CN113249304B - 萝卜硫素在制备牛卵母细胞体外成熟液中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了萝卜硫素在制备牛卵母细胞体外成熟液中的应用。提供了用于促进牛卵母细胞体外成熟的培养液，该培养液中的萝卜硫素对牛卵母细胞体外成熟和体外发育能力有明显的促进作用。

Description

萝卜硫素在制备牛卵母细胞体外成熟液中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及萝卜硫素在制备牛卵母细胞体外成熟液中的应用。
背景技术
奶业惠及亿万人民的身体健康，是关系国计民生的大产业。近年来，面对国际供求关系调整，特别是产能调整，我国奶业继续在调整中优化，养殖规模水平提升，但成本高、效益低、优质高产奶牛存在严重缺口等仍是我国奶牛养殖业面临的难题。因此，如何提升优秀种质的扩繁能力，是我国奶业种业面临的新的挑战和机遇。
体外胚胎生产(in vitro production，IVP)技术能够充分利用优质种公牛和良种母牛的遗传资源，获得大量具有较高遗传品质的牛体外胚胎，对于良种母牛繁殖潜力的挖掘、快速扩繁以及种质资源保护具有重要的价值。作为IVP技术的基础，卵母细胞体外成熟(in vitro maturation，IVM)技术的应用范围越来越广泛。通过IVM培养卵巢有腔卵泡的卵母细胞，不仅为体外受精、性别控制、转基因及克隆动物的生产提供大量丰富的卵源，还为胚胎的工厂化和商品化生产提供契机。
卵母细胞成熟是一个涉及核、质、膜等成熟的复杂动态生物学过程。在这一过程中发生的一系列复杂事件，不仅取决于核成熟过程中染色体的正确分离，还包括细胞器的重新分布和维持这一过程所需的mRNA、蛋白和转录因子的存储。然而，由于体内外环境的差异，体外成熟卵母细胞能够成功完成减数分裂，但却不能完全支持早期胚胎发育。囊胚率低、异常胚胎发育率高、卵子得不到有效利用的问题严重限制了体外胚胎生产的产业化应用。
目前，在成熟液中添加一些生长因子、激素或抗氧化物质等可以达到提高卵母细胞体外成熟质量的目的。例如：(1)1.0μmol/L的白藜芦醇可促进牛卵母细胞的体外成熟及体外受精后的胚胎发育；(2)成熟液中添加10-9mol/L的褪黑素可显著提高牛卵母细胞的成熟质量及体外受精早期胚胎质量。然而，由于体外培养环境的特殊性，在实际应用过程中，不同抗氧化剂的稳定性，会随外界环境条件的改变而改变，从而影响其抗氧化活性。
萝卜硫素(sulforaphane，SFN)是众多异硫氰酸酯中的一种，是硫代葡萄糖苷的一种水解产物，它广泛存在于十字花科植物中，在西兰花中含量最为丰富，其次为空心菜、甘蓝、花椰菜、青花菜等。近30年来对SFN的研究表明，SFN是蔬菜中防癌、抗癌效果最好的天然活性物质之一，对前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等都具有很好的防治效果。同时，SFN还具有代谢解毒、抗氧化、抗菌、增强免疫和抗炎等多种生物学活性。研究发现，SFN通过激活Nrf2信号通路，诱导II相解毒酶和抗氧化酶的表达发挥其生物学功能。II相酶是生物转换过程中重要的代谢酶，能将亲电子物质转化为低毒的代谢产物被排出体外。SFN是非常强的“II相解毒酶”诱导剂，可诱导血红素加氧酶-1(HO-1)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、NAD(P)H醌氧化还原酶1(NQO1)等大量II相酶基因的转录，从而激活体内“谷胱甘肽”和“硫氧还蛋白”两大抗氧化防御系统，起到解毒和细胞保护功能。
