CN101984051A - 适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液 - Google Patents

Abstract

本发明提供了适合于人体肿瘤干细胞富集和培养的无血清细胞培养液。所述的培养液是以DMEM/F12为基础培养液，并添加了转铁蛋白，胰岛素和其他物质。本发明的无血清富集培养液可从恶性肿瘤细胞株和肿瘤组织中高效地富集肿瘤干细胞。本发明的无血清培养液能使肿瘤干细胞稳定生长，并维持其良好的细胞活性和生理特性，非常适合应用于肿瘤细胞及肿瘤干细胞的相关研究领域。

Description

适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清细胞培养液

技术领域

本发明涉及细胞生物学研究领域。更具体的，本发明涉及用于人肿瘤细胞及肿瘤干细胞的富集与培养技术领域。

背景技术

肿瘤是一种异质性的组织，肿瘤细胞受复杂的微环境影响，在增殖过程中不断获得基因突变，导致肿瘤组织中有多种表型和分化程度不同的肿瘤细胞。近年来，通过对肿瘤研究的进一步深入，越来越多的研究者支持肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells，CSC)假说。CSC是存在于肿瘤组织中具有自我更新，自我复制能力的细胞，CSC对化疗药物和放射线治疗具有很强的耐受性，并且可以分化出不同表型的肿瘤细胞，重建肿瘤组织的异质性。对CSC的深入研究，有助于了解肿瘤发生、发展和转移的分子机理，对肿瘤的早期检测、治疗和诊断都有重要的临床意义，因此如何从肿瘤中富集到CSC便成为关注的焦点。

目前富集CSC的方法主要有以下两种：

(1)利用一个或几个细胞表面分子标记物，通过流式细胞分选得到目的细胞。CD133是利用最多的分子，利用CD133从前列腺癌、肺癌、胰腺癌、神经胶质瘤、大肠癌等组织中分离出的阳性细胞有很强的自我更新能力，只需100-500个细胞即可致瘤，而CD133^-细胞的成瘤性较差或无成瘤能力。其次是CD44，应用于乳腺癌、大肠癌、头颈部鳞癌等干细胞的分离。也有利用几种分子的组合，如CD34⁺/CD38用于AML干细胞的分离，CD44⁺/CD24^-/low/Lin用于乳腺癌，CD44⁺/CD24⁺/ESA⁺用于胰腺癌等。另外还有利用其它分子进行分选，如CD20，CD90，CD26，c-kit，ALDH1，ABCB5等。

(2)侧群(side population，SP)分选是分离肿瘤干细胞的另一种常用手法。由于干细胞大多高表达ABCG2(ATP-binding cassette superfamily G member 2)，可以将药物有效地泵出胞外，因此在利用Hoechst荧光染料进行流式细胞分选时，就会形成Hoechst低染区，即SP细胞群。SP细胞既具有类似干细胞的自我更新和多向分化潜能，还具有独特的表型标记和生物学特征，已有越来越多的研究者采用此方法分离肿瘤干细胞。通常情况下，SP分析与CSC表面标志联合应用会大大提高分选的效率。

但是，现有的筛选方法不能得到高度纯化的CSC，在一些文献中，分选后的CSC与非CSC的总和大于未分选时细胞的总量。而且大多数的肿瘤还没有合适的CSC表面分子标志。最近的研究发现，CD133^-的癌细胞群中也有CSC。SP分析筛选方法与实验前细胞的培养条件，细胞状态都有密切关系，添加不同浓度的血清，SP细胞所占总细胞的比例就不同。研究人员将肿瘤细胞注射到免疫缺陷的小鼠体内，不断地对致瘤后的小鼠进行化疗，从而富集到了一株乳腺癌干细胞。这一实验方法忽略了小鼠体内微环境对人肿瘤干细胞的影响。而且实验操作过程中的一些机械的，物理的，化学的，生物的因素可能损害了部分CSC，使其被归为非CSC。另外，所得到的CSC一般是通过悬浮培养进行维持和扩增的。现有的培养方法不仅CSC扩增速度慢，不易传代，而且很容易分化，无法满足研究需求。

