CN101570741A - 胰岛素样分泌细胞的制备法及所用的组合培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备胰岛素样分泌细胞用的组合培养基,由分别独立的培养基I、培养基II和培养基III组成;培养基I为:DMEM高糖培养基,胎牛血清,碱性成纤维细胞生长因子,二甲基亚砜和葡萄糖;培养基II为:无血清DMEM/F12培养基,葡萄糖,尼克酰胺,表皮生长因子,碱性成纤维细胞生长因子,exendin-4,B27添加剂和N2添加剂;培养基III为:RPMI 1640培养基,葡萄糖,尼克酰胺,4-羟乙基哌嗪乙磺酸,肝细胞生长因子,激活素A和exendin-4。本发明还同时公开了利用上述组合培养基进行的胰岛素样分泌细胞制备法。本发明能促进hBM-MSC分化为具有纠正糖尿病高血糖状态的胰岛素样分泌细胞。
Description
技术领域
本发明属于生物和医药技术领域,特别是一种利用成人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)来制备胰岛素样分泌细胞的方法及所用的组合培养基。
背景技术
随着生活水平的提高,糖尿病已成为威胁全人类健康、生命的重大社会问题,给社会造成巨大的经济负担。而胰岛移植被认为是目前治疗胰岛素依赖型糖尿病的最有效手段,然而,由于供体胰腺的严重缺乏,限制了胰岛移植的广泛临床开展。异体移植由于具有严重的免疫排斥问题,无法真正用于临床实施。近年来,干细胞技术的发展及干细胞胰岛分化技术的调控,成为解决胰岛移植供体紧缺难题的新希望。
小鼠及人的胚胎干细胞已有报道可以被诱导分化为能分泌胰岛素的细胞,但胚胎干细胞存在伦理学限制,同时资源有限,且移植后仍存在异体移植免疫排斥。hBM-MSCs具有多向分化潜能,可向内、中、外三胚层细胞分化,且来源取材方便,资源丰富,并可以实现自体移植,是糖尿病β细胞替代治疗的理想种子细胞。通过体外、体内移植功能等多方面监测、评价其诱导效率,建立有效的体外诱导调控的方法,促进hBM-MSC分化为具有纠正糖尿病高血糖状态的胰岛素样分泌细胞,是促进胰岛移植发展迫切需要解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种胰岛素样分泌细胞的制备法及所用的组合培养基,采用本发明的方法能将hBM-MSCs分化成胰岛素样分泌细胞。
为了解决上述技术问题,本发明提供一种制备胰岛素样分泌细胞用的组合培养基,由分别独立的培养基I、培养基II和培养基III组成;
培养基I为:DMEM高糖培养基,1-2%FBS(胎牛血清),9-11ng/ml bFGF(碱性成纤维细胞生长因子),1%DMSO(二甲基亚砜),17-25mmol/l葡萄糖;
培养基II为:无血清DMEM/F12培养基,15-19mmol/l葡萄糖,9-11mmol/l尼克酰胺,18-22ng/ml EGF(表皮生长因子),18-22ng/ml bFGF(碱性成纤维细胞生长因子),10nmol/l exendin-4,1%B27添加剂和1%N2添加剂;
培养基III为:RPMI 1640培养基,10-12mmol/l葡萄糖,9-11mmol/l尼克酰胺,9-11mmol/l Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸),90-110pmol/l HGF(肝细胞生长因子),1.5-2.5nmol/l activin-A(激活素A),9-11nmol/l exendin-4。
本发明还同时提供了利用上述组合培养基进行的胰岛素样分泌细胞制备法,采用3-5代hBM-MSCs,包括以下步骤:
1)、以培养基I重悬3-5代hBM-MSCs,然后以2-3×104个细胞/cm2密度接种于6孔板,于37℃、5%CO2的环境,接种时间为65~80小时;
