CN109112106A

CN109112106A - 人原代肝癌组织的体外模型的建立方法

Info

Publication number: CN109112106A
Application number: CN201811040185.3A
Authority: CN
Inventors: 黄朝峰; 赵擎宇; 刘忠华; 尹萌; 陈焕鹏; 李永超
Original assignee: Guangzhou Changfeng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Changfeng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-09-07
Filing date: 2018-09-07
Publication date: 2019-01-01
Anticipated expiration: 2038-09-07
Also published as: CN109112106B

Abstract

本发明涉及一种人原代肝癌组织的体外模型研究的技术领域，尤指人原代肝癌组织的体外模型的建立方法，主要包括：1）收集新鲜肝癌组织标本；2）将肝癌组织置于培养液中；3）低温运输并准备进一步处理；4）将取得的肝癌组织切成米粒大小；5）所述肝癌组织经含抗生素的PBS清洗，然后置于48孔板中；6）所述肝癌组织经冰冻包埋切片，进行原位末端标记法，检测组织凋亡情况；7）切片均在显微镜下取三个视野；8）统计各组平均光密度；9）进行统计分析；本发明利用人原代肝癌组织进行体外培养，建立了一种抗凋亡、去分化的模型，进行体外的无血清培养，无需消化、传代，制备程序比较方便快捷，保留原发肿瘤的异质性和空间结构；更能减少组织凋亡。

Description

人原代肝癌组织的体外模型的建立方法

技术领域

本发明涉及一种人原代肝癌组织的体外模型研究的技术领域，尤指人原代肝癌组织的体外模型的建立方法。

背景技术

肝细胞癌是一种常见的恶性肿瘤，尽管近年来采用分子生物学技术研究肝癌的发生，但仍缺乏对肝癌发病机制的确切认识，随着人们对肝癌动物模型研究的不断深入，逐渐建立了自发型、诱发性、移植性及转基因动物肝癌模型，因为这些模型很好地模拟了人类肝癌，可以用于肝癌的生理、细胞和分子等发病机制方面的研究，也可用于肝癌治疗药物的筛选以及基因治疗的探索。

原发性肝癌是最常见的高度恶性肿瘤之一，易多发、转移或复发等，一直以来，以肿瘤细胞系为主的二维培养(Two-dimensional culture,2D)模型为研究肿瘤癌变、分子遗传、浸润转移、药物治疗等方面做出突出贡献，但经过体外筛选的稳定细胞株缺乏肿瘤异质性；细胞增殖过程可能出现不可逆转的改变，包括基因的突变和缺失、生长和侵袭能力的改变；连续传代的肿瘤细胞株适应了外界培养皿的环境，缺乏肿瘤微环境的作用，如非肿瘤细胞、细胞外基质、肿瘤微环境因子，因此建立保留原发肿瘤特性，能够客观反应肿瘤实际情况的体外模型对于肿瘤研究具有重要意义。

近年来发展的体外三维培养(Three-dimensional culture,3D)的类器官模型(Clevers H. et al.,2016, 2018)则是利用各种生物支架材料，如基质胶、胶原、海藻盐、聚乳酸、聚乙醇酸等，模拟体内微环境，使原代细胞形成良好的空间分布和细胞间联系，为体外药物筛选(Broutier L et al., 2017)、肿瘤干细胞研究(Papapetrou E P et al.,2016)等提供新型工具，但是该模型制备较难，技术要求较高；相比于肿瘤细胞系及肿瘤原代细胞，原代组织块更多的保留原发肿瘤的异质性和空间结构，最新的一项利用原发性胶质母细胞瘤组织的体外三维培养(Hubert C G et al., 2016)，为非上皮源性肿瘤的组织块培养奠定基础。

然而，体外培养的另一个关键点是培养基的选择和优化；传统的细胞系培养通常需添加血清，为细胞生长提供所需的激素、生长因子、转移蛋白和其他营养物质，促进细胞贴壁、生长与分裂增殖；但血清的长期作用，会促进细胞不可逆的分化和表型的丧失(Jasmund I et al., 2007)，此外，血清中成分复杂，不利于肿瘤相关信号通路研究，且来源地广批次间差异大。

因此，以肿瘤细胞系为主的二维培养模型经过体外筛选的稳定细胞株缺乏肿瘤异质性和肿瘤微环境的作用，且在增殖过程可能出现不可逆转的改变，如基因的突变和缺失等，不能客观反应肿瘤实际情况；而近年来发展的体外三维培养的细胞类器官模型虽然是体外药物筛选、肿瘤干细胞研究等提供新型工具，但是该模型制备较难，技术要求较高。

参考文献：

Chen W, Zheng R, Baade P D, et al. Cancer statistics in China, 2015. CA:A Cancer Journal for Clinicians, 2016, 66(2): 115-132.

