CN101225373A

CN101225373A - 一种牛卵母细胞体外成熟无血清培养基

Info

Publication number: CN101225373A
Application number: CNA2008100566396A
Authority: CN
Inventors: 王海; 张家新; 张红霞; 安晶; 张向利; 吴亦芳; 赵孟彬; 王玉忠
Original assignee: BEIJING JINXIUDADI AGRICULTURE Co Ltd
Current assignee: BEIJING JINXIUDADI AGRICULTURE Co Ltd
Priority date: 2008-01-23
Filing date: 2008-01-23
Publication date: 2008-07-23

Abstract

本发明涉及“一种牛卵母细胞体外成熟无血清培养基”，属于细胞生物学领域。一种牛卵母细胞体外成熟无血清培养基IVMBM－I，包括TCM199培养基、卵母细胞成熟的激素和抗菌药，其特征在于：还添加有如下成分：Sodium pyruvate，Taurine，Insulin，Selenium，BSA，HEPES，TGF－a，L－Glutamine和EGF，且不含有血清。本发明通过添加上述成分替代常规用血清，并通过体外成熟、体外受精以及体外发育实验证明上述成分的添加能完全替代血清在卵母细胞成熟过程中所起的作用，避免了血清中一些成分对卵母细胞的不利影响，且能精确定量，具有很好的重复性。

Description

一种牛卵母细胞体外成熟无血清培养基

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，涉及一种牛卵母细胞体外成熟无血清培养基。

背景技术

动物细胞培养是一种应用最为广泛的体外培养技术，该技术起源于19世纪。1885年科学家把鸡胚的神经板在温热的盐水中成功地维持存活了若干天，是首次体外培养的尝试。随着抗菌素、合成培养液、胰蛋白酶处理技术的发展以及器皿的改进，动物细胞培养技术得到了飞速的发展。培养液的选择和配制是体外培养技术的一个关键环节。一般培养液由2部分组成：基础培养基和血清。

基础培养基自行配制或用现成的化学合成培养基，常用的化学合成培养基有Eagle(包括BME、MEM、DME等)、F10、F12、TCM199、RPMI1640、EBSS、HBSS等等。这些化学合成培养基具有适当的渗透压、能源、氨基酸、维生素、微量元素及缓冲pH值，可以满足许多类型培养细胞的最基本的需要，它虽可维持细胞一段时间的存活，但由于缺乏细胞有丝分裂所必需的各种激素和生长因子，细胞不能在这类相当于平衡盐溶液的体系中进行分裂。要想使细胞进一步增生、生长必须添加血清。

血清可以提供细胞生长所需的各种激素和生长因子，目前已成为维持细胞有丝分裂不可缺少的物质。常用的血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、人血清和马血清等。培养基中血清的浓度范围为5～20％，以10％浓度最为常用。但血清有一系列缺点，特别是它的易变性和非限定性，给实验工作带来了难以精确定量和难以重复等困难。因此，尽管它的应用已有相当长久的历史，但决不是理想的培养基成分。

20世纪60年代利伯曼和奥维等首先进行了无血清培养的尝试，经山根、佐藤春太郎等科学家的研发，一些无血清培养基(又称无血清限定培养基或简称限定培养基)已经在一些细胞培养中开始使用。这类培养基主要以各种激素(如胰岛素、各种前列腺素、生长激素等)、生长因子(如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、MSA等)、维生素、载体蛋白如转铁蛋白(铜蓝蛋白等)、微量元素(镉、硒等)、乙醇胺以及贴壁与展开因子(如昆布氨酸、纤维网素等)取代含血清培养基中的血清部分。这样，不但排除了血清的干扰，而且，还可以在更接近体内的条件下维持细胞的功能和活力。山根等发现，不同组织学类型的细胞所需要的活性物质完全不同，而不同动物的同一组织学类型的细胞所需要的活性物质则极为类似，仅在量上有所区别。据此，他们提出“组织定型专一培养基”的概念，以图设计出专一地适用于各种细胞类型的无血清培养基。可以预料，由于无血清培养基的发展，许多有关细胞培养的生物学研究工作将由定性研究进展到定量研究。

