CN103173406A - 一种牦牛精子体外获能的方法 - Google Patents
一种牦牛精子体外获能的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103173406A CN103173406A CN2013101341244A CN201310134124A CN103173406A CN 103173406 A CN103173406 A CN 103173406A CN 2013101341244 A CN2013101341244 A CN 2013101341244A CN 201310134124 A CN201310134124 A CN 201310134124A CN 103173406 A CN103173406 A CN 103173406A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- capacitation
- liquid
- sodium
- vitro
- sperm
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明公开了一种牦牛精子体外获能的方法,主要包括:牦牛冷冻精液解冻方法、精子体外获能液及获能方法、精子体外受精液及获能效果评估方法。并提供了牦牛精子体外获能的具体条件,确保牦牛精子体外获能的质量和效率。本发明技术与方法全面,操作方便,测定结果准确,可完全用于牦牛精子体外获能或胚胎体外生产,能够有效提高牦牛的繁殖效率。
Description
技术领域
本发明属牦牛繁殖领域,涉及牦牛胚胎生物技术,具体涉及一种牦牛精子体外获能的方法。
背景技术
牦牛是分布于青藏高原及毗邻地区特有的牛种资源。牦牛的繁殖具有明显的季节性,牦牛发情具有普通牛的一般特征,但不如普通牛种明显。但特殊的自然生态环境条件,使牦牛形成了晚熟、繁殖力低的生态生理特性。
随着现代生物技术的发展,胚胎生物技术逐步应用于牦牛科学研究,但由于重复性差、结果不稳定,致使牦牛胚胎生物技术在牦牛生产上还未有效开展。尤其是牦牛体外受精技术,普遍存在的问题是受精卵的卵裂率和囊胚体外发育率结果不稳定,体外受精的总成功率偏低。而牦牛精子的体外获能是体外受精技术的关键环节,因此极有必要针对牦牛生态生理特性与繁殖特征,研制出一种牦牛精子体外获能的方法,完善牦牛胚胎体外生产技术方案,加速生物技术在牦牛繁育中的应用,从而提高牦牛繁殖效率,全面发挥优良牦牛的繁殖特性。
发明内容
为了降低精子解冻过程中的损伤,提高有效获能精子数,解决上述技术问题,本发明针对牦牛冷冻精液与精子特点,提供一种简便、合理的牦牛精子体外获能的方法,结果准确,易于操作,可用于牦牛胚胎体外生产及相关科学研究中,并为牦牛胚胎生物技术发展提供参考。
其技术方案如下:
一种牦牛精子体外获能的方法,包括如下步骤:
(1)从液氮罐中取出冷冻精液细管,空气中停留6s,然后投入37℃~38℃的恒温水浴锅中,待其融化1/2时取出;
(2)用灭菌卫生纸搽去细管外水分,再迅速用酒精棉球搽拭一次,置于超净工作台内使其完全溶解;
(3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理;
(4)将步骤(3)处理的精子,移入受精液中,精卵共培养,进行体外受精,检测精子获能效果;
(5)受精16~18h后,用早期胚胎培养液把受精卵洗涤3~5遍,转移至早期胚胎培养液中,48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。
进一步优选,所述步骤(3)上浮法步骤为:向溶解后的精液中加入1mL精子获能液,混匀后分装于4个小塑料离心管中,38.5℃CO2培养箱上浮1h,然后将4个离心管中的上清液小心收集到1个10mL离心管中,约0.6~0.8mL,700~800g离心洗涤2次,8~10min/次;洗涤后的精子沉淀用含2mg/mL肝素的精子获能液悬浮成2×107~4×107个/mL,38.5℃预孵获能处理25~30min,所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、1.0mM丙酮酸钠组成;所述TALP基础液由100mM氯化钠、3.1mM氯化钾、2.1mM氯化钙、04mM氯化镁、0.29mM磷酸二氢钠、21.6mM乳酸钠、10mM Hepes、25mM碳酸氢钠及抗生素组成;所述抗生素为75mg/L青霉素+50mg/L链霉素;所述CO2培养箱中:CO2含量5%、温度38.5℃、湿度饱和。
进一步优选,所述步骤(4)体外受精步骤为:将体外成熟的卵母细胞用受精液洗涤3~5遍,放入预孵2h的50μL受精液微滴中,每滴15~20枚;每微滴受精液加入25~50μL获能后的精子悬液,使精子的最终浓度为1×106个/mL,所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、0.09mM丙酮酸钠组成;所述TALP基础液由114mM氯化钠、3.2mM氯化钾、2.0mM氯化钙、0.5mM氯化镁、0.4mM磷酸二氢钠、25mM碳酸氢钠、10mM乳酸钠及抗生素组成;所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素;所述CO2培养箱中:CO2含量5%、温度38.5℃、湿度饱和。
进一步优选,所述步骤(5)中,早期胚胎培养液为基础液M199添加10%胎牛血清及抗生素;所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素;培养条件为CO2含量5%、温度38.5℃、湿度饱和。
本发明的有益效果:
