CN104195105B - 一种提高人精子活力的体外培养体系试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种提高人精子活力的体外培养体系试剂盒及其使用方法。该试剂盒包括9mL mHTF、1mL血清替代物vcl重组蛋白、45～55ug acat2重组蛋白。使用方法是将试剂盒中各试剂置于37℃下混合平衡2～3小时，得到10 mL精子培养体系；将用精子分裂液分离出来的精子按1000万/mL的浓度用上述精子培养体系重悬后，轻轻混匀，置于37℃恒温箱中放置90～120分钟，即可。利用本发明精子培养体系重悬后的精子可以显著提高前向运动活力，在人工授精和体外受精技术中使用，可以改善妊娠结局，提高受精率；同时对严重弱精子症患者的治疗又提供了新方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种体外培养体系试剂盒，具体是指一种为了提高精子活力，含有活性重组蛋白的培养体系试剂盒及其使用方法。
背景技术
近年来不育不孕症患者显著增多，而男性的弱精子症又是男性不育的重要原因之一。弱精子症是指前向运动精子比例低于32%(a+b<32%)，或者精子总活力低于40%（a+b+c<40%）。对于轻中度弱精子症(a+b>10%)，临床常通过人工授精进行治疗，然而对重度弱精子症(a+b<10%)，临床则要用体外受精甚至单精子卵泡注射等技术。研究表明，较好的精子动力是辅助生殖技术成功的一个重要因素。
精液由精子和精浆组成，精子来源于睾丸，是遗传信息的承载者，是受精的主体。而精浆则含有许多从附属性腺包括附睾、精囊腺和前列腺分泌的活性物质，这其中有一些活性蛋白，它们对于精子活力的维持具有非常重要的作用。在辅助生殖技术操作实施过程中，常规的精子处理方式会把精浆洗去，改之用人工合成的培养液作为精子的培养体系，包括BWW、mHTF、台式液等等。上述培养液主要为精子提供了一个缓冲和基本供能环境，对精子活力的提高作用不明显。而我们发现精浆中的一些关键蛋白对于精子活力的提高具有重要作用，例如粘着斑蛋白（vinculin）和乙酰辅酶A乙酰基转移酶（acetyl-CoAacetyltransferase 2）。而这些活性蛋白的加入对于提高精子活力具有非常重要的作用。因此，在临床上开发一种提高精子活力的培养体系就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供了一种提高人精子活力的体外培养体系试剂盒。
本发明提高人精子活力的体外培养体系试剂盒包括9mL 的Modified HumanTubal Fluid （改良后人输卵管液，简称mHTF）、1mL的serum substitute supplement（血清替代物，简称SSS）、34～45ug的粘着斑蛋白（vinculin，在下文中简称vcl重组蛋白）、45～55ug的乙酰辅酶A乙酰基转移酶（acetyl-CoA acetyltransferase 2，在下文中简称acat2重组蛋白）。
所述的vcl重组蛋白、acat2重组蛋白为人源基因通过酵母表达体系大量表达后的产物，其性状为提纯后的蛋白干粉；其中vcl重组蛋白中VCL 基因ID:7414，acat2重组蛋白中ACAT2 基因ID:39；本发明所用重组蛋白由南京金斯瑞生物科技有限公司的酵母蛋白表达服务提供。
本发明的另一个目的是提供上述试剂盒的使用方法：
本发明试剂盒针对的作用对象为经精子分离液分离后的精子。
将本发明试剂盒中各试剂mHTF、血清替代物SSS、vcl重组蛋白、acat2重组蛋白置于37℃下混合平衡2～3小时，得到10 mL精子培养体系；将用精子分裂液分离出来的精子按1000万/mL的浓度用上述精子培养体系重悬后，轻轻混匀，置于37℃恒温箱中放置90～120分钟，即可。
本发明试剂盒试剂中的vcl重组蛋白、acat2重组蛋白为人源重组蛋白，是从天然酵母表达系统中产生，对于精子本身没有任何毒害效应，且可以通过成熟的技术方法大量表达纯化，适合大规模生产后投入临床使用。
利用本发明精子培养体系重悬后的精子可以显著提高前向运动活力，在人工授精和体外受精技术中使用，可以改善妊娠结局，提高受精率；同时对严重弱精子症患者的治疗又提供了新方法。
附图说明
图1为正常活力精子标本使用目的培养液前后精子动力改善状况；
图2为弱精子症患者标本使用目的培养液前后精子动力改善状况。