SFN已在多种疾病中被研究及使用，包括神经退行性疾病、呼吸系统疾病、心血管系统疾病和肿瘤等，并显示出巨大的应用前景和开发潜质。目前，有关萝卜硫素的专利多集中在其提取制备技术以及疾病保护应用方面，例如萝卜硫素包合物制备方法(CN108992675A)，萝卜硫素的提取方法(CN108912024A)，一种萝卜硫素提取工艺(CN108048498A)，萝卜硫素的包埋物及其制备方法(CN111938155A)，一种萝卜硫素提取物的制备方法(CN111705091A)，萝卜硫素在抑制端粒酶活性及制备抗癌药物中的用途(CN109771409A)，萝卜硫素在制备用于预防糖尿病性病变的食品、保健品或药品中的应用(CN108743576A)等。但关于SFN在体外成熟卵母细胞中的应用迄今未见相关报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供萝卜硫素在制备牛卵母细胞体外成熟液中的应用，其目的在于添加SFN以提高牛体外成熟卵母细胞发育潜能。具体的说，本发明是提供一种促进牛卵母细胞体外成熟的试剂，在培养液中添加SFN可有效提高牛卵母细胞的体外成熟率及体外受精早期胚胎的发育率。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
萝卜硫素在制备牛卵母细胞体外成熟液中的应用。
如上所述的应用，优选地，所述萝卜硫素在牛卵母细胞体外成熟试剂中的用量为1～5μmol/L。
如上所述的应用，优选地，所述萝卜硫素在牛卵母细胞体外成熟试剂中的用量为1μmol/L。
如上所述的应用，优选地，所述牛卵母细胞体外成熟试剂包括1×TCM199，0.01IU/mL FSH，0.01IU/mL LH，1μg/mL E2，10％FBS，10μg/mL肝素，50ng/mL EGF，100ng/mL IGF，50μg/mL链霉素，100U/mL青霉素和1～5μmol/L萝卜硫素。
如上所述的应用，优选地，所述萝卜硫素为1μmol/L。
一种促进牛卵母细胞体外成熟的培养液，其包括1×TCM199，0.01IU/mL FSH，0.01IU/mL LH，1μg/mL E2，10％FBS，10μg/mL肝素，50ng/mL EGF，100ng/mL IGF，50μg/mL链霉素，100U/mL青霉素和1～5μmol/L萝卜硫素。
如上所述的促进牛卵母细胞体外成熟的培养液，所述萝卜硫素为1μmol/L。
本发明首次在卵母细胞体外成熟培养液中添加SFN，促进卵母细胞的体外成熟率和体外发育能力，提供了SFN的新用途。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的萝卜硫素在制备牛卵母细胞体外成熟液中的应用，提供了用于促进牛卵母细胞体外成熟的培养液。SFN对牛卵母细胞体外成熟和体外发育能力有明显的促进作用。
本发明提供的促进牛卵母细胞体外成熟的培养液，在基础培养液中添加SFN有效提高了牛卵母细胞的体外成熟率及体外受精早期胚胎的发育率。
本发明SFN是从十字花科植物中提取的天然活性物质，是一种天然抗氧化剂，对卵母细胞毒害作用较小。与成熟液中添加10-7mol/L褪黑素(melatonin，MT)的应用效果相比，1μmol/L SFN显著提高了卵母细胞体外成熟质量。本发明提供了萝卜硫素的一种新用途，不仅扩大了萝卜硫素的应用范围，提高了其应用价值，还有助于进一步开发新的体外培养液，用于促进牛卵母细胞体外成熟。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明所用TCM199和胎牛血清购自Gibco公司，其他试剂除特别说明外均购自Sigma-Aldrich公司。
实施例1
1、卵母细胞体外成熟
(1)卵母细胞的采集
从河北省廊坊市大厂县屠宰场采集卵巢，放入28～30℃含双抗的灭菌生理盐水中，2h内运回实验室。用提前预热30℃左右的灭菌生理盐水将卵巢洗涤2～3遍，使用真空蠕动泵抽取卵巢上3～6mm卵泡内的卵泡液，在体式显微镜下，用口吸管挑选细胞质均匀，并有2层以上致密卵丘细胞包裹的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte-complexes，COCs)用于体外成熟。