本发明解冻的牦牛冷冻精液精子活力≥0.35,获能后精子活力≥0.7,受精用精子密度1×106~2×106个/mL,受精用精子畸形率≤15%,成熟卵母细胞受精后卵裂率≥60%。本发明用于牦牛冷冻精液精子体外获能技术与方法全面,操作方便,测定结果准确,易于牦牛胚胎体外生产使用。本发明用于牦牛冷冻精液精子体外获能技术与方法全面,操作方便,测定结果准确,易于牦牛胚胎体外生产使用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
解冻1支牦牛冷冻精液进行体外获能处理。
(1)从液氮罐中取出1支牦牛冷冻精液细管,空气中停留6s,然后投入37℃~38℃的恒温水浴锅中,待其融化1/2时取出。
(2)用灭菌卫生纸搽去细管外水分,再迅速用酒精棉球搽拭一次,置于超净工作台内使其完全溶解。
(3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理;上浮法步骤为:向溶解后的精液中加入1mL精子获能液,混匀后分装于4个小塑料离心管中,38.5℃CO2培养箱上浮1h,然后将4个离心管中的上清液小心收集到1个10mL离心管中,约0.6~0.8mL,700g离心洗涤2次,10min/次;洗涤后的精子沉淀用含2mg/mL肝素的精子获能液悬浮成2×107~4×107个/mL,38.5℃预孵获能处理25min,所述获能液由TALP基础液添加6mg/mL BSA、1.0mM丙酮酸钠组成;所述TALP基础液由100mM氯化钠、3.1mM氯化钾、2.1mM氯化钙、0.4mM氯化镁、0.29mM磷酸二氢钠、21.6mM乳酸钠、10mM Hepes、25mM碳酸氢钠及抗生素组成;所述抗生素为75mg/L青霉素+50mg/L链霉素;所述CO2培养箱中:CO2含量5%、温度38.5℃、湿度饱和。
(4)将步骤(3)处理的精子,移入受精液中,精卵共培养,进行体外受精,检测精子获能效果;体外受精步骤为:将体外成熟的卵母细胞用受精液洗涤3~5遍,放入预孵2h的50μL受精液微滴中,每滴20枚;每微滴受精液加入50μL获能后的精子悬液,使精子的最终浓度力1×106个/mL,所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、0.09mM丙酮酸钠组成;所述TALP基础液由114mM氯化钠、3.2mM氯化钾、2.0mM氯化钙、0.5mM氯化镁、0.4mM磷酸二氢钠、25mM碳酸氢钠、10mM乳酸钠及抗生素组成;所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素;所述CO2培养箱中:CO2含量5%、温度38.5℃、湿度饱和。
(5)受精18h后,用早期胚胎培养液把受精卵洗涤3~5遍,转移至早期胚胎培养液中,48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。早期胚胎培养液为基础液M199添加10%胎牛血清及抗生素;所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素;培养条件为CO2含量5%、温度38.5℃、湿度饱和。
实施例2
解冻2支牦牛冷冻精液进行体外获能处理。
(1)从液氮罐中取出2支牦牛冷冻精液细管,空气中停留6s,然后投入37℃~38℃的恒温水浴锅中,待其融化1/2时取出。
(2)用灭菌卫生纸搽去细管外水分,再迅速用酒精棉球搽拭一次,置于超净工作台内使其完全溶解。
(3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理;上浮法步骤为:向溶解后的精液中加入1.5mL精子获能液,混匀后分装于6个小塑料离心管中,38.5℃CO2培养箱上浮1h,然后将6个离心管中的上清液小心收集到1个15mL离心管中,约0.8~1.2mL,800g离心洗涤2次,8min/次;洗涤后的精子沉淀用含2mg/mL肝素的精子获能液悬浮成2×107~4×107个/mL,38.5℃预孵获能处理30min,所述获能液由TALP基础液添加6mg/mL BSA、1.0mM丙酮酸钠组成;所述TALP基础液由100mM氯化钠、3.1mM氯化钾、2.1mM氯化钙、0.4mM氯化镁、0.29mM磷酸二氢钠、21.6mM乳酸钠、10mM Hepes、25mM碳酸氢钠及抗生素组成;所述抗生素为75mg/L青霉素+50mg/L链霉素;所述CO2培养箱中:CO2含量5%、温度38.5℃、湿度饱和。
(4)将步骤(3)处理的精子,移入受精液中,精卵共培养,进行体外受精,检测精子获能效果;体外受精步骤为:将体外成熟的卵母细胞用受精液洗涤3~5遍,放入预孵2h的50μL受精液微滴中,每孔20枚卵母细胞;每微滴加入25μL获能后的精子悬液,使精子的最终浓度为1×106个/mL,所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、0.09mM丙酮酸钠组成;所述TALP基础液由114mM氯化钠、3.2mM氯化钾、2.0mM氯化钙、0.5mM氯化镁、0.4mM磷酸二氢钠、25mM碳酸氢钠、10mM乳酸钠及抗生素组成:所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素;所述CO2培养箱中:CO2含量5%、温度38.5℃、湿度饱和。
(5)受精16h后,用早期胚胎培养液把受精卵洗涤3~5遍,转移至早期胚胎培养液中,48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。早期胚胎培养液为基础液M199添加10%胎牛血清及抗生素;所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素;培养条件为CO2含量5%、温度38.5℃、湿度饱和。