具体实施方式：
以下的实施例可以使本专业技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：
样本来源：三份正常活力精子标本（标准按WHO五版）
精子处理：
1.预热10mL含体积分数为10% SSS的mHTF（作为培养前对照组），2mL Isolate精子分离液和10mL本发明精子培养体系。
2.将收集有精液的取精杯置于37℃水浴，待液化后取出。
3.将预热的含体积分数为10% SSS的mHTF与液化后精液混匀，缓缓加入到Isolate精子分离液上，300g离心10分钟。
4.离心后弃上清，取下层分离后精子镜检，记录精子活力，作为培养前对照组。
5.将步骤（4）剩余精子按1000万/mL的浓度与本发明精子培养体系混匀，置于37℃温箱90～120分钟。
6.取精子镜检，记录精子活力。
最终结果（图1）：本发明精子培养体系培养前平均前向运动精子比例为64.6%，培养后平均前向运动精子比例为76%，（p<0.01）
实施例2：
样本来源：三份弱精子症患者精子标本（标准按WHO五版）
精子处理：
1.预热10mL含体积分数为10% SSS的mHTF（作为培养前对照组），2mL Isolate精子分离液和10mL本发明精子培养体系。
2.将收集有精液的取精杯置于37℃水浴，待液化后取出。
3.将预热的含体积分数为10% SSS的mHTF与液化后精液混匀，缓缓加入到Isolate分离液上，300g离心10分钟。
4.离心后弃上清，取下层分离后精子镜检，记录精子活力，作为培养前对照组。
5.将步骤（4）剩余精子按1000万/mL的浓度与本发明精子培养体系混匀，置于37℃温箱90～120分钟。
7.取精子镜检，记录精子活力。
最终结果（图2）：本发明精子培养体系培养前平均前向运动精子比例为33.3%，培养后平均前向运动精子比例为45.4%（p<0.01）
上述使用的mHTF 为Irvine Scientific，购买自美国，货号：90126；
上述使用的本发明精子培养体系制备如下：9mL mHTF、1mL SSS、34～45ug vcl重组蛋白、45～55ug acat2重组蛋白置于37℃下混合平衡2～3小时，得到10 mL精子培养体系；其中vcl重组蛋白、acat2重组蛋白为人源基因通过酵母表达体系大量表达后的产物，其性状为提纯后的蛋白干粉；其中vcl重组蛋白中VCL 基因ID:7414，acat2重组蛋白中ACAT2基因ID:39；本发明所用重组蛋白由南京金斯瑞生物科技有限公司的酵母蛋白表达服务提供。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式。应当指出，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些都视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种提高人精子活力的体外培养体系试剂盒，其特征在于包括9mL改良后人输卵管液modified human tubal fluid、1mL血清替代物SSS、34～45ug的粘着斑蛋白、45～55ug的乙酰辅酶A乙酰基转移酶。
2.如权利要求1所述的一种提高人精子活力的体外培养体系试剂盒，其特征在于粘着斑蛋白、乙酰辅酶A乙酰基转移酶为人源基因通过酵母表达体系大量表达后的产物，其性状为提纯后的蛋白干粉。
3.如权利要求1所述的一种提高人精子活力的体外培养体系试剂盒的使用方法，其特征在于将试剂盒中9mL改良后人输卵管液modified human tubal fluid、1mL血清替代物SSS、34～45ug粘着斑蛋白、45～55ug乙酰辅酶A乙酰基转移酶置于37℃下混合平衡2～3小时，得到精子培养体系；将用精子分裂液分离出来的精子按1000万/mL的浓度用上述精子培养体系重悬后，轻轻混匀，置于37℃恒温箱中放置90～120分钟，即可。
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| 精子孵育时间及培养液成分对小鼠体外受精和胚胎发育的影响;华月琴 等;《苏州大学学报(医学版)》;20090725;第29卷(第04期);摘要、第648页左栏1.2方法 * |
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