Clevers H. Modeling Development and Disease with Organoids.[J]. Cell,2016, 165(7): 1586-1597.

Drost J, Clevers H. Organoids in cancer research[J]. Nature ReviewsCancer, 2018(Suppl. 2).

Broutier L, Mastrogiovanni G, Verstegen M M, et al. Human primary livercancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.Nature Medicine, 2017, 23(12):nm.4438.

Papapetrou E P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancerresearch and precision oncology. Nature Medicine, 2016, 22(12): 1392-1401.

Hubert C G, Rivera M, Spangler L C, et al. A Three-Dimensional OrganoidCulture System Derived from Human Glioblastomas Recapitulates the HypoxicGradients and Cancer Stem Cell Heterogeneity of Tumors Found In Vivo. CancerResearch, 2016, 76(8): 2465-2477.

Jasmund I, Schwientek S, Acikgoz A, et al. The influence of mediumcomposition and matrix on long-term cultivation of primary porcine and humanhepatocytes. Biomolecular Engineering, 2007, 24(1): 59-69.

Bonni A, Brunet A, West A E, et al. Cell Survival Promoted by the Ras-MAPK Signaling Pathway by Transcription-Dependent and -IndependentMechanisms. Science, 1999, 286(5443): 1358-1362.

Takahashi H, Honma M, Miyauchi Y, et al. Cyclic AMP differentiallyregulates cell proliferation of normal human keratinocytes through ERKactivation depending on the expression pattern of B-Raf. Archives ofDermatological Research, 2004, 296(2): 74-82。

发明内容

为解决上述问题，本发明旨在公开一种人原代肝癌组织的体外模型研究的技术领域，尤指人原代肝癌组织的体外模型的建立方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：人原代肝癌组织的体外模型的建立方法，其特征在于，所述的建立方法主要包括以下步骤：

1）收集经手术切除的新鲜肝癌组织标本；

2）将所述肝癌组织暂时置于预冷的含抗生素的培养液中储存；

3）然后于2h内完成低温运输并准备进一步处理；

4）在无菌操作台内，将从步骤2）的培养液中取得的肝癌组织切成米粒大小；

5）所述肝癌组织经含抗生素的PBS清洗，然后置于48孔板内；随后在48孔板中加入培养基，再添加调节激酶抑制剂PD98059；

6）所述肝癌组织经冰冻包埋切片，进行原位末端标记法，通过免疫荧光染色检测组织凋亡情况；

7）每张切片均在荧光显微镜下取三个视野；

8）通过Image J软件统计各组平均光密度；

9）通过GraphPad Prism软件进行统计分析。

优选地，所述用于步骤1）的肝癌组织标本大小为1-3cm³。

优选地，所述用于步骤2）的培养液为无血清RPMI-1640培养液。

优选地，所述步骤5）的每个孔板加入400ul培养基，每三天换一次液，并置于5％CO₂、37℃的恒温箱中培养2个月。

优选地，所述步骤1）新鲜肝癌组织标本数量选取为5份。

优选地，所述步骤5）的培养基中，还添加有人工基质胶。

本发明的有益效果体现在：本发明利用人原代肝癌组织进行体外培养，建立了一种抗凋亡、去分化的模型，为肿瘤病理研究和药物筛选开发出新的工具；同时本发明利用人原代肝癌组织进行体外的无血清培养，无需消化、传代，制备程序比较方便快捷，并且可以更多地保留原发肿瘤的异质性和空间结构；其中PD98059和人工基质胶优化后的培养基更能减少组织凋亡，使其成为肝癌体外研究的重要工具。