(2)卵母细胞的体外成熟
将挑选出的COCs在洗卵液中洗涤2次，再在成熟液中洗涤2次后，移入在CO2培养箱中至少已经平衡2h以上的四孔板中(每孔750μL成熟液，50枚COCs)，其中成熟液分别添加0，1μmol/L，5μmol/L和10μmol/L浓度的SFN作为0，1μM，5μM和10μM SFN(萝卜硫素)处理组，在38.5℃，5％CO2，饱和湿度的CO2培养箱中成熟培养22-24h。
(2)中采用的洗卵液为TCM199(10×)，0.22g/L丙酮酸钠，3.58g/LHepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，0.146g/L L-谷氨酰胺，0.168g/L NaHCO3，10mg/L肝素，2％FBS(胎牛血清)，50μg/mL链霉素，100U/mL青霉素。
(2)中采用的卵母细胞体外成熟液：TCM199(1×)，0.01IU/mL FSH(卵泡刺激素)，0.01IU/mL LH(黄体生成素)，1μg/mL E2(雌二醇)，10％FBS(胎牛血清)，10μg/mL肝素，50ng/mL EGF(表皮生长因子)，100ng/mL IGF(胰岛素样生长因子)，50μg/mL链霉素，100U/mL青霉素。
2、体外受精
(1)精液处理
将牛冷冻精液(购自北京奶牛中心)从液氮罐中取出，38℃水浴解冻后，将精液置于含有6mL洗精液的15mL离心管中，615g离心8min，弃上清，重复洗涤一次。用洗精液悬浮精子，在显微镜下用血细胞计数板调整精子密度为2×106个/mL，37℃静置备用。
其中，采用的洗精液为112mmol/L NaCl，4.02mmol/L KCl，2.25mmol/L CaCl2·2H2O，0.83mmol/L NaH2PO4·H2O，0.52mmol/L MgCl2·6H2O，37mmol/L NaHCO3，1.25mmol/L丙酮酸钠，10μg/mL肝素，10mmol/L咖啡因，4mg/mL牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，50μg/mL链霉素，100U/mL青霉素。
(2)体外受精
将体外培养22～24h的COCs用受精液洗3遍，之后移入在培养箱中已平衡至少2h以上的受精液微滴中，每50μL受精滴放15～20枚COCs。取50μL(1)中处理后的精子悬液加入含有COCs的受精滴中，38.5℃，5％CO2，饱和湿度的CO2培养箱中精卵孵育过夜。
其中，采用的受精液为112mmol/L NaCl，4.02mmol/L KCl，2.25mmol/L CaCl2·2H2O，0.83mmol/L NaH2PO4·H2O，0.52mmol/L MgCl2·6H2O，37mmol/L NaHCO3，1.25mmol/L丙酮酸钠，10μg/mL肝素，4mg/mL BSA，50μg/mL链霉素，100U/mL青霉素。
3、胚胎体外培养
将受精后的COCs用移液枪反复轻轻吹打去除卵丘细胞，并不断在体视镜下观察脱除情况，待大部分COCs都脱除后，将受精卵用胚胎培养前期液洗3遍，放到在培养箱中至少已平衡2h以上的前期液中进行培养，每100μL前期液放20～25枚受精卵。48h后，统计卵裂率。将所有卵裂的胚胎移至胚胎培养后期液中继续培养，隔天半量换液，体外培养7天后，统计囊胚发育率。
其中，所用的胚胎培养前期液的配方为含：109.5mmol/L NaCl，3.1mmol/L KCl，26.2mmol/L NaHCO3，0.8mmol/L MgCl2·6H2O，1.19mmol/L KH2PO4，0.4mmol/L丙酮酸钠，1.5mmol/L葡萄糖，5mmol/L半乳糖酸钙，6mg/mL BSA，50×必需氨基酸，100×非必需氨基酸，0.15mg/mL谷氨酰胺。