公开号为CN101851605A，公开日为2010年10月6日，发明名称为“肝干细胞的选择培养基、选择性分离并扩增肝干细胞的方法及用于治疗糖尿病的药物组合物”的中国发明专利申请公开了一种肝干细胞的选择培养基，该培养基以液体基础培养基为基础，含有胎牛血清、人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子。使用该培养基可以扩增肝干细胞。该发明是针对肝干细胞的分离和扩增所做出的改进。但是血清中含有上千种不明成分，这些不明成分对干细胞的影响是不可忽视的。如果含有血清，干细胞就很容易分化，并且很难人为地控制诱导分化的方向。另外血清批次间的质量变动会影响细胞培养和实验结果的重复性。这些因素限制了该专利的生产应用。

公开号为CN101580816A，公开日为2009年11月18日，发明名称为“诱导多能性干细胞高效产生的新型无血清培养基以及使用其的方法”的中国发明专利申请公开了一种能将体细胞诱导重编程为多能性干细胞的无血清培养基，以及使用该无血清培养基在无需饲养层的条件下诱导重编程体细胞的方法。同一年，Silvia Penuelas等人应用无血清培养体系从神经胶质瘤病人的肿瘤组织中富集到了神经胶质瘤起始细胞。上述两种无血清培养基虽然避免了血清培养的弊端，但它们的添加物都含有Invitrogen(GIBCO)公司研发的神经干细胞培养液B27和(或)N2。B27可以提高iPS和CSC的富集效率，但是其中的一些成份是没有公开的，这样会使实验背景不清，而且实验成本较高，限制了其应用范围。

综上所述，科研工作者虽然开发了数种富集CSC的方法，但每种方法都有其应用的局限性。免疫筛选不仅需要大量的标记抗体与试剂，还需要昂贵复杂的筛选设备。抗药性富集又需要很长的实验周期，费时费力。因此，本领域迫切需要建立一种适用范围广，实验周期短，成本低廉，简便高效的富集CSC的方法。富集到的CSC如果能传代培养，一方面能够保证实验过程中CSC的稳定供应，节省了每次实验前的富集时间。另一方面，能够保证每次实验的可重复性及实验结果的一致性，更有助于肿瘤干细胞领域的相关研究。但目前市面上还没有针对肿瘤干细胞的培养液。因此，本领域迫切需要一种适用于肿瘤干细胞培养、应用性强、完全是化学成分清晰的无血清细胞培养液。

发明内容

本发明的目的之一就是提供一种适用于人肿瘤干细胞培养的无血清培养液。

本发明的目的之二就是提供一种适用于人肿瘤干细胞富集的培养方法。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：一种适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清培养液，是在基础培养基DMEM/F12中添加以下成份：一种或多种必须氨基酸及非必须氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种盐类、一种或多种脂类、一种或多种微量元素、一种或多种激素类化合物、一种或多种缓冲液、一种或多种转金属蛋白、一种或多种抗氧化剂、血清白蛋白及粘多糖类物质。

本发明的培养基是以DMEM/F12基础培养基，在其中添加转铁蛋白、胰岛素、脂类如氨基乙醇、微量元素如亚硒酸钠、β-巯基乙醇代替传统有血清培养液，避免了血清组分对实验研究的影响。大多数恶性程度高的肿瘤细胞株，在快速除掉血清后，在基础培养液中添加上述成分，培养一段时间，即可以富集到肿瘤干细胞。某些恶性细胞株在添加上述成分后，加入2-6ug/L的人TGF-β1可以极大地促进肿瘤干细胞的富集效率。在基础培养液中添加上述成份后，再添加牛血清白蛋白-油酸，人FGF2，肝素钠，L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐后，即可悬浮培养富集到的肿瘤干细胞，并可以传代培养。从而开发出一种适用于人肿瘤干细胞富集的培养液。