2)、将上述接种后所得的细胞用PBS(磷酸缓冲液)洗涤,将洗涤后的细胞放入培养基II中于37℃、5%CO2环境下孵育140~160小时;
3)、去除步骤2)所得物中的培养基II,然后加入培养基III,于37℃、5%CO2环境孵育110~130小时,得胰岛素样分泌细胞。
可以采用DTZ染色来鉴定分化后细胞胰岛样分泌细胞形成的效率,采用该方法检测后的细胞仍能用于后续的移植。
在本发明中,
培养基I的制备方法如下:在100ml的DMEM高糖培养基中加入1-2ml的FBS、900-1100ng的bFGF、1ml的DMSO和1.7-2.5mmol葡萄糖混合而成。
培养基II的制备方法如下:在100ml的无血清DMEM/F12培养基中加入1.5-1.9mmol的葡萄糖、0.9-1.1mmol的尼克酰胺、1800-2200ng的EGF、1800-2200ng的bFGF、1nmol的exendin-4、1ml的B27添加剂和1ml的N2添加剂。
培养基III的制备方法如下:在100ml的RPMI 1640培养基中加入1.0-1.2mmol的葡萄糖、0.9-1.1mmol的尼克酰胺、0.9-1.1mmol的Hepes、9-11pmol的HGF、0.15-0.25nmol的activin-A和0.9-1.1nmol的exendin-4。
培养基I、培养基II、培养基III配制完成后分别在4℃进行独立保存,有效保存期为30天。当然,也可以将每种配方成分按其特性进行分别保存,在实际使用前,再按照本发明提供的配方进行配制,从而分别获得培养基I、培养基II、培养基III。
本发明通过纯体外微环境调控三步法非基因转染方法,诱导hBM-MSCs形成胰岛样结构,并且多个胰岛相关基因表达激活或增强;DTZ染色及免疫荧光均证实诱导后细胞表达胰岛素及其他内分泌激素,且电镜显示具有胰岛内分泌细胞超微结构。体外高糖刺激试验显示诱导后细胞释放胰岛素,且随着葡萄糖浓度升高而增加,23mM刺激下胰岛素释放量达正常胰岛的1/50,高于已有鼠BM-MSCs诱导后胰岛素释放量60%。因此,将诱导后细胞移植可以降低糖尿病鼠血糖,改善其糖尿病症状,增加体重,延长生存时间。
在本发明中,微环境调控三步法诱导方案采用如下具体技术内容:
所有诱导实验均采用3-5代hBM-MSCs;
1,细胞汇合达80%-90%时,0.25%胰蛋白酶-EDTA消化,全培养基中止消化,300g,离心5min。
2,第一阶段:Stage 1培养基(培养基I)重悬细胞,以2-3×104个细胞/cm2密度接种于6孔板。
3,第二阶段:3天后,PBS轻柔洗涤3次,加入Stage 2培养基(培养基II),孵育7天。
4,第三阶段:弃尽培养基,换Stage 3培养基(培养基III),孵育5天。
5,每天倒置显微镜观察形态学变化并拍照,每阶段诱导末提RNA或蛋白用于RT-PCR及Western Blot检测。
微环境调控三步法诱导体外诱导效率鉴定采用如下方法:
倒置显微镜每日观察诱导后细胞形态的变化;并在每个诱导阶段末,提取诱导及RNA和蛋白检测其胰岛相关基因表达改变,以未诱导细胞为对照;三阶段诱导结束后,双硫腙(Dithizone:DTZ)染色鉴定胰岛素分泌细胞形成情况;免疫荧光检测胰岛素、c肽及胰高血糖素在诱导后细胞中的表达情况;电镜观察细胞超微结构变化。体外高糖刺激实验测定诱导前、诱导中期及诱导末细胞胰岛素分泌能力及其对葡萄糖的应激反应情况。最终通过腹腔注射大剂量链脲佐菌素(STZ)诱导免疫缺陷裸鼠建立1型糖尿病模型,分别移植诱导后及未诱导hBM-MSCs于模型鼠肾包膜下,连续监测直至移植后30天,观察统计不同组移植前后血糖、体重变化及存活时间。于移植后2天及30天取移植物HE染色检测不同时间的状态;30天后取移植物胰岛素染色检测。