实施例3
200枚牦牛卵母细胞体外受精用冷冻精液体外获能处理。
(1)从液氮罐中取出2支牦牛冷冻精液细管,空气中停留6s,然后投入37℃~38℃的恒温水浴锅中,待其融化1/2时取出。
(2)用灭菌卫生纸搽去细管外水分,再迅速用酒精棉球搽拭一次,置于超净工作台内使其完全溶解。
(3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理;上浮法步骤为:向溶解后的精液中加入1.5mL精子获能液,混匀后分装于6个小塑料离心管中,38.5℃ CO2培养箱上浮1h,然后将6个离心管中的上清液小心收集到1个15mL离心管中,约0.8~1.2mL,700~800g离心洗涤2次,8~10min/次;洗涤后的精子沉淀用含2mg/mL肝素的精子获能液悬浮成2×107~4×107个/mL,38.5℃预孵获能处理30min,所述获能液由TALP基础液添加6mg/mL BSA、1.0mM丙酮酸钠组成;所述TALP基础液由100mM氯化钠、3.1mM氯化钾、2.1mM氯化钙、0.4mM氯化镁、0.29mM磷酸二氢钠、21.6mM乳酸钠、10mM Hepes、25mM碳酸氢钠及抗生素组成;所述抗生素为75mg/L青霉素+50mg/L链霉素;所述CO2培养箱中:CO2含量5%、温度38.5℃、湿度饱和。
(4)将步骤(3)处理的精子,移入受精液中,精卵共培养,进行体外受精,检测精子获能效果;体外受精步骤为:将体外成熟的卵母细胞用受精液洗涤3~5遍,放入预孵2h的600μL四孔培养板受精液中,每孔50枚卵母细胞;每孔受精液加入100~200μL获能后的精子悬液,使精子的最终浓度为1×106个/mL,所述获能液由TALP基础液添加6mg/mLBSA、0.09mM丙酮酸钠组成;所述TALP基础液由114mM氯化钠、3.2mM氯化钾、2.0mM氯化钙、0.5mM氯化镁、0.4mM磷酸二氢钠、25mM碳酸氢钠、10mM乳酸钠及抗生素组成;所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素;所述CO2培养箱中:CO2含量5%、温度38.5℃、湿度饱和。
(5)受精16h后,用早期胚胎培养液把受精卵洗涤3~5遍,转移至早期胚胎培养液中,48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。早期胚胎培养液为基础液M199添加10%胎牛血清及抗生素;所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素;培养条件为CO2含量5%、温度38.5℃、湿度饱和。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,本发明的保护范围不限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内,通过技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种牦牛精子体外获能的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)从液氮罐中取出冷冻精液细管,空气中停留6s,然后投入37℃~38℃的恒温水浴锅中,待其融化1/2时取出;
(2)用灭菌卫生纸搽去细管外水分,再迅速用酒精棉球搽拭一次,置于超净工作台内使其完全溶解;
(3)精子获能用改良的TALP液上浮法处理;
(4)将步骤(3)处理的精子,移入受精液中,精卵共培养,进行体外授精,检测精子获能效果;
(5)受精16~18h后,用早期胚胎培养液把受精卵洗涤3~5遍,转移至早期胚胎培养液中,48h后根据卵裂情况评估精子获能情况。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)上浮法步骤为:向溶解后的精液中加入1mL精子获能液,混匀后分装于4个小塑料离心管中,38.5℃CO2培养箱上浮1h,然后将4个离心管中的上清液小心收集到1个10mL离心管中,约0.6~0.8mL,700~800g离心洗涤2次,8~10min/次;洗涤后的精子沉淀用含2mg/mL肝素的精子获能液悬浮成2×107~4×107个/mL,38.5℃预孵获能处理25~30min,所述获能液由TALP基础液添加6mg/mL BSA、1.0mM丙酮酸钠组成;所述TALP基础液由100mM氯化钠、3.1mM氯化钾、2.1mM氯化钙、0.4mM氯化镁、0.29mM磷酸二氢钠、21.6mM乳酸钠、10mM Hepes、25mM碳酸氢钠及抗生素组成;所述抗生素为75mg/L青霉素+50mg/L链霉素;所述CO2培养箱中:CO2含量5%、温度38.5℃、湿度饱和。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(4)体外受精步骤为:将体外成熟的卵母细胞用受精液洗涤3~5遍,放入预孵2h的50μL受精液微滴中,每滴15~20枚;每微滴受精液加入50μL获能后的精子悬液,使精子的最终浓度为1×106个/mL,所述获能液由TALP基础液添加6mg/mL BSA、0.09mM丙酮酸钠组成;所述TALP基础液由114mM氯化钠、3.2mM氯化钾、2.0mM氯化钙、0.5mM氯化镁、0.4mM磷酸二氢钠、25mM碳酸氢钠、10mM乳酸钠及抗生素组成;所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素;所述CO2培养箱中:CO2含量5%、温度38.5℃、湿度饱和。