随着奶牛业的发展，牛的胚胎工程也发展迅速，体外大规模生产胚胎成为可能。但是体外生产的胚胎，胎牛体形偏大，常常造成难产，给生产造成巨大的损失，严重制约着牛胚胎体外生产和胚胎移植的产业进一步向前发展。大量研究表明，培养液内添加血清是造成牛胎儿肥大综合症的主要因素之一。一些印迹基因调控着胎儿的体重，如Igf2，H19和Igf2r等基因，而血清对印迹基因正常表达有着不利影响。在早期胚胎发育中发现，这些基因在无血清培养胚胎的mRNA丰度远远高于含血清培养的胚胎，可见血清影响了这些基因的正常转录。所以用含有血清培养基生产的胚胎，移植后出生的个体往往是体重偏大。此外，血清中一些成份不利于胚胎基因的正常表达，进而影响胚胎进一步发育，造成体外胚生产牛胎妊娠率和产犊率低。尽管血清可以提供体外卵母细胞生长发育所需的营养物质，但它的副作用也是不容忽视的。用含有血清的培养液培养卵母细胞会导致胞质内脂滴增多，线粒体数量下降，严重地影响受精后胚胎的脂肪和能量新陈代谢，干扰了胚胎发育过程基因正常表达，致使胚胎的质量下降，所以用含有血清培养液生产的胚胎，其妊娠率和产犊率有所降低。

另外在一些特定实验情况下，如需观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时很难排除血清中生长因子的干扰作用。血清含有蛋白成分诱导细胞在培养过程中分泌某种物质(抗体、生长因子)，这些产物和血清内的蛋白成分影响了卵母细胞的正常生长发育。

总之，无血清培养剂这一新技术在细胞生物学方面应用的前途是无限广阔的，它不仅有利于探讨和阐明细胞体外培养生理、生化和成分生物合成等一系列问题，而且一些生产中问题得以解决，将可以为防病治病做出很大的贡献。

发明内容

本发明针对血清对牛卵母细胞体外成熟的缺陷，提供一种牛卵母细胞体外成熟无血清培养基IVMBM-I，不仅有利于阐明培养基成分对卵母细胞发育的作用，也能克服目前牛胚胎生物工程中存在的一些问题。

一种牛卵母细胞体外成熟无血清培养基IVMBM-I，包括TCM199培养基、卵母细胞成熟的激素和抗菌药，其特征在于：还添加有如下成分：Sodium pyruvate，Taurine，Insulin，Selenium，BSA，HEPES，TGF-a，L-Glutamine和EGF，且不含有血清。

上述添加成分的浓度为：0.91 Sodium pyruvate，5mM Taurine，51μg/ml Insulin，5nMSelenium，1mg/ml BSA，5mM HEPES，10ng/ml TGF-a，1mmol/ml L-Glutamine和10ng/ml EGF。

所述卵母细胞成熟的激素为10μg/ml FSH(Follicle-stimulating Hormone)和1μg/mlLH(Luteinizing Hormone)，1μg/ml Estradiol。

所述抗菌药为0.0625g Penicillium和0.05g Streptomycin。

Sodium pyruvate是细胞生长发育的碳源，同时作为能量被卵母细胞利用，提高卵母细胞整体发育水平。另外，丙酮酸可生成丙氨酸，因为它可以与氨基转移反应相结合，故在氮代谢方面也起着重要的作用。

添加L-Glutamine能促进各种氨基酸进入细胞膜，它所含的氨基是核酸中嘌呤和嘧啶的来源，也是能量和碳的来源，参与蛋白质和核酸代谢，卵母细胞需要L-Glutamine来合成核酸和蛋白质，促进卵母细胞生长和分裂。

EGF是一种多肽的生长因子。促进低分子量化合物从细胞外主动运送到细胞内，改善细胞发育环境，促进细胞的核、质成熟。

BSA是一种清蛋白，参与卵母细胞的蛋白代谢，为细胞成熟提供N源。

HEPES稳定培养液的酸碱度。

Insilin促进卵母周围的颗粒细胞增生、分化和雌二醇的分泌，增强颗粒细胞与卵母细胞物质和信息的交流。

TGF-a是一种细胞因子，促进颗粒细胞生长，参与细胞代谢调控，促进DNA的合成，在信号转导方面起着重要作用。

Taurine具有抗氧化作用，提高细胞的活力，诱发细胞产生新的遗传物质，促进细胞增殖。

Selenium参与清除细胞内的过氧化物，防止产生自由基，具有抗氧化作用，防止细胞凋亡。

本发明通过添加上述成分替代常规用血清，并通过体外成熟、体外受精以及体外发育实验证明上述成分的添加能完全替代血清在卵母细胞成熟过程中所起的作用，避免了血清中一些成分对卵母细胞的不利影响。

针对含有血清的培养液培养卵母细胞会导致胞质内脂滴增多，线粒体数量下降的情况，在本发明无血清培养基中，我们添加向细胞内转运离子的转铁蛋白(TGF-a)，调节葡萄糖摄取量的胰岛素(Insulin)和作为脂类和其他生长因子的载体的蛋白质(BSA)，改善卵母细胞内能量和脂肪代谢代谢，减少胞质内脂滴形成，提高线粒体的数量，促进卵母细胞正常生长发育。