所述的氨基酸包括谷丙氨酸二肽，还包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸中的一种或多种。

所述的维生素包括L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐，还包括生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、腐胺、维生素B6、泛酸钙、核黄素、吡多素HCL、维生素B12、盐酸硫胺中的一种或多种。

所述的盐类为氯化钙、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、丙酮酸钠。

所述的微量元素为硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁、氯化镁、硫酸镁、硫酸锌、亚硒酸钠。

所述的脂类为油酸、亚油酸、氨基乙醇、硫辛酸。

所述的缓冲剂为碳酸氢钠、HEPES。

所述激素为胰岛素。

所述的无血清细胞培养液适用于从恶性肿瘤细胞株和新鲜的肿瘤组织中富集肿瘤干细胞，针对某些恶性肿瘤细胞株，添加2-6ug/ml的TGF-β1，可以加快并提高肿瘤干细胞的富集率。

优选地，所述的无血清培养液中各种成分的含量为：

丙氨酸      4～5mg/L            精氨酸                134～155mg/L

天冬酰胺    6.5～8.2mg/L        天冬氨酸              6.5～7.5mg/L

半胱氨酸    16.1～18.3mg/L      胱氨酸                30～35mg/L

谷氨酸      7.0～8.0mg/L        谷氨酰胺              335～450mg/L

甘氨酸      16～19mg/L          组氨酸                31～33mg/L

异亮氨酸    52.3～56.6mg/L      亮氨酸                55.5～60mg/L

赖氨酸      90.8～96.5mg/L      甲硫氨酸              16.5～18.5mg/L

苯丙氨酸    33.25～37.75mg/L    脯氨酸                16.5～18.5mg/L

丝氨酸      24.8～27.6mg/L      苏氨酸                51.25～55.45mg/L

色氨酸      8.5～9.6mg/L        酪氨酸                54.35～57.25mg/L

缬氨酸      50.55～55.75mg/L    生物素                0.003～0.004mg/L

氯化胆碱    7.8～9.5mg/L        叶酸                  2.2～2.76mg/L

肌醇        11.28～13.46mg/L    烟酰胺                1.9～2.1mg/L

泛酸钙      1.9～2.3mg/L        维生素B6              1.9～2.2mg/L

吡多素      0.03～0.033mg/L     核黄素                0.2～0.25mg/L

盐酸硫胺    1.9～2.3mg/L        胸苷                  0.315～0.385mg/L

维生素B12   0.6～0.72mg/L       L-抗坏血酸-2-磷酸     9.5～12.5mg/L

                                三钠盐

硫酸铜      0.001～0.0015mg/L   硝酸铁                0.045～0.065mg/L

硫酸亚铁    0.38～0.42mg/L      氯化镁                58.2～62.8mg/L

硫酸镁      48～51mg/L          硫酸锌                0.4～0.5mg/L

氯化钙      110～120mg/L        氯化钾                280～320mg/L

碳酸氢钠    1900～2300mg/L      氯化钠                6800～7000mg/L