上述胚胎培养后期液的配方为含：109.5mmol/L NaCl，3.1mmol/L KCl，26.2mmol/L NaHCO3，0.8mmol/L MgCl2·6H2O，1.19mmol/L KH2PO4，0.4mmol/L丙酮酸钠，1.5mmol/L葡萄糖，5mmol/L半乳糖酸钙，10％FBS，50×必需氨基酸，100×非必需氨基酸，0.15mg/mL谷氨酰胺。
4、数据统计
实验数据采用SAS统计软件使用单因素方差分析(ANOVA)和Duncan’s检验判断不同处理间的差异显著性，P＜0.05即认为差异显著。
5、成熟液中添加SFN可显著提高牛卵母细胞的体外成熟率
选择SFN添加浓度为0，1μmol/L，5μmol/L和10μmol/L进行筛选，统计卵母细胞第一极体排出率，结果见表1。结果显示，与对照组相比，1μmol/L SFN显著提高卵母细胞第一极体排出率，10μmol/L SFN添加组显著降低卵母细胞第一极体排出率(P＜0.05)；5μmol/LSFN添加组与对照组差异不显著(P>0.05)。
表1 不同SFN浓度对牛卵母细胞体外成熟的影响
Figure BDA0003100328390000071
注：第一极体排出率＝排出第一极体卵母细胞个数/卵母细胞数；同列不同字母(a-c)代表差异显著(P＜0.05)。
6、成熟液中添加SFN可提高牛体外受精胚胎发育率
通过统计体外受精胚胎的卵裂率和囊胚率，比较分析SFN不同添加浓度组体外受精胚胎的发育率(见表2)。结果显示，各组间的卵裂率差异不显著(P>0.05)；1μmol/L SFN添加组囊胚率显著高于对照组，5μmol/L和10μmol/LSFN添加组囊胚率显著低于对照组(P＜0.05)。
表2 不同SFN浓度对牛体外受精胚胎发育的影响
Figure BDA0003100328390000072
注：卵裂率＝卵裂数×100/胚胎培养数，囊胚率＝囊胚数×100/卵裂培养数；同列不同字母(a-d)代表差异显著(P＜0.05)。
7、对比例
成熟液中添加SFN与褪黑素(melatonin，MT)的应用效果对比
在成熟液中分别添加1μmol/L的SFN和10-7mol/L的MT，体外受精后比较胚胎的发育率，结果见表3。结果显示，1μmol/L的SFN组和10-7mol/L的MT组卵母细胞受精后胚胎卵裂率与对照组无显著差异(P>0.05)，但囊胚率均显著高于对照组(P＜0.05)；与10-7mol/L的MT组相比，1μmol/L的SFN组囊胚发育率显著提高(P＜0.05)。
表3 SFN与MT对牛体外受精胚胎发育效果对比
Figure BDA0003100328390000081
由以上结果可知，1μmol/L SFN能促进牛卵母细胞体外成熟和体外受精后的囊胚发育率，且效果要优于10-7mol/L的MT，在改善牛体外成熟卵母细胞发育能力方面具有潜在的应用价值。

Claims (2)

1.萝卜硫素在制备提高牛卵母细胞体外成熟率和体外受精早期胚胎的发育率的体外成熟液中的应用，其特征在于，所述体外成熟液的组成为1× TCM199，0.01 IU/mL FSH，0.01 IU/mL LH，1 μg/mL E2，10% FBS，10 μg/mL 肝素，50 ng/mL EGF，100 ng/mL IGF，50μg/mL链霉素，100 U/mL青霉素和1~5 μmol/L萝卜硫素。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述萝卜硫素为1 μmol/L。
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