我们用上述功能清楚的试剂代替血清，使一些印迹基因正常表达，减少胎儿肥大综合症的发生，避免奶牛生产中难产问题，有助于体外胚胎生产向产业化方向进一步发展。

总之，这种无血清培养基能为卵母细胞提供一个营养成分完全且平衡的环境。上述添加成分均为标准试剂，其成分含量标准均能较好的控制，可达到生物洁净要求，质量稳定，具有很好的重复性，而血清是动物试剂能造成疾病传播，特别对胚胎基因的表达有着严重的影响，因此本发明培养基能精确定量，又能克服血清对胚胎发育的不利影响。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。

1.主要仪器设备

CO₂培养箱、恒温台、视体显微镜、水浴锅、恒温箱、超净台、天平、容量瓶。

2.牛卵母细胞体外成熟

从屠宰场收集卵巢。用加有双抗25℃生理盐水，在3小时之内运至实验室。用注射器抽取卵巢上2-7mm大的卵泡，在体视解剖镜下挑选包有几层颗粒细胞、胞质均匀一致的卵母细胞复合体(COCs)用于体外成熟培养，在体外成熟24小时，以排出极体为成熟标志。

IVMBM-I培养液组成：TCM199+10μg/ml FSH(Follicle-stimulating Hormone)+1μg/mlLH(Luteinizing Hormone)+1μg/ml Estradiol+0.0625g Penicillium+0.05g Streptomycin，添加成分有：0.91 Sodium pyruvate，5mM Taurine，51μg/ml Insulin，1mg/mlBSA，5mM HEPES，10ng/mlTGF-a，1mmol/ml L-Glutamine和10ng/ml EGF和5nM Selenium。

对照组培养液(TCM199+血清)：TCM199+10％FCS(Fetal Calf Serum)+10μg/ml FSH(Follicle-stimulating Hormone)+1μg/ml LH(Luteinizing Hormone)+1μg/ml Estradiol+0.0625gPenicillium+0.05g Streptomycin

表1.应用IVMBM-I培养液牛卵母细胞体外成熟的效果

培养液	重复次数	卵母细胞和颗粒细胞复合体数	成熟率％
培养液	重复次数	卵母细胞和颗粒细胞复合体数	成熟率％	IVMBM-I对照组(TCM199+血清)	88	729947	80.4％(586/729)^a82.3％(780/947)^a

注：1.在同一列内有不同上标字母的差异显著(P＜0.005)

3.成熟的卵母细胞体外受精

受精液是BO液，精子浓度为到1.5×10⁶个/ml。受精20小时，然后移入CR1aa液中发育培养。CR1aa液为CR1+1％NEAA(Non-essential Amino Acids)+1％EAA(Essential Amino Acids)+4mg/ml FAF-BSA(Fatty Acid Free-Bovine Serum Albumin)。在第3天检查卵裂率，在第7天记录囊胚

表2.成熟的卵母细胞受精及其胚胎体外发育效果

培养液	重复次数	成熟的卵母细胞数	卵裂率％	囊胚率％
培养液	重复次数	成熟的卵母细胞数	卵裂率％	囊胚率％	IVMBM-I对照组(TCM199+血清)	66	436529	80.5％(351/436)^a81.9％(433/529)^a	30.9％(135/436)^a31.8％(168/529)^a

注：1.在同一列内有不同上标字母的差异显著(P＜0.005)

总之，通过多次重复实验，结果表明IVMBM-I能使牛卵母细胞体外成熟达到80％以上，与对照组(含血清的培养剂)没有显著的差异。成熟的卵母细胞体外受精后，卵裂率和囊胚率与含血清组没有显著差异，表明IVMBM-I培养基用于牛卵母细胞体外成熟是可行的。

Claims

1.一种牛卵母细胞体外成熟无血清培养基IVMBM-I，包括TCM199培养基、卵母细胞成熟的激素和抗菌药，其特征在于：还添加有如下成分：Sodium pyruvate，Taurine，Insulin，Selenium，BSA，HEPES，TGF-a，L-Glutamine和EGF，且不含有血清。

2.根据权利要求1所述的牛卵母细胞体外成熟无血清培养基IVMBM-I，所述添加成分的浓度为：0.91 Sodium pyruvate，5mM Taurine，51μg/ml Insulin，5nM Selenium，1mg/mlBSA，5mM HEPES，10ng/ml TGF-a，1mmol/ml L-Glutamine和10ng/ml EGF。

3.根据权利要求1所述的牛卵母细胞体外成熟无血清培养基IVMBM-I，所述卵母细胞成熟的激素为10μg/ml FSH和1μg/ml LH，1μg/ml Estradiol。

4.根据权利要求1所述的牛卵母细胞体外成熟无血清培养基IVMBM-I，所述抗菌药为0.0625g Penicillium和0.05g Streptomycin。