结果显示:未诱导细胞传代后仍呈成纤维样;第一阶段诱导结束后所得的细胞呈圆形或不规则形,且易汇聚成团;第二阶段诱导结束后所得的细胞逐渐增殖,少量细胞重现梭样形态,汇聚细胞团逐渐增大增多;第三阶段诱导结束后所得的细胞团体积也较前明显增大,并出现较明显的边界,与胰岛结构相似。DTZ染色显示,诱导形成的细胞团可染成猩红色。RT-PCR及Western Blot检测显示胰岛相关基因ISL-1、Glut2、PDX-1、Nestin及胰岛素、胰高血糖素在在诱导过程中表达逐渐增强或激活。免疫荧光显示第三阶段诱导后细胞表达胰岛素、c肽及胰高血糖素。电镜检测显示诱导后细胞浆内存在含有圆形或长杆形包装颗粒的空泡状结构,并具有丰富的内质网及线粒体;体外高糖刺激实验显示诱导后的细胞具有胰岛素分泌能力,且分泌量随着葡萄糖浓度升高而增加;23mM高糖刺激下,胰岛素分泌量达到正常胰岛的1/50。STZ诱导后裸鼠血糖明显升高,体重减轻,出现典型糖尿病状态,成模率达到80%;细胞移植后可见移植诱导后人BM-MSCs组模型鼠与未诱导人BM-MSCs组相比,血糖明显下降,体重上升,且生存时间明显延长,但未达到正常小鼠水平。HE染色可见移植物在肾包膜下呈小丘样细胞团块;移植后2天移植物HE染色可见细胞边界较模糊,有炎症细胞浸润,没有明显血供形成;移植后30天移植物,有明显血供,且细胞边界清晰。胰岛素染色见有少量细胞呈阳性。
综上所述,本发明具体为通过密度梯度离心及贴壁筛选法结合分离纯化人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells:hBM-MSCs),并体外通过三步法微环境调控的方法,诱导hBM-MSCs向胰岛素分泌细胞分化。本发明通过体外微环境调控,建立三步法诱导方法,可以成功诱导hBM-MSCs分化成为体外具有胰岛素分泌能力、体内移植入小鼠糖尿病模型后可以降血糖的类似胰岛素分泌细胞。本发明通过体外非基因转染手段、安全、有效的诱导成人骨髓间充质干细胞向胰岛样细胞分化,有利于实现自体胰岛素功能细胞移植,是解决人胰岛移植供体紧缺及免疫排斥难题的安全、有效手段。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为微环境调控三步法诱导hBM-MSCs细胞形态学变化及DTZ染色图;
A:诱导前hBM-MSCs;B:第一阶段诱导末hBM-MSCs;C:第二阶段诱导末hBM-MSCs;D:第三阶段诱导末hBM-MSCs;E:第三阶段诱导末hBM-MSCs DTZ染色;F:未诱导hBM-MSCs DTZ染色;
图2为微环境调控三步法诱导hBM-MSCs相关基因表达变化图(RT-PCR及WesternBlot);
A:诱导前后RT-PCR检测,B:诱导前后Western Blot检测;
hMSCs:诱导前hBM-MSCs,
S1:第一阶段诱导末hBM-MSCs,
S2:第二阶段诱导末hBM-MSCs,
S3:第三阶段诱导末hBM-MSCs,
PA:成人胰腺组织为阳性对照;
图3为微环境调控三步法诱导hBM-MSCs内分泌激素表达(免疫荧光)图;
A:胰高血糖素染色、核染色、复合图,B:胰岛素染色、C肽及核染色、复合图,C:胰岛素染色、生长抑素及核染色、复合图,D:阴性对照,E:阴性对照,F:空白对照;
图4微环境调控第三阶段诱导后hBM-MSCs超微结构变化(电镜)图;
A、B诱导后hBM-MSCs,低倍;C、D、E、F诱导后hBM-MSCs,高倍;G诱导前hBM-MSCs;
图5微环境调控三步法诱导hBM-MSCs体外胰岛素分泌实验图;
图6微环境调控三步法诱导hBM-MSCs体内移植糖尿病鼠血糖变化图。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明。
实施例1、一种制备胰岛素样分泌细胞用的组合培养基,由分别独立的培养基I、培养基II和培养基III组成;
培养基I为:DMEM高糖培养基,1%FBS,10ng/ml bFGF,1%DMSO,23mmol/l葡萄糖;
培养基II为:无血清DMEM/F12培养基,17.5mmol/l葡萄糖,10mmol/l尼克酰胺,20ng/ml EGF,20ng/ml bFGF,10nmol/l exendin-4,1%B27添加剂和1%N2添加剂;
培养基III为:RPMI 1640培养基,11.1mmol/l葡萄糖,10mmol/l尼克酰胺,10mmol/lHepes,100pmol/l HGF,2nmol/l activin-A,10nmol/l exendin-4。
培养基I、培养基II和培养基III的制作方法均分别为常规的混合;培养基I、培养基II和培养基III可在4℃进行独立保存,有效保存期均为30天。
实施例2、一种制备胰岛素样分泌细胞用的组合培养基,由分别独立的培养基I、培养基II和培养基III组成;
培养基I为:DMEM高糖培养基,1.5%FBS,11ng/ml bFGF,1%DMSO,25mmol/l葡萄糖;
培养基II为:无血清DMEM/F12培养基,19mmol/l葡萄糖,11mmol/l尼克酰胺,22ng/mlEGF,22ng/ml bFGF,10nmol/l exendin-4,1%B27添加剂和1%N2添加剂;
培养基III为:RPMI 1640培养基,12mmol/l葡萄糖,11mmol/l尼克酰胺,11mmol/lHepes,110pmol/l HGF,2.5nmol/l activin-A,11nmol/l exendin-4。
制作方法同上。
实施例3、一种制备胰岛素样分泌细胞用的组合培养基,由分别独立的培养基I、培养基II和培养基III组成;
培养基I为:DMEM高糖培养基,2%FBS,9ng/ml bFGF,1%DMSO,17mmol/l葡萄糖;
培养基II为:无血清DMEM/F12培养基,15mmol/l葡萄糖,9mmol/l尼克酰胺,18ng/mlEGF,18ng/ml bFGF,10nmol/l exendin-4,1%B27添加剂和1%N2添加剂;
培养基III为:RPMI 1640培养基,10mmol/l葡萄糖,9mmol/l尼克酰胺,9mmol/l Hepes,90pmol/l HGF,1.5nmol/l activin-A,9nmol/l exendin-4。
制作方法同上。
实施例4、原代成人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)分离纯化及培养
首先经过非白血病人志愿者知情同意及伦理委员审批后,通过髂前上脊穿刺,获取志愿者2-3ml骨髓,置于肝素化试管中。加入两倍体积的PBS中,混匀后离心,500g,离心10min。弃上清液,加入7ml DMEM低糖培养基,重悬细胞,取7ml密度为1.073g/ml的Percoll工作液置于15ml离心管底部,吸管吸取骨髓悬液沿管壁轻轻加入,两者比例1∶1,900g,离心30min。吸取上两层界面处白色的单个核细胞,加入DMEM低糖混匀,500g,离心10min,同样方法洗涤2次。丢弃上清,加入全培养基,接种于25cm2塑料培养瓶中。36-48小时后换液,以后每3-4天换液。细胞汇合达到80%-90%后,用0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化,按1∶3的比例进行传代,直到得到足够数量的细胞。全培养基中止消化,300g,离心5min;得3-5代hBM-MSCs。
实施例5、利用实施例1的组合培养基进行的胰岛素样分泌细胞制备法,以实施例4所得的3-5代hBM-MSCs作为实施对象;依次进行以下步骤:
1)、以培养基I重悬所述3-5代hBM-MSCs,然后以2.5×104个细胞/cm2密度接种于6孔板,于37℃、5%CO2的环境,接种时间为72小时;