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤(5)中,早期胚胎培养液为基础液M199添加10%胎牛血清及抗生素;所述抗生素为30mg/L青霉素+20mg/L链霉素;培养条件为CO2含量5%、温度38.5℃、湿度饱和。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310134124.4A CN103173406B (zh) | 2013-04-18 | 2013-04-18 | 一种牦牛精子体外获能的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310134124.4A CN103173406B (zh) | 2013-04-18 | 2013-04-18 | 一种牦牛精子体外获能的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103173406A true CN103173406A (zh) | 2013-06-26 |
CN103173406B CN103173406B (zh) | 2016-05-11 |
Family
ID=48633598
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310134124.4A Expired - Fee Related CN103173406B (zh) | 2013-04-18 | 2013-04-18 | 一种牦牛精子体外获能的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103173406B (zh) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103335933A (zh) * | 2013-06-28 | 2013-10-02 | 浙江星博生物科技有限公司 | 一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂 |
CN104195105A (zh) * | 2014-08-19 | 2014-12-10 | 杭州安体科技有限公司 | 一种提高人精子活力的体外培养体系试剂盒及其使用方法 |
CN105154516A (zh) * | 2015-10-15 | 2015-12-16 | 中国农业大学 | 一种灵长类实验动物精子质量检测方法 |
CN106520680A (zh) * | 2016-10-11 | 2017-03-22 | 河南科技大学 | 一种牛精子获能液及精子体外获能方法 |
CN107365738A (zh) * | 2017-08-07 | 2017-11-21 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种奶牛与黄牛异种体外受精胚胎的制备方法 |
CN108148800A (zh) * | 2018-01-29 | 2018-06-12 | 浙江省医学科学院 | 一种精子体外获能液、用于体外受精的试剂盒及哺乳动物体外受精方法 |
-
2013
- 2013-04-18 CN CN201310134124.4A patent/CN103173406B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
郭宪 等: "提高牛胚胎体外生产效率的研究进展", 《中国畜牧兽医》 * |
郭宪: "牛卵母细胞体外成熟与体外受精的研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)农业科技辑》 * |
阎萍 等: "牦牛卵巢卵母细胞体外培养成熟条件的建立", 《畜牧与兽医》 * |
鲁京兰 等: "肝素、咖啡因、丙酮酸钠、BSA对延边黄牛卵母细胞体外受精效果的影响", 《中国畜牧兽医》 * |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103335933A (zh) * | 2013-06-28 | 2013-10-02 | 浙江星博生物科技有限公司 | 一种基于流式细胞术的精子顶体反应检测试剂 |
CN104195105A (zh) * | 2014-08-19 | 2014-12-10 | 杭州安体科技有限公司 | 一种提高人精子活力的体外培养体系试剂盒及其使用方法 |
CN104195105B (zh) * | 2014-08-19 | 2017-10-27 | 杭州安体科技有限公司 | 一种提高人精子活力的体外培养体系试剂盒及其使用方法 |
CN105154516A (zh) * | 2015-10-15 | 2015-12-16 | 中国农业大学 | 一种灵长类实验动物精子质量检测方法 |
CN106520680A (zh) * | 2016-10-11 | 2017-03-22 | 河南科技大学 | 一种牛精子获能液及精子体外获能方法 |
CN107365738A (zh) * | 2017-08-07 | 2017-11-21 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种奶牛与黄牛异种体外受精胚胎的制备方法 |
CN107365738B (zh) * | 2017-08-07 | 2020-02-14 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种奶牛与黄牛异种体外受精胚胎的制备方法 |