磷酸氢二钠  70～75mg/L          磷酸二氢钠            50.5～55.5mg/L

丙酮酸钠    200～230mg/L        亚硒酸钠              0.0017～0.002mg/L

葡萄糖      3000～3300mg/L      HEPES                 4553.6～4868.2mg/L

次黄嘌呤     1.88～2.2mg/L       亚油酸           0.038～0.044mg/L

油酸         88～126mg/L         酚红钠           8.18～8.98mg/L

腐胺         0.078～0.082mg/L    硫辛酸           0.098～0.146mg/L

胰岛素       1.6～12.8mg/L       人TGF-β1        2～6ug/L

转铁蛋白     3.6～5.8mg/L        β-巯基乙醇      0.52～0.88mg/L

氨基乙醇     0.48～1.1mg/L       牛血清白蛋白     450～600mg/L

肝素钠       0.1～1mg/L          人碱性纤维细胞生 5～20ug/L

                                 长因子

谷丙氨酸二肽 400-460mg/L

本发明所述的无血清细胞培养液采用常规配制方法，将上述组分溶解于无热源超纯水中(电阻率为18.2Ω)即可配置而成。本发明所述的基础培养液是指含有细胞生长繁殖所需的基本营养物质的培养基，可供大多数细胞生长。将酸碱度调至7.0～7.2，经过滤灭菌处理后，即为基础液体培养基。

本发明所述的无血清细胞培养液的使用方法是：肿瘤细胞株在本发明的无血清培养液中培养即可富集到肿瘤干细胞。对于肿瘤组织的原代培养，只需将组织块剪碎或消化成单细胞接种到本发明所述的无血清培养液中，然后再适合的培养条件(37℃，5％CO₂)培养48-72h后，即可在培养液中见到悬浮的呈球状的肿瘤干细胞。

本发明的无血清培养液的积极效果是：

(1)不含血清，实验体系清晰、成份确定，有利于实验结果的分析，避免了不可知成份所造成的实验背景不清对实验结果所带来的影响。

(2)适用范围广，适用于多种类型的肿瘤干细胞的培养。

(3)适用于富集肿瘤干细胞，不仅适用于从肿瘤细胞株中富集肿瘤干细胞，也适用于从新鲜的肿瘤组织中富集肿瘤干细胞。富集到的肿瘤干细胞具有很好的生物学活性和干细胞特性，并且可以传代培养。

(4)富集肿瘤干细胞的方法操作简便、实验周期短、适用范围广，不对细胞进行复杂的处理，不会对细胞造成物理的、化学的、生理的损伤，最大程度的维持肿瘤干细胞的细胞活性的生理学特性。适用于从恶性肿瘤细胞株和新鲜的肿瘤组织中富集肿瘤干细胞。

本发明的无血清培养液首次将谷丙氨酸二肽应用于肿瘤干细胞的富集与培养。谷丙氨酸二肽在培养条件下比L-谷氨酰胺稳定，不仅可以持续为干细胞提供能量，而且可以避免因自然代谢而造成的有毒代谢物的积累。

维生素C参与细胞多种生物化学反应，是一种非常重要的氧化剂。2009年，Miguel Angel Esteban等人研究发现，VC可以显著提高iPS的诱导效率。但VC非常不稳定，极易被氧化分解。本发明的无血清培养液中添加的L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐是一种比维生素C更稳定的抗氧化剂，它在培养液中可以长时间保持活性，大大延缓肿瘤干细胞衰老的速度，且有助于为细胞提供一个稳定的还原性的微环境。本发明的无血清培养液还添加了肝素钠，以促进细胞内FGF2的信号转导。

本发明的无血清培养是一种化学成分完全明确的合成培养液。与公开号为CN101580816A，公开日为2009年11月18日，发明名称为“诱导多能性干细胞高效产生的新型无血清培养基以及使用其的方法”的中国发明专利申请相比，本发明的无血清培养液成分明确，添加物成分简单易配制，成本更低廉，应用范围更广范。

附图说明

图1为显示利用本发明的无血清细胞培养液从骨肉瘤细胞株MNNG中富集干细胞的过程的镜下细胞图，各图分别为培养第二天、第四天、第六天及第八天。

图2为显示本发明的无血清细胞培养液中添加2-6ug/ml的TGFβ1前后对肿瘤干细胞富集效率影响的镜下细胞图，其中图2a为不含TGF-β1的培养至第5天的图，图2b为添加了TGF-β1的培养至第5天的图。

