氯化钾 5.53mmol/L
氯化钙 1.8mmol/L
磷酸二氢钾 0.15mmol/L
硫酸镁 1mmol/L
碳酸氢钠 0.64mmol/L
葡萄糖 1mmol/L
乳酸钠 10.51mmol/L
丙酮酸钠 10.51mmol/L
必需氨基酸 0.7mmol/L-2.3mmol/L
非必需氨基酸 0.5mmol/L-1.5mmol/L
EDTA 0.01mmol/L
硫酸庆大霉素 50mg/L
白藜芦醇 30umol/L
还原型谷胱甘肽 200umol/L
卵磷脂 10mmol/L
实施例2体外受精培养液
物料 百级条件
氯化钠 108.2mmol/L
氯化钾 6.0mmol/L
氯化钙 1.5mmol/L
磷酸二氢钾 0.18mmol/L
硫酸镁 1.2mmol/L
碳酸氢钠 0.7mmol/L
葡萄糖 1.1mmol/L
乳酸钠 12.3mmol/L
丙酮酸钠 12.3mmol/L
必需氨基酸 0.7mmol/L-2.3mmol/L
非必需氨基酸 0.5mmol/L-1.5mmol/L
EDTA 0.012mmol/L
硫酸庆大霉素 55mg/L
白藜芦醇 40umol/L
还原型谷胱甘肽 250umol/L
卵磷脂 11mmol/L
实施例3体外受精培养液
物料 百级条件
氯化钠 97.56mmol/L
氯化钾 5.35mmol/L
氯化钙 1.5mmol/L
磷酸二氢钾 0.19mmol/L
硫酸镁 1.3mmol/L
碳酸氢钠 0.6mmol/L
葡萄糖 0.9mmol/L
乳酸钠 9.86mmol/L
丙酮酸钠 9.386mmol/L
必需氨基酸 0.7mmol/L-2.3mmol/L
非必需氨基酸 0.5mmol/L-1.5mmol/L
EDTA 0.01mmol/L
硫酸庆大霉素 45mg/L
白藜芦醇 20umol/L
还原型谷胱甘肽 200umol/L
卵磷脂 9mmol/L
实施例4体外受精培养液的制备方法
实施例1～3和对比例1～2的体外受精培养液按以下方法制备，包括以下步骤：
1)以下步骤均应在百级环境下进行，烧杯在配置过程中都需要盖上玻璃盖子，环境温度：18℃～26℃，湿度:40～60％；
2)向烧杯中加入适宜体积的去热源超纯水，按照配方依次称量加入各药品，使用玻璃棒搅拌加速各物质溶解；
3)用去热源的超纯水定容至100ml。将真空抽滤装置装好，小心将配置好的溶液倒入无菌过滤杯，真空抽滤；
4)将充气装置移入抽滤好的溶液中，打开气体阀门，接通通气装置，调节合适的气体流量，通入体积分数为6％的CO2气体15min。密闭封装。
实施例5体外受精培养液指标检测
取分装好的体外受精培养液进行检测，检测项目是pH值、渗透压、内毒素。
1.pH值检测
取一定量成品用血气分析仪进行检测记录三次的值并取平均值为最终液体的pH值，在范围内为合格。
2.渗透压
取25μL液体滴入0.5mlEP管放入渗透压仪(冰点渗透压仪)探头等待检测值稳定，读出数值，同样方法检测三遍取平均值即为该液体的渗透压，在范围内为合格。
3.细菌内毒素检测
采用中国药典内毒素的检测方法中的鲎试剂凝胶法进行，判为定小于1EU/mL合格；
检测结果：
表1.体外受精液理化及生物指标检测结果
名称 实施例1体外受精液 实施例2体外受精液 实施例3体外受精液
Ph(室温) 7.2-7.4 7.2-7.4 7.2-7.4
渗透压 280-290mosM 280-290mosM 280-290mosM
内毒素(LAL) <0.5EU/ml <0.5EU/ml <0.5EU/ml
实施例6受精卵囊胚形成实验
在冲洗完卵母卵丘细胞复合体之后，转移至受精培养液中。同时将优选的精子加入到受精培养液中，进行受精。
体外受精培养液A：关键物料只有白藜芦醇，其他与实施例1相同。
体外受精培养液B：关键物料有白藜芦醇和还原型谷胱甘肽，其他与实施例1相同。
用实施例1～3、体外受精培养液A、体外受精培养液B的体外受精培养液和市场现有体外受精培养液作为对照组进行受精卵囊胚形成实验。
检测精子活力、卵裂率、囊胚形成率，检测结果见下表：
表2.精子活力、卵裂率、囊胚形成率的结果(X±SD)
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.用于制备体外受精培养液的组合物，其特征在于，所述组合物由白藜芦醇、还原型谷胱甘肽和卵磷脂组成；所述白藜芦醇、还原型谷胱甘肽和卵磷脂的摩尔比为5～50：100～250：8000～12000。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述白藜芦醇、还原型谷胱甘肽和卵磷脂的摩尔比为10～40：150～250：9000～11000。
3.一种体外受精培养液，其特征在于，包括白藜芦醇、还原型谷胱甘肽、卵磷脂和基本培养液；所述白藜芦醇、还原型谷胱甘肽、卵磷脂和基本培养液的摩尔比为5～50：100～250：8000～12000：183000～18400。
4.根据权利要求3所述的体外受精培养液，其特征在于，所述白藜芦醇、还原型谷胱甘肽、卵磷脂和基本培养液的摩尔比为20～40：200～250：9000～11000：183000～18400。
5.根据权利要求3所述的体外受精培养液，其特征在于，所述基本培养液包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸氢钠、葡萄糖、氨基酸、乳酸钠、丙酮酸钠、EDTA和杀菌剂。
6.根据权利要求5所述的体外受精培养液，其特征在于，所述氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸氢钠、葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸和EDTA的摩尔比为89.94～109.92：5～6.08：1～2.5：0.11～0.2：0.9～1.8：0.6～0.7：0.9～1.1：9.2～15.3：9.2～15.3：1.2～3.8：0.009～0.012。
7.根据权利要求5所述的体外受精培养液，其特征在于，在100ml体外受精培养液中杀菌剂的含量为45-55mg/L。
8.权利要求3～7任一项所述的体外受精培养液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在百级条件下配制，按上述比例依次将氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸氢钠、葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠、氨基酸、EDTA和硫酸庆大霉素加到水介质中，混合后得溶液I；
2)将溶液I经无菌真空抽滤，再通入体积分数为6-7％的CO2气体10～20min，密闭封装即得。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在制备中环境温度为18℃～26℃，湿度为40～60％。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中无菌真空抽滤的滤膜为0.2μm的滤膜。
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