CN108148800A (zh) * | 2018-01-29 | 2018-06-12 | 浙江省医学科学院 | 一种精子体外获能液、用于体外受精的试剂盒及哺乳动物体外受精方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103173406B (zh) | 2016-05-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103173406A (zh) | 一种牦牛精子体外获能的方法 | |
Foss et al. | Effect of potential oocyte transport protocols on blastocyst rates after intracytoplasmic sperm injection in the horse | |
Shirazi et al. | Vitrification of in vitro produced ovine embryos at various developmental stages using two methods | |
CN102578079A (zh) | 马属动物精液稀释基础液及其配制方法和使用方法 | |
CN101392236A (zh) | 猪精液稀释防冻剂 | |
Mito et al. | Birth of piglets from in vitro–produced porcine blastocysts vitrified and warmed in a chemically defined medium | |
CN105052894B (zh) | 一种gv期卵母细胞冷冻保存液及冷冻保存方法 | |
CN101731199A (zh) | 一种猪精液的保存液 | |
CN107384854A (zh) | 人类卵母细胞胞浆成熟优化液 | |
CN103898048A (zh) | 小鼠裸卵的体外成熟培养方法 | |
Abdalla et al. | Vitrification of ICSI-and IVF-derived bovine blastocysts by minimum volume cooling procedure: effect of developmental stage and age | |
Sefid et al. | Vitamin K2 improves developmental competency and cryo-tolerance of in vitro derived ovine blastocyst | |
Dutta et al. | In vitro blastocyst development of post-thaw vitrified bovine oocytes. | |
CN204244993U (zh) | 一种新型胚胎封闭式玻璃化冷冻载杆和套管 | |
Çizmeci et al. | Effects of heat-stress on oocyte number and quality and in vitro embryo production in Holstein heifers | |
Yang et al. | Optimization of cryopreservation of buffalo (Bubalus bubalis) blastocysts produced by in vitro fertilization and somatic cell nuclear transfer | |
CN101962626A (zh) | 一种犊牛体外胚胎培养液 | |
Kouamo et al. | A comparative study of parthenogenetic activation and in vitro fertilization of in vitro matured caprine oocytes | |
Skidmore et al. | Reproductive technologies in camelids | |
Suthar et al. | Bovine in vitro embryo production: An overview | |
CN110074098B (zh) | 一种小鼠精子冻存液及其制备方法和应用 | |
Khanday et al. | Effect of antioxidant ascorbic acid on in vitro maturation of Caprine oocytes under normal and elevated temperatures | |
CN102703383A (zh) | 正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用 | |
Singh et al. | Effect of granulosa cells monolayer and oviductal epithelial cells co-culture on cleavage rate and embryo development of in-vitro fertilized goat oocytes | |
Kumar et al. | Factors affecting the in vitro embryo production in buffalo (Bubalus bubalis): A review |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20160511 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |