CN107475178A - 一种小鼠卵巢颗粒细胞分离及培养方法 - Google Patents

一种小鼠卵巢颗粒细胞分离及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种小鼠卵巢颗粒细胞分离及培养方法，包括步骤：(a)雌性小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)；(b)颈椎脱臼法处死小鼠，分离小鼠卵巢，PBS清洗，体视显微镜下去除其周围脂肪和被膜；(c)在混合基础培养基中用注射器针头刺破卵泡使颗粒细胞和卵母细胞释放出来，加入混合酶消化，筛网过滤，滤液离心弃上清；(d)混合完全培养基重悬细胞沉淀接种。本发明提供了一种简单、高效、稳定分离及培养卵巢颗粒细胞的方法。

Description

一种小鼠卵巢颗粒细胞分离及培养方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种小鼠卵巢颗粒细胞分离及培养方法。
背景技术
卵巢颗粒细胞是动物生殖过程中一类非常重要的细胞，作为卵泡内最大的细胞群，不仅与卵泡膜细胞协同调控女性甾体激素的合成，而且与卵母细胞的生长、成熟紧密相关。因此，颗粒细胞可作为研究女性及雌性动物生殖细胞生物学行为及其功能调控，以及评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能的良好细胞模型。目前有关体外分离大鼠卵巢颗粒细胞的方法不尽相同，但对小鼠卵巢颗粒细胞的体外培养研究较少，本发明旨在提供一种简单、高效、稳定的小鼠卵巢颗粒细胞的分离培养方法。
发明内容
本发明的目的是建立一种简单、稳定、高效的小鼠卵巢颗粒细胞分离培养的方法。
为了解决上述所涉及到的问题，本发明采取如下方法获得小鼠卵巢颗粒细胞：
小鼠卵巢颗粒细胞分离方法的步骤包括：(a)雌性小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)；(b)颈椎脱臼法处死小鼠，分离小鼠卵巢，PBS清洗，体视显微镜下去除其周围脂肪和被膜；(c)在混合基础培养基中用注射器针头刺破卵泡使颗粒细胞和卵母细胞释放出来，加入混合酶消化，筛网过滤，滤液离心弃上清；(d)混合完全培养基重悬细胞沉淀接种。
可选的小鼠为体重10-15g，未成熟的雌性小鼠。
可选的PMSG的注射量为5-10IU，HCG注射量为5-10IU，注射方法为预先注射PMSG，40-48h后注射HCG。
可选的断颈处死小鼠是在注射HCG 15-20h后。
可选的混合培养基的基础培养基为DMEM/F12、RPMI1640和高糖DMEM(1.5∶1.5∶1～2∶2∶1)。
可选的混合酶为0.025％-0.05％I型胶原酶和0.05-0.15％的透明质酸酶，消化时间为3-5min。
可选的混合培养基的完全培养基含有30-40ng/mL的FSH、10-15ng/mL的EGF、5-10ng/mL的胰岛素和0.25-0.5μg/mL两性霉素B。
可选的细胞首次换液时间为24h，以后每40-48h更换一次培养基。
本发明提供一种机械法结合酶解法获得小鼠卵巢颗粒细胞的方法，不仅操作简便，耗时短，而且获得的卵巢颗粒细胞得率高。
本发明还提供一种混合培养基培养卵巢颗粒的方法，不添加血清，保持获得的卵巢颗粒细胞与机体内环境一致，而且添加的因子量相对其他分离方法少，不仅降低了成本，还增加了卵巢颗粒细胞的生存期。
附图说明
图1培养3d的卵巢颗粒细胞图片(100×)
图2培养3d的卵巢颗粒细胞图片(200×)
具体实施方式
为了使本发明的目的及优势更清新地展现，现将具体实施方式进一步阐述。此处所阐述的具体实施方式仅针对本发明进行解释，并不用于限定本发明。
本发明选择10-15g未成熟的雌性小鼠，分离卵巢颗粒细胞。具体操作如下：
1、取未成熟的雌性小鼠，先皮下注射PMSG 5-10IU，40-48h后注射HCG 5-10IU；
2、15-20h后断颈处死小鼠，固定小鼠，75％的酒精消毒后，无菌迅速取下卵巢，置于预热PBS中，于体式显微镜下迅速地去除卵巢周围的包膜及组织等附着物，将剥离后的卵巢转至新的PBS缓冲液中清洗2次；
3、将卵巢转移至混合基础培养基中，37℃温育10-15min；
4、解剖镜下用1mL注射器针头刺破卵泡，释放颗粒细胞和卵母细胞，收集至15mL离心管中；
5、加入I型胶原酶和透明质酸酶混合酶消化3-5min，200目筛网过滤，收集滤液，1000rpm离心5min；
6、用混合培养基重悬细胞沉淀，接种于细胞瓶中，37℃培养24h后更换混合培养基；
7、37℃每培养40-48h更换一次混合培养基。
以上已经对本发明创造的较佳实施例进行详细阐述，但本发明创造不限定于上述实施例，凡在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种小鼠卵巢颗粒细胞分离及培养方法，其特征在于，包括步骤：(a)雌性小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)；(b)颈椎脱臼法处死小鼠，分离小鼠卵巢，PBS清洗，体视显微镜下去除其周围脂肪和被膜；(c)在混合基础培养基中用注射器针头刺破卵泡使颗粒细胞和卵母细胞释放出来，加入混合酶消化，筛网过滤，滤液离心弃上清；(d)混合完全培养基重悬细胞沉淀接种。
2.根据权利要求1所述的小鼠卵巢颗粒细胞分离及培养方法，其特征在于，所述的小鼠为10-15g，未成熟的雌性小鼠。
3.根据权利要求1所述的小鼠卵巢颗粒细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤a中皮下注射PMSG的量为5-10IU，HCG注射量为5-10IU，注射方法为预先注射PMSG，40-48h后注射HCG。
4.根据权利要求1所述的小鼠卵巢颗粒细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤b中断颈处死小鼠是在注射HCG 15-20h后。
5.根据权利要求1所述的小鼠卵巢颗粒细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤c中混合培养基的基础培养基为DMEM/F12、RPMI1640和高糖DMEM(1.5∶1.5∶1～2∶2∶1)。
6.根据权利要求1所述的小鼠卵巢颗粒细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤c混合酶为0.025％-0.05％I型胶原酶和0.05-0.15％的透明质酸酶，消化时间为3-5min。
7.根据权利要求1所述的小鼠卵巢颗粒细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤d中混合培养基的完全培养基含有30-40ng/mL的FSH、10-15ng/mL的EGF、5-10ng/mL的胰岛素和0.25-0.5μg/mL两性霉素B。
8.根据权利要求1所述的小鼠卵巢颗粒细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤d中细胞首次换液时间为24h，以后每40-48h更换一次培养基。
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