图3为利用本发明的培养液富集到的肿瘤干细胞表达干细胞标志性基因。

图4为将富集到的骨肉瘤干细胞进行消化，并在本发明的无血清细胞培养液中进行传代培养的镜下细胞图，其中图4a采用的无血清培养液没有添加谷丙氨酸二肽，图4b采用的无血清培养液添加了谷丙氨酸二肽。

具体实施例

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。

一种适用于人肿瘤干细胞富集的细胞培养液包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、激素、缓冲剂及葡萄糖、非必须氨基酸、胸苷、次黄嘌呤、酚红、β-巯基乙醇、转铁蛋白、牛血清白蛋白，其各组分的含量如以下实施例1～3所示：

实施例1

丙氨酸      4mg/L      精氨酸    134mg/L

天冬酰胺    6.8mg/L    天冬氨酸  6.5mg/L

半胱氨酸    16.1mg/L    胱氨酸              30mg/L

谷氨酸      7.0mg/L     谷氨酰胺            335mg/L

甘氨酸      16mg/L      组氨酸              31mg/L

异亮氨酸    52.3mg/L    亮氨酸              55.5mg/L

赖氨酸      90.8mg/L    甲硫氨酸            16.5mg/L

苯丙氨酸    33.25mg/L   脯氨酸              16.5mg/L

丝氨酸      24.8mg/L    苏氨酸              51.25mg/L

色氨酸      8.5mg/L     酪氨酸              54.35mg/L

缬氨酸      50.55mg/L   生物素              0.003mg/L

氯化胆碱    7.8mg/L     叶酸                2.2mg/L

肌醇        11.28mg/L   烟酰胺              1.9mg/L

泛酸钙      1.9mg/L     维生素B6            1.9mg/L

吡多素      0.03mg/L    核黄素              0.2mg/L

盐酸硫胺    1.9mg/L     胸苷                0.315mg/L

维生素B12   0.6mg/L     L-抗坏血酸-2-磷酸   9.5mg/L

                        三钠盐

硫酸铜      0.001mg/L   硝酸铁              0.045mg/L

硫酸亚铁    0.38mg/L    氯化镁              58.2mg/L

硫酸镁      48mg/L      硫酸锌              0.4mg/L

氯化钙      110mg/L     氯化钾              280mg/L

碳酸氢钠    1900mg/L    氯化钠              6800mg/L

磷酸氢二钠  70mg/L      磷酸二氢钠          50.5mg/L

丙酮酸钠    200mg/L     亚硒酸钠            0.0017mg/L

葡萄糖      3000mg/L    HEPES               4553.6mg/L

次黄嘌呤    1.88mg/L    亚油酸              0.038mg/L

油酸        88mg/L      酚红钠              8.18mg/L

腐胺        0.078mg/L   硫辛酸              0.098mg/L

胰岛素      1.6mg/L     β-巯基乙醇         0.52mg/L

转铁蛋白    3.6mg/L     牛血清白蛋白        450mg/L

氨基乙醇    0.48mg/L    人碱性纤维细胞生    5ug/L

                         长因子

肝素钠        0.1mg/L    谷丙氨酸二肽         400mg/L

实施例2

丙氨酸        5mg/L      精氨酸               155mg/L

天冬酰胺      8.2mg/L    天冬氨酸             7.5mg/L

半胱氨酸      18.3mg/L   胱氨酸               35mg/L

谷氨酸        8.0mg/L    谷氨酰胺             450mg/L

甘氨酸        19mg/L     组氨酸               33mg/L

异亮氨酸      56.6mg/L   亮氨酸               60mg/L

赖氨酸        96.5mg/L   甲硫氨酸             18.5mg/L

苯丙氨酸      37.75mg/L  脯氨酸               18.5mg/L

丝氨酸        27.6mg/L   苏氨酸               55.45mg/L

色氨酸        9.6mg/L    酪氨酸               57.25mg/L

缬氨酸        55.75L     生物素               0.04mg/L

氯化胆碱      9.5mg/L    叶酸                 2.76mg/L

肌醇          13.46mg/L  烟酰胺               2.1mg/L

泛酸钙        2.3mg/L    维生素B6             2.2mg/L

吡多素        0.033mg/L  核黄素               0.25mg/L

盐酸硫胺      2.3mg/L    胸苷                 0.385mg/L

