CN111690616A - 一种培养肿瘤组织切片的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种培养肿瘤切片的方法，包括一个收集病人肿瘤样本的步骤；一个对肿瘤组织进行切片的步骤；一个对肿瘤组织进行培养的步骤；切片培养在含5％CO₂的37℃培养箱中，培养3‑7天，每2～3天换一次培养基。本发明的培养方法可以进行肿瘤的原代组织切片在体外的原代培养。在培养过程中，可以保证其中肿瘤细胞、基质细胞和浸润在肿瘤里的免疫细胞的活力。这样就可以在体外模拟肿瘤免疫相关药物的给药，直接在体外检测患者的用药效果。

Description

一种培养肿瘤组织切片的方法

技术领域：

本发明属于生物医学领域，涉及一种细胞的培养方法，具体来说是一种培养肿瘤组织切片的方法。

背景技术：

目前癌症治疗的两个巨大挑战是:(i)肿瘤异质性高且不断进化，导致耐药；(ii)基质细胞和免疫细胞被肿瘤细胞劫持，导致其无法监测肿瘤的发生。虽然免疫治疗已经成功的治愈一部分患者，但是对大部分实体瘤来说我们还远远没有找到有效的治疗方法。

实体瘤具有复杂的肿瘤微环境，其最主要的两个特点是：异质性高且有复杂的三维结构，理想的实验室模型应该兼备这两个特点。虽然我们在2D模型(体外细胞培养法)中已经得到了很多数据，但是基于细胞培养的2D肿瘤模型不能反映宿主-肿瘤细胞相互作用的复杂性，缺乏肿瘤复杂的微环境，导致很多临床前模型在很大程度上不能预测药物疗效。类器官法包含了肿瘤组织的部分基本特征。和细胞培养体系相比，其优势在于类器官法可以一定程度上反应肿瘤复杂的生理和形态环境。然而其周期较长，通常需要培养数月的时间，才能取得稳定可传代的类器官。且难以解决类器官和免疫细胞的相互作用问题，很难用于免疫治疗相关药物的筛选。

发明内容：

针对现有技术中的上述问题，本发明提供了一种培养肿瘤切片的方法，所述的这种培养肿瘤切片的方法要解决现有技术中的类器官法培养组织的方法时间长、预测药物疗效的效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种培养肿瘤切片的方法，包括如下步骤：

1)一个收集病人肿瘤样本的步骤；收集肺癌病人手术取出的肿瘤组织，置于含100ug/mL原代细胞抗生素(primocin)的预冷CO₂非依赖培养基中；

2)一个对肿瘤组织进行切片的步骤；将步骤1)收集的病人肿瘤样本样品置于细胞培养皿中进行修块，所述的培养皿中含有Hank's平衡盐溶液，所述的溶液中还添加有青霉素和链霉素，在所述的溶液中，所述的青霉素的浓度为100U/mL，所述的链霉素的浓度为100U/mL，然后用震动切片机将肿瘤组织切片；

3)一个对肿瘤组织进行培养的步骤；将步骤2)的肿瘤组织切片进行培养，切片培养所使用的培养基的基础成份为含0.58mg/ml L-谷氨酰胺、4.5mg/mL葡萄糖和0.11mg/ml丙酮酸钠的DMEM高糖培养液，在所述的培养液中还含有如下的组份，各组份的浓度为，