2)、将上述接种后所得的细胞用磷酸缓冲液轻柔洗涤3次,将洗涤后的细胞放入培养基II中于37℃、5%CO2环境下孵育148小时;
3)、去除步骤2)所得物中的培养基II,然后加入培养基III,于37℃、5%CO2环境孵育120小时,得胰岛素样分泌细胞。
可以采用DTZ染色来鉴定分化后细胞胰岛样分泌细胞形成的效率,采用该方法检测后的细胞仍能用于后续的移植。
实验1、对实施例4所得的hBM-MSCs干细胞一般特性鉴定:
通过倒置显微镜观察细胞的一般形态结构;建立生长曲线了解其生长特性;RT-PCR检测干细胞标志物Oct-4在1-4代hBM-MSCs的表达;流式细胞学检测获得细胞的表面分子标志的表达情况;采用含有胰岛素、地塞米松、Ham F12添加剂等的培养基孵育21天诱导成人其向脂肪细胞分化,油红染色鉴定其分化效率;采用含地塞米松、β甘油磷酸和抗坏学酸等的培养基孵育3周,诱导其向成骨细胞分化,von Kossa染色鉴定其分化效率。采用PANC-1细胞为阳性对照,软琼脂克隆及裸鼠成瘤实验鉴定hBM-MSCs的成瘤性。原代及传代细胞形态学观察均成典型的成纤维样形态特征,旋涡状生长;传代培养细胞在5-8天时增殖速度最快,8-9天时达到平台期,单代细胞可扩增20-25倍。10个不同供体来源的1-4代hBM-MSCs均表达干细胞标志Oct-4,且流式检测显示CD45、CD34、CD14、HLA-DR阴性,CD44、CD29、CD105、CD90、CD73表达阳性。经过成脂肪诱导后,细胞变圆,呈现脂肪油滴,油红染色成红色;成骨诱导后,细胞变圆,并出现钙化沉积,vonKossa染色阳性可见黑色的沉积。体外软琼脂克隆BM-MSCs组未见明显克隆细胞团形成,体内裸鼠成瘤实验BM-MSCs也未形成移植瘤。
以上结果说明:未见hBM-MSCs具有成肿瘤的特性。
实验2、对实施例4所得的hBM-MSCs的胰岛干细胞相关特性鉴定:
通过RT-PCR、Western Blot及免疫荧光,在mRNA及蛋白表达水平检测体外培养的未诱导的hBM-MSCs胰腺发育相关基因表达情况。RT-PCR显示ISL-1,Beta2/NeuroD,Nkx6.1,Glut2,CK18及CK19均阳性,但PDX-1及Nestin阴性;而Western Blot检测CK18和CK19均阳性,但ISL-1及Glut2阴性;免疫组化显示大部分细胞CK18和CK19阳性,而只有小部分细胞ISL-1及Glut2阳性。
体外培养的hBM-MSCs中部分细胞表达多个胰腺发育相关基因,提示其具有胰岛样细胞分化潜能;且扩增的BM-MSCs存在异质性,可能包含有部分细胞具有胰腺前体细胞的特性。
实验3、体外三步法微环境调控诱导hBM-MSCs向胰岛素分泌细胞分化
通过建立的体外三步法微环境调控诱导hBM-MSCs向胰岛素分泌细胞分化(如实施例5所示),倒置显微镜每日观察诱导后细胞形态的变化(如图1A-D所示);并在每个诱导阶段末,提取诱导及RNA和蛋白检测其胰岛相关基因表达改变,以未诱导细胞为对照(如图2所示);三阶段诱导结束后,双硫腙(Dithizone:DTZ)染色鉴定胰岛素分泌细胞形成情况(如图1E、F所示);免疫荧光检测胰岛素、c肽及胰高血糖素在诱导后细胞中的表达情况(如图3所示);电镜观察细胞超微结构变化(如图4所示)。其中DTZ染色可以用来鉴定分化后细胞胰岛样细胞形成的效率,采用该方法检测后的细胞仍能用于后续的移植。
结果显示:未诱导细胞传代后仍呈成纤维样,第一阶段结束后细胞呈圆形或不规则形,且易汇聚成团,第二阶段诱导后,细胞逐渐增殖,少量细胞重现梭样形态,汇聚细胞团逐渐增大增多,三阶段诱导结束细胞团体积也较前明显增大,并出现较明显的边界,与胰岛结构相似。DTZ染色显示,诱导形成的细胞团可染成猩红色。RT-PCR及Western Blot检测显示胰岛相关基因ISL-1、Glut2、PDX-1、Nestin及胰岛素、胰高血糖素在在诱导过程中表达逐渐增强或激活。免疫荧光显示诱导后部分细胞表达胰岛素、c肽及胰高血糖素。电镜检测显示诱导后细胞浆内存在含有圆形或长杆形包装颗粒的空泡状结构,并具有丰富的内质网及线粒体。