维生素B12     0.72mg/L   L-抗坏血酸-2-磷酸    12.5mg/L

                         三钠盐

硫酸铜        0.0015mg/L 硝酸铁               0.065mg/L

硫酸亚铁      0.42mg/L   氯化镁               62.8mg/L

硫酸镁        51mg/L     硫酸锌               0.5mg/L

氯化钙        120mg/L    氯化钾               320mg/L

碳酸氢钠      2300mg/L   氯化钠               7000mg/L

磷酸氢二钠    75mg/L     磷酸二氢钠           55.5mg/L

丙酮酸钠      230mg/L    亚硒酸钠             0.002mg/L

葡萄糖        3300mg/L   HEPES                4868.2mg/L

次黄嘌呤      2.2mg/L    亚油酸               0.044mg/L

油酸          126mg/L       酚红钠               8.98mg/L

腐胺          0.082mg/L     硫辛酸               0.146mg/L

人TGF-β      16ug/L        胰岛素               12.8mg/L

转铁蛋白      5.8mg/L       β-巯基乙醇          0.88mg/L

氨基乙醇      1.1mg/L       牛血清白蛋白         600mg/L

肝素钠        1mg/L         人碱性纤维细胞生     20ug/L

                            长因子

谷丙氨酸二肽  430mg/L

实施例3

丙氨酸        4.5mg/L       精氨酸               145mg/L

天冬酰胺      7.5mg/L       天冬氨酸             7.0mg/L

半胱氨酸      17.1mg/L      胱氨酸               33mg/L

谷氨酸        7.3mg/L       谷氨酰胺             350mg/L

甘氨酸        18mg/L        组氨酸               32mg/L

异亮氨酸      55mg/L        亮氨酸               57.1mg/L

赖氨酸        94.8mg/L      甲硫氨酸             17.5mg/L

苯丙氨酸      35.25mg/L     脯氨酸               17.5mg/L

丝氨酸        25.0mg/L      苏氨酸               52.5mg/L

色氨酸        9.2mg/L       酪氨酸               55.35mg/L

缬氨酸        53.55mg/L     生物素               0.035mg/L

氯化胆碱      8.5mg/L       叶酸                 2.4mg/L

肌醇          12mg/L        烟酰胺               2.0mg/L

泛酸钙        2.0mg/L       维生素B6             2.0mg/L

吡多素        0.032mg/L     核黄素               0.22mg/L

盐酸硫胺      2.1mg/L       胸苷                 0.35mg/L

维生素B12     0.67mg/L      L-抗坏血酸-2-磷酸    10.2mg/L

                            三钠盐

硫酸铜        0.0012mg/L    硝酸铁                0.055mg/L

硫酸亚铁      0.40mg/L      氯化镁                59.2mg/L

硫酸镁        49mg/L        硫酸锌                0.45mg/L

氯化钙        112mg/L     氯化钾           298mg/L

碳酸氢钠      2000mg/L    氯化钠           6900mg/L

磷酸氢二钠    72mg/L      磷酸二氢钠       53.5mg/L

丙酮酸钠      212mg/L     亚硒酸钠         0.0018mg/L

葡萄糖        3200mg/L    HEPES            4768.2mg/L

次黄嘌呤      2.0mg/L     亚油酸           0.04mg/L

油酸          100mg/L     酚红钠           8.48mg/L

腐胺          0.08mg/L    硫辛酸           0.126mg/L

人TGF-β1     2ug/L       胰岛素           10mg/L

转铁蛋白      4.6mg/L     β-巯基乙醇      0.68mg/L

氨基乙醇      0.78mg/L    牛血清白蛋白     545mg/L

肝素钠        0.15mg/L    人碱性纤维细胞生 10ug/L

                          长因子

谷丙氨酸二肽  460mg/L

实施例4

应用本发明实施例1的无血清细胞培养液培养骨肉瘤细胞株MNNG/HOCS#，即可富集到骨肉瘤干细胞。如图1所示，分别为培养第二天、第四天、第六天、第八天的的显微镜下的细胞生长情况。