人血清 0.02-2％(质量百分比)；

胎牛血清 5-15％(质量百分比)；

青链霉素 10-300U/mL；

谷氨酰胺 0.01-300mM；

2巯基乙醇 1-200uM；

甘氨酸 0.1-1mM；

L-丙氨酸 0.1-1mM；

L-天门冬酰胺 0.1-1mM；

L-天门冬氨酸 0.1-1mM；

L-谷氨酸 0.1-1mM；

L-脯氨酸 0.1-1mM；

L-丝氨酸 0.1-1mM；

丙酮酸钠 0.05-50mM；

重组人白介素2 1-200ng/mL；

胰岛素 0.01-0.05mg/mL；

转铁蛋白 5.5-27.5ug/mL；

亚硒酸钠 0.67-3.35ug/mL；

重组人巨噬细胞集落刺激因子 0.001-0.08ng/ml；

培养在含体积百分比为5％CO₂的37℃培养箱中进行，培养3-7天，每2～3天换一次培养基。

在本发明的培养基中，加入血清是因为血清中含有一些可以促进细胞生长的酶类和激素，及各种营养物质。加入青链霉素是为了预防细菌污染。谷氨酰胺可以提供细胞蛋白合成的原料。2巯基乙醇可以保证培养体系的抗氧化能力，保持细胞活力。甘氨酸、L-丙氨酸、L-天门冬酰胺、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸可以提供细胞蛋白合成的原料。丙酮酸钠是除葡萄糖之外的额外碳源及能量来源。重组人白介素2可以保证切片中淋巴细胞的活力和增殖能力。胰岛素促进各种细胞对葡萄糖和氨基酸的吸收，促进有丝分裂。转铁蛋白可以提供额外的铁元素来源，且避免单质铁对细胞的毒性，铁元素是细胞生长必须的微量元素。亚硒酸钠可以提供额外的硒元素来源，硒元素是细胞生长必须的微量元素。重组人巨噬细胞集落刺激因子可以保证切片中髓系免疫细胞的活力和增殖能力。

本发明提供的一种培养肿瘤切片的方法，用以研究肿瘤的免疫微环境和及其对免疫调节药物的反应。我们对来自于肺癌病人的3个肿瘤组织进行肿瘤切片，并对免疫细胞组成进行了表征。首先，通过流式细胞术对肿瘤切片中浸润的CD45⁺淋巴细胞进行表征，以了解这些切片的免疫组成以及它们与原始肿瘤的相似性。然后我们对培养的肿瘤切片用帕博丽珠单抗(PD-1抗体)进行刺激，发现帕博丽珠单抗确实可以和肿瘤中的T细胞进行结合。进而对肿瘤切片中的免疫细胞进行分型，结果证明，在帕博丽珠单抗的作用下，来自病人的3个肿瘤样本中的两个均出现了Trm和TAM的增加，这为用肿瘤切片培养法体外检测帕博丽珠单抗的药效提供了细胞学水平的证据。

最终通过对培养过的肿瘤切片进行病理和免疫组化分析，证明肿瘤切片培养后细胞增殖和凋亡情况，和切片培养液中细胞因子含量，组织中mRNA的转录水平均可以互相验证。当培养液中有较高的炎症因子水平，其肿瘤切片对免疫治疗响应结果也约积极。而招募髓系免疫细胞形成TAM，抑制免疫杀伤能力的切片中，则对帕博丽珠单抗响应不甚良好。培养使用流式细胞仪对对免疫细胞亚群的分析，和肿瘤培养上清中细胞因子含量亦具有一致性。炎症因子水平高，则杀伤性T细胞所占亚群也相对较高。髓系细胞因子含量较高，则杀伤性T细胞说所占亚群比例相对较低，且激活较不充分。其结果和细胞因子水平的就检测具有一致性。且经帕博丽珠单抗共同培养后，免疫细胞上各免疫检查点的转录水平均有不同程度的上调，为这些免疫检查点抑制剂和帕博丽珠单抗联用进一步提供了理论基础。

目前的肿瘤体外培养，只能看一般细胞毒药物的药效，因为常规的培养体系是没有办法保存其中免疫细胞的活力的。所以本发明的方法优势是可以进行免疫治疗的药效评估，或者拿来筛选新的免疫治疗药物。而且因为保存了所有免疫细胞，所以目前的和以后的针对各类免疫细胞亚群的药物都可以用。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明的培养方法可以进行肿瘤的原代组织切片在体外的原代培养。在培养过程中，可以保证其中肿瘤细胞，基质细胞和浸润在肿瘤里的免疫细胞的活力。这样就可以在体外模拟肿瘤免疫相关药物的给药，直接在体外检测患者的用药效果。

附图说明：

图1是病人肿瘤组织切片培养前后的免疫组织化学切片，对细胞的增殖标志物Ki-67进行染色。结果显示培养液对照组相比培养前，肿瘤细胞可继续增殖，并未因培养而失去增殖能力。而帕博丽珠单抗组和培养液对照组相比，肿瘤细胞增殖明显降低，证明其可有效降低肿瘤细胞的增值能力。

图2是病人肿瘤组织切片培养前后的免疫组织化学切片，对细胞的凋亡标志物Caspase-3进行染色。结果显示培养液对照组中肿瘤细胞的凋亡情况和培养前变化不大，而帕博丽珠单抗组的肿瘤细胞凋亡明显增加。证明帕博丽珠单抗可以有效促进肿瘤细胞的凋亡。

图3是病人肿瘤培养前后的流式细胞仪分析图，证明经培养后，切片中免疫细胞的存活情况和培养前变化不大。

图4显示与帕博丽珠单抗共培养后，T细胞表面的PD-1表达量明显降低。证明帕博丽珠单抗对T细胞表面的PD-1表位的占位作用非常明显。

图5显示与帕博丽珠单抗共培养后，肿瘤切片中Trm细胞(CD8+CD103+T细胞)的数量显著增加，证明T细胞被激活，且产生了特异性的免疫反应。并最终分化为Trm驻留的组织中。

图6显示与帕博丽珠单抗共培养后，肿瘤切片中肿瘤相关巨噬细胞(TAM,CD11B+CD163+细胞)的数量是否增加可以是一个预测该患者对帕博丽珠单抗是否有响应的指标。因为TAM会显著抑制T淋巴细胞对肿瘤的杀伤。该图中患者的肿瘤切片，经培养后帕博丽珠单抗组中肿瘤相关巨噬细胞没有增加。其余实验结果，包括细胞因子释放，免疫组化等分析均表明帕博丽珠单抗对患者的肿瘤组织切片有较好的治疗效果。

图7显示患者的肿瘤切片，经培养后帕博丽珠单抗组中肿瘤相关巨噬细胞显著增加。其余实验结果，包括细胞因子释放，免疫组化等分析均表明帕博丽珠单抗对患者的肿瘤组织切片基本没有治疗效果

图8显示了使用Luminex检测各组肿瘤切片培养上清中的细胞因子的含量。

图9显示了使用RNAseq检测经培养后的各组肿瘤切片中的基因表达情况。

具体实施方式：

实施例1

1.材料与方法

1.1病人肿瘤样本的收集

收集肺癌病人手术取出的肿瘤组织，立刻置于含100ug/mL原代细胞抗生素(primocin)预冷CO₂非依赖培养基中。切片前保证肿瘤置于4℃的环境中。

1.2肿瘤的切片及培养

1)病人样品置于直径10cm细胞培养皿中进行修块，所述的培养皿中含有Hank's平衡盐溶液，所述的溶液中还添加有青霉素和链霉素，在所述的溶液中，所述的青霉素的浓度为100U/mL，所述的链霉素的浓度为100U/mL。将肿瘤组织周围的结缔组织、坏死组织去掉。用震动切片机将肿瘤组织切成200-300μm的肿瘤组织切片。单个肿瘤组织切片用直径30-mm，厚度0.4-μm插入式细胞培养皿在6孔细胞培养板中进行培养。切片培养所使用的培养基的基础成份为含0.58mg/ml L-谷氨酰胺、4.5mg/mL葡萄糖和0.11mg/ml丙酮酸钠的DMEM高糖培养液，在所述的培养液中还含有如下的组份，各组份的浓度为，

人血清 0.02-2％(质量百分比)；

胎牛血清 5-15％(质量百分比)；

青链霉素 10-300U/mL；

谷氨酰胺 0.01-300mM；

2巯基乙醇 1-200uM；

甘氨酸 0.1-1mM；

L-丙氨酸 0.1-1mM；

L-天门冬酰胺 0.1-1mM；

L-天门冬氨酸 0.1-1mM；

L-谷氨酸 0.1-1mM；

L-脯氨酸 0.1-1mM；

L-丝氨酸 0.1-1mM；

丙酮酸钠 0.05-50mM；

重组人白介素2 1-200ng/mL；

胰岛素 0.01-0.05mg/mL；

转铁蛋白 5.5-27.5ug/mL；

亚硒酸钠 0.67-3.35ug/mL；

重组人巨噬细胞集落刺激因子 0.001-0.08ng/ml；

培养在含体积百分比为5％CO₂的37℃培养箱中进行，培养3-7天，每2～3天换一次培养基。

1.3帕博丽珠单抗在肺癌组织切片中的药效学评价

为了进一步验证该肿瘤切片培养体系对帕博丽珠单抗等免疫治疗药物的药效评价能力，我们在3个肺癌病人的肿瘤切片的培养基中加入帕博丽珠单抗或同型对照抗体，培养72小时后别对切片进行病理学检测、FACS的免疫分型、培养基中细胞因子的分泌，并用RNA-Seq的方式对培养前后的切片进行测序，检测肿瘤相关基因表达量的变化。

结果发现，经和帕博丽珠单抗共同培养后，对其有响应的患者的肿瘤切片中，T细胞激活水平有明显上升，相应的促炎细胞因子表达及转录水平均亦有明显上升，各类免疫检查点的转录水平均相应上调。而对其没有响应的患者的肿瘤切片中，T细胞激活水平并没有变化，相应的促炎因子的水平及免疫检查点水平也未见上升。相反的，肿瘤浸润细胞中肿瘤相关巨噬细胞TAM及负责招募TAM的髓系细胞因子水平有明显上升。证明该肿瘤切片培养系统中，肿瘤切片对帕博丽珠单抗为代表的免疫治疗手段响应及其下游因子的变化，和临床及目前的免疫治疗理论高度一致。该切片培养体系对患者对免疫治疗是否有响应，能否从中受益有很好的预测作用。

1.3.1切片的病理学评价

培养前后的肿瘤切片进行石蜡包埋并制成2μm的切片用于形态学和免疫组织化学的分析。形态学分析用H&E(Hematoxylin and eosin)进行染色，采用Ki-67免疫组化法进行增殖活性分析，采用裂解Caspase 3(cleaved Caspase 3)免疫染色法检测凋亡指数。

我们对3个肺癌病人肿瘤组织切片进行常规病理检查。培养72小时后肿瘤切片和原始组织的病理切片在肿瘤生长模式、结构、分化程度积极肿瘤细胞形态上具有高度的相似性；肿瘤组织切片显示极微小的核异质变化，如核破裂、核溶解或核固缩。

免疫组织化学评估显示，培养后增殖活性(Ki-67)的肿瘤细胞增殖有一定程度的增加，说明肿瘤在体外培养72h后依然可以保持其病理特性和增殖活性。而经过和帕博丽珠单抗共同培养后，肿瘤切片中Ki67的表达有明显降低，证明帕博丽珠单抗可以有效的降低肿瘤的增殖(图1)。

免疫组织化学评估同样显示，培养前后肿瘤切片的凋亡情况没有明显变化(Caspase-3的表达),而经过和帕博丽珠单抗共同培养后，肿瘤切片中Caspase-3的表达有明显升高。证明帕博丽珠单抗可以有效促进肿瘤细胞的凋亡。(图2)

1.3.2肿瘤切片中浸润免疫细胞的免疫分型流式分析

我们用两个不同的FACS panel分别检测肿瘤中的淋系和髓系细胞。将肿瘤切片消化为单细胞悬液，用含有10％兔血清和抗CD16/32(clone2.4G2)的Fc受体阻断液在染色缓冲液(5％FBS,10％sodiumazide,PBS)中保存10分钟来减少非特异性的结合。用来自Biolegend或BD Biosciences的抗体在冰上染色30分钟:

染色后细胞用PBS清洗一次，并用eFluor 780dye(ebioscience,染色来测定所有样本的总活力。FACS使用Beckman Coulter CytoFlex LX仪器，并使用Flowjo(BD)进行分析。每个样本至少收集了30,000个事件。使用单染管法进行补偿调节；死细胞和黏连细胞通过对染料进行控制来消除，这些染料可以区分活细胞和死细胞，也可以区分分散特征或两者兼而有之。根据已知的细胞表面标记标记免疫细胞群。

1)肿瘤切片在体外培养72h后依然保持活性(CD45％)：(图3)

2)与帕博丽珠单抗共培养后，T细胞表面的PD-1表位占位明显。(图4)

3)与帕博丽珠单抗共培养后，肿瘤切片中Trm细胞(CD8+CD103+T细胞)的数量显著增加，证明T细胞被激活，且产生了特异性的免疫反应。并最终分化为Trm驻留的组织中。(图5)

4)与帕博丽珠单抗共培养后，肿瘤切片中肿瘤相关巨噬细胞(TAM,CD11B+CD163+细胞)的数量是否增加可以是一个预测该患者对帕博丽珠单抗是否有响应的指标。因为TAM会显著抑制T淋巴细胞对肿瘤的杀伤。

如图6中对患者的肿瘤切片，经培养后帕博丽珠单抗组中肿瘤相关巨噬细胞没有增加。其余实验结果，包括细胞因子释放，免疫组化等分析均表明帕博丽珠单抗对该患者的肿瘤组织切片有较好的治疗效果。

如图7中对患者的肿瘤切片，经培养后帕博丽珠单抗组中肿瘤相关巨噬细胞显著增加。其余实验结果，包括细胞因子释放，免疫组化等分析均表明帕博丽珠单抗对该患者的肿瘤组织切片基本没有治疗效果。