实验4、诱导后hBM-MSCs(即实施例5所得胰岛素样分泌细胞)的体外、体内移植功能鉴定:
体外高糖刺激实验测定诱导前、第二阶段诱导末及第三阶段诱导末细胞胰岛素分泌能力及其对葡萄糖的应激反应情况。最终通过腹腔注射大剂量链脲佐菌素(STZ)诱导免疫缺陷裸鼠建立1型糖尿病模型,分别移植诱导后及未诱导hBM-MSCs于模型鼠肾包膜下,连续监测直至移植后30天,观察统计不同组移植前后血糖、体重变化及存活时间。于移植后2天及30天取移植物HE染色检测不同时间的状态;30天后取移植物胰岛素染色检测。体外高糖刺激实验显示诱导后的细胞具有胰岛素分泌能力,且分泌量随着葡萄糖浓度升高而增加;23mM高糖刺激下,胰岛素分泌量达到正常胰岛的1/50。STZ诱导后裸鼠血糖明显升高,体重减轻,出现典型糖尿病状态,成模率达到80%;细胞移植后可见移植诱导后人BM-MSCs组模型鼠与未诱导人BM-MSCs组相比,血糖明显下降,体重上升,且生存时间明显延长,但未达到正常小鼠水平。HE染色可见移植物在肾包膜下呈小丘样细胞团块;移植后2天移植物HE染色可见细胞边界较模糊,有炎症细胞浸润,没有明显血供形成;移植后30天移植物,有明显血供,且细胞边界清晰。胰岛素染色见有少量细胞呈阳性。
对利用实施例2所述的组合培养基、按照本发明的制备方法所得的胰岛素样分泌细胞分别进行上述实验3和实验4,实验结果基本相同。同样,对利用实施例3所述的组合培养基、按照本发明的制备方法所得的胰岛素样分泌细胞分别进行上述实验3和实验4,实验结果也基本相同。
为了验证本发明的再现性,发明人以不同志愿者提供的骨髓以及同一志愿者不同时间段提供的骨髓为100份试样分别重复进行上述实施例5的内容,经检测后的结果显示:40%的试样能最终获得胰岛素样分泌细胞。
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1、一种组合培养基,其特征是:由分别独立的培养基I、培养基II和培养基III组成;
培养基I为:DMEM高糖培养基,1-2%胎牛血清,9-11ng/ml碱性成纤维细胞生长因子,1%二甲基亚砜和17-25mmol/l葡萄糖;
培养基II为:无血清DMEM/F12培养基,15-19mmol/l葡萄糖,9-11mmol/l尼克酰胺,18-22ng/ml表皮生长因子,18-22ng/ml碱性成纤维细胞生长因子,10nmol/lexendin-4,1%B27添加剂和1%N2添加剂;
培养基III为:RPMI 1640培养基,10-12mmol/l葡萄糖,9-11mmol/l尼克酰胺,9-11mmol/l4-羟乙基哌嗪乙磺酸,90-110pmol/l肝细胞生长因子,1.5-2.5nmol/l激活素A和9-11nmol/lexendin-4。
2、如权利要求1所述的组合培养基的用途:将hBM-MSCs转化成胰岛素样分泌细胞。
3、利用权利要求1所述的组合培养基进行的胰岛素样分泌细胞制备法,其特征是:采用3-5代hBM-MSCs,包括以下步骤:
1)、以培养基I重悬所述3-5代hBM-MSCs,然后以2-3×104个细胞/cm2密度接种于6孔板,于37℃、5%CO2的环境,接种时间为65~80小时;
2)、将上述接种后所得的细胞用磷酸缓冲液洗涤,将洗涤后的细胞放入培养基II中于37℃、5%CO2环境下孵育140~160小时;
3)、去除步骤2)所得物中的培养基II,然后加入培养基III,于37℃、5%CO2环境孵育110~130小时,得胰岛素样分泌细胞。
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