如果在富集过程中，在本发明的无血清培养液中添加2-6ug/L的人TGF-β1，即可大大缩短富集肿瘤干细胞所需的时间，并且提高富集效率如图2所示，图2b为添加了2-6ug/L的人TGF-β1培养了5天的骨肉瘤细胞，图2a为没有添加人TGF-β1培养了5天的骨肉瘤细胞。图2a中显示，没有添加人TGF-β1时富集到的骨肉瘤干细胞，图2b中显示，添加了人TGF-β1后，培养到第五天时富集到的骨肉瘤干细胞，证明了在本发明的无血清培养液中添加2-6ug/L的人TGF-β1，即可大大缩短富集肿瘤干细胞所需的时间，并且提高富集效率。

实施例5

利用免疫荧光染色的分析方法，检测应用本发明的实施例1的无血清细胞培养液培养骨肉瘤干细胞中干细胞标志性基因的表达，见附图3。从图中可见，本发明的无血清细胞培养液培养骨肉瘤干细胞表达人胚胎干细胞的标志基因：Sox2，SSEA-1，TRA-1-81。

实施例6

将富集到的骨肉瘤干细胞进行消化，在本发明的培养液中进行传代培养。应用本发明的无血清培养液能很好的维持肿瘤干细胞特有的细胞形态和生理特性。应用本发明实施例3的添加了谷丙氨酸二肽的无血清培养液进行传代培养(图4b)与未添加谷丙氨酸二肽的无血清培养液(即谷丙氨酸二肽含量为零，其它成份与实施例3成份相同)进行传代培养(图4a)相比较，骨肉瘤干细胞的形态更规则，边缘更整齐，结构更致密，说明谷丙氨酸二肽的添加对于骨肉瘤干细胞的传代培养具有显著的优势。

Claims (7)

1.一种适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清培养液，其特征在于：是在基础培养基DMEM/F12中添加以下成份：一种或多种必须氨基酸及非必须氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种盐类、一种或多种脂类、一种或多种微量元素、一种或多种激素类化合物、一种或多种缓冲液、一种或多种转金属蛋白、一种或多种抗氧化剂、血清白蛋白及粘多糖类物质。

2.根据权利要求1所述的适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清培养液，其特征在于：所述转金属蛋白为转铁蛋白，所述激素类化合物为胰岛素，所述抗氧化剂为β-巯基乙醇，所述血清白蛋白为牛血清白蛋白，所述粘多糖类物质为肝素钠。

3.根据权利要求1所述的适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清培养液，其特征在于：所述的氨基酸包括谷丙氨酸二肽，还包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸中的一种或多种；

所述的维生素包括L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐，还包括生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、腐胺、维生素B6、泛酸钙、核黄素、吡多素HCL、维生素B12、盐酸硫胺中的一种或多种；

所述的盐类为氯化钙、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、丙酮酸钠；

所述微量元素为硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁、氯化镁、硫酸镁、硫酸锌、亚硒酸钠；

所述脂类化合物为油酸、亚油酸、氨基乙醇、硫辛酸；

所述的缓冲液为碳酸氢钠和/或HEPES。

4.根据权利要求1所述的适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清培养液，其特征在于：所述培养液中还添加有2-6ug/ml的TGF-β1。