1.3.3细胞因子的检测

我们对切片的培养基进行收集，并用Luminex200液相芯片分析系统搭配Bio-PlexPro Human Cytokine Screening Panel 48-plex Luminex Kit(Bio rad)进行细胞因子的检测。这个试剂盒可以同时检测48个细胞因子和趋化因子包括免疫细胞因子IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-9、IL-13、IL15和GM-CSF；促炎性细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-1ra,IL-6、IL-10,IL-17、TNF-α,IFN-γ,IFN-α2TNF-α；抗炎细胞因子IL-10、IL-12(p40)和IL-12(p70)。

如图8所示，使用Luminex检测培养上清中各组的细胞因子的含量，可见T细胞激活相关细胞因子如IL-2Ra，促炎及细胞杀伤细胞因子TNF-a及IFN-r的含量明显上升。证明与帕博丽珠单抗共培养后，T细胞的激活和细胞杀伤都明显加强。

如图9所示，使用RNAseq检测经培养后，各组的肿瘤切片中的基因表达情况。有如下发现：

1)与帕博丽珠单抗共培养后，肿瘤切片中IFN-r,TNF-a,IL-6,CD25(IL-2Ra)的表达相比溶媒对照和同型抗体对照组有明显提高。该结果和Luminex的结果相符，证明T细胞的激活水平和炎症因子的表达水平均明显上升。

2)与帕博丽珠单抗共培养后，肿瘤切片中各免疫检查点，包括PD-1,LAG3,Tim3,TIGHT和OX40等的表达相比溶媒对照和同型抗体对照组有明显提高。进一步使用针对其它免疫检查的的抗体，可能可进一步加强免疫治疗的药效。

该现象与临床上肿瘤免疫治疗中观察到的现象一致。证明该切片培养平台和临床相关性较高。为肿瘤免疫治疗的后续发展，可作为一个有效的研究平台。

3)与帕博丽珠单抗共培养后，肿瘤切片中各髓系细胞因子，包括M-CSF,G-CSF和GM-CSF等，表达量明显增加。这些细胞因子是诱导肿瘤相关巨噬细胞TAM分化的重要细胞因子。该结果与细胞因子检测结果相符。

4)与帕博丽珠单抗共培养后，肿瘤切片中MHC-II(B2M)和HLA各亚基的表达量明显增加。这些亚基在T细胞的特异性免疫应答中起到非常重要的作用。这些亚基的表达量上升，证明与帕博丽珠单抗共同培养后，产生了特异性的免疫识别和免疫应答作用。为其药效提供了证明。

上述结果证明，该肿瘤切片培养体系，可以有效预测帕博丽珠单抗对肿瘤的免疫治疗效果，包括切片中肿瘤细胞的活力，增值能力及各类下游生物标志物的变化均与目前的临床响应及肿瘤免疫治疗理论一致。其结果具有极高的临床相关性。该平台可以有效预测肿瘤患者对帕博丽珠单抗和肿瘤免疫治疗的响应程度，并有丰富的潜力用于其它肿瘤免疫治疗药物的疗效预测和分析、其作为疗效预测平台有很高的价值。同时也可以为肿瘤免疫疗法的进一步开发提供临床前的测试平台，辅助新的肿瘤免疫治疗药物和方法的开发和完善。

Claims (1)

1.一种培养肿瘤切片的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)一个收集病人肿瘤样本的步骤；收集肺癌病人手术取出的肿瘤组织，置于含100ug/mL原代细胞抗生素的预冷CO₂非依赖培养基中；

2)一个对肿瘤组织进行切片的步骤；将步骤1)收集的病人肿瘤样本样品置于细胞培养皿中进行修块，所述的培养皿中含有Hank's平衡盐溶液，所述的溶液中还添加有青霉素和链霉素，在所述的溶液中，所述的青霉素的浓度为100U/mL，所述的链霉素的浓度为100U/mL，然后用震动切片机将肿瘤组织切片；

3)一个对肿瘤组织进行培养的步骤；将步骤2)的肿瘤组织切片进行培养，切片培养所使用的培养基的基础成份为含0.58mg/ml L-谷氨酰胺、4.5mg/mL葡萄糖和0.11mg/ml丙酮酸钠的DMEM高糖培养液，在所述的培养液中还含有如下的组份，各组份的浓度为，

培养在含体积百分比为5％CO₂的37℃培养箱中进行，培养3-7天，每2～3天换一次培养基。

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