5.根据权利要求1所述的适合肿瘤干细胞富集与培养的无血清培养液，其特征在于，其各种成分的含量为：

丙氨酸    4～5mg/L          精氨酸    134～155mg/L

天冬酰胺  6.5～8.2mg/L      天冬氨酸  6.5～7.5mg/L

半胱氨酸  16.1～18.3mg/L    胱氨酸    30～35mg/L 

谷氨酸       7.0～8.0mg/L        谷氨酰胺              335～450mg/L

甘氨酸       16～19mg/L          组氨酸                31～33mg/L

异亮氨酸     52.3～56.6mg/L      亮氨酸                55.5～60mg/L

赖氨酸       90.8～96.5mg/L      甲硫氨酸              16.5～18.5mg/L

苯丙氨酸     33.25～37.75mg/L    脯氨酸                16.5～18.5mg/L

丝氨酸       24.8～27.6mg/L      苏氨酸                51.25～55.45mg/L

色氨酸       8.5～9.6mg/L        酪氨酸                54.35～57.25mg/L

缬氨酸       50.55～55.75mg/L    生物素                0.003～0.004mg/L

氯化胆碱     7.8～9.5mg/L        叶酸                  2.2～2.76mg/L

肌醇         11.28～13.46mg/L    烟酰胺                1.9～2.1mg/L

泛酸钙       1.9～2.3mg/L        维生素B6              1.9～2.2mg/L

吡多素       0.03～0.033mg/L     核黄素                0.2～025mg/L

盐酸硫胺     1.9～2.3mg/L        胸苷                  0.315～0.385mg/L

维生素B12    0.6～0.72mg/L       L-抗坏血酸-2-磷酸     9.5～12.5mg/L

                                 三钠盐

硫酸铜       0.001～0.0015mg/L   硝酸铁                0.045～0.065mg/L

硫酸亚铁     0.38～0.42mg/L      氯化镁                58.2～62.8mg/L

硫酸镁       48～51mg/L          硫酸锌                0.4～0.5mg/L

氯化钙       110～120mg/L        氯化钾                280～320mg/L

碳酸氢钠     1900～2300mg/L      氯化钠                6800～7000mg/L

磷酸氢二钠   70～75mg/L          磷酸二氢钠            50.5～55.5mg/L

丙酮酸钠     200～230mg/L        亚硒酸钠              0.0017～0.002mg/L

葡萄糖       3000～3300mg/L      HEPES                 4553.6～4868.2mg/L

次黄嘌呤     1.88～2.2mg/L       亚油酸                0.038～0.044mg/L

油酸         88～126mg/L         酚红钠                8.18～8.98mg/L

腐胺         0.078～0.082mg/L    硫辛酸                0.098～0.146mg/L

人TGF-β1    2～6ug/L            胰岛素                1.6～12.8mg/L

转铁蛋白     3.6～5.8mg/L        β-巯基乙醇           0.52～0.88mg/L

氨基乙醇     0.48～11mg/L        牛血清白蛋白          450～600mg/L 

肝素钠        0.1～1mg/L    人碱性纤维细胞生    5～20ug/L

                            长因子

谷丙氨酸二肽  400-460mg/L。

6.一种如权利要求1～5所述的无血清培养液的配制方法，其特征在于包括以下步骤：(A)以DMEM/F12为基础培养基，再添加转铁蛋白、胰岛素、氨基乙醇、亚硒酸钠、β-巯基乙醇；(B)加入2-6ug/L的人TGF-β1在上述步骤A所得到的培养液中；(C)添加牛血清白蛋白-油酸，人FGF2，肝素钠，谷丙氨酸二肽，L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐。

7.一种如权利要求1～5所述的无血清培养液的使用方法，其特征在于：使肿瘤细胞株在如权利要求1～5所述的无血清培养液中培养；或将肿瘤组织的组织块剪碎或消化成单细胞接种到如权利要求1～5所述的无血清培养液中进行原代培养，在37℃，5％CO₂环境下培养48～72小时。 

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