本发明的无血清培养广泛应用于肿瘤干细胞的筛选和肿瘤原代细胞培养；无血清培养基一般由基础培养基和替代血清的各种因子组成，基础培养基按照比列加入氨基酸、蛋白、抗生素等，替代因子有激素、生长因子、微量元素等；本发明利用人原代肝癌组织进行体外的无血清培养，添加细胞外信号调节激酶（Erk1/2）抑制剂PD98059(Bonni A et al.,1999)和蛋白激酶A(PKA)激动剂霍乱毒素(Takahashi H et al., 2004)作为对照优化培养条件；并且比较其在不加人工基质胶（2D）和加入后（3D）的差异，建立一种抗凋亡、去分化的人原代肝癌组织的体外模型，而添加人工基质胶的组织凋亡明显减少，且在2D及3D组中，添加PD98059可以减少组织凋亡。

附图说明

图1是本发明具体实施例一的体外组织培养的培养基组分及相应浓度对照表。

图2是本发明具体实施例一的免疫荧光的原位末端标记（Tunel）法检测肝癌组织各组凋亡情况图。

图3是本发明具体实施例一的光密度半定量统计图。

具体实施方式

下面结合附图详细说明本发明的具体实施方式：

人原代肝癌组织的体外模型的建立方法，所述的建立方法主要包括以下步骤：

1）收集经手术切除的5份新鲜肝癌组织标本；患者在术前均经病理学检查确诊为肝细胞癌；

2）取大小为1-3cm³的肝癌组织标本，将所述肝癌组织暂时置于预冷的含抗生素的培养液中储存；培养液为无血清RPMI-1640培养液；

无血清RPMI-1640培养液为Roswell Park Memorial Institute研发的无血清细胞培养基，无血清细胞培养基采用化学添加剂即可维持神经细胞存活与生长而不需要在培养基中添加血清，在某些培养方案中，细胞直接进入无血清培养，可以消除来自血清的不均一性，更为重要的是，它们可用来检测生长因子以及其他促进神经元存活或生长的因子，或者用来检测那些可保护神经元免遭环境毒物损伤的制剂，专用于神经元的培养基在某些培养环境中还可以减低非神经元细胞的增殖；

3）然后于2h内完成低温运输并准备进一步处理；需要采用冰块维持低温环境，并要求在短期内完成运输过程，否则影响使用质量；

5）所述肝癌组织切粒后经含抗生素的PBS清洗，然后置于48孔板内；随后在48孔板中加入培养基，再添加调节激酶抑制剂PD98059；每个孔板加入400ul的培养基，每三天换一次液，并置于5％CO₂、37℃的恒温箱中培养2个月；

所述步骤5）的培养基中，还添加有人工基质胶，从而优化模型建立效果；

PBS为磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline），起溶解保护试剂的作用，含抗生素的PBS，还具有抑菌或杀菌作用；

6）所述肝癌组织经冰冻包埋切片，进行原位末端标记法（Terminal-deoxynucleoitidyl Transferase Mediated Nick End Labeling, Tunel），通过免疫荧光染色检测组织凋亡情况；

7）每张切片均在荧光显微镜下取三个视野；

8）通过Image J软件统计各组平均光密度；

9）通过GraphPad Prism软件进行统计分析。

进一步具体应用：

步骤5）中的培养基的主要成分如图1所示，其必要成分为：RPMI1640 + PS+丙酮酸钠+ non-AA +谷氨酰胺、4 mg/mL BSA、10 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF、5 ug/mL insulin，另外可以选择性仅添加调节激酶抑制剂PD98059，或仅添加蛋白激酶A激动剂霍乱毒素，或者同时添加调节激酶抑制剂PD98059与蛋白激酶A激动剂霍乱毒素，从而比较模型建立效果；

2D/3D培养液成分	Control	PD	霍乱毒素	PD+霍乱毒素
					RPMI1640 + PS+丙酮酸钠+non-AA +谷氨酰胺	√	√	√	√
4 mg/mL BSA	√	√	√	√
					10 ng/ml bFGF	√	√	√	√
20 ng/ml EGF	√	√	√	√
					5 ug/mL insulin	√	√	√	√
0.1nM霍乱毒素			√	√
					25nM PD98059		√		√

如图1，为体外组织培养的培养基组分及相应浓度的对照表，“√”代表各组添加的成分；每组5份中分化肝癌样本；对照组分别对照添加调节激酶抑制剂PD98059、霍乱毒素或者调节激酶抑制剂PD98059+霍乱毒素的效果；

在相同培养基的2D培养方法与3D培养方法中，3D培养方法效果更好：

2D培养方法为：在48孔板中放入2-3块肝癌组织，然后每孔加400ul培养基；

3D培养方法为：在48孔板的每孔内平铺60ul人工基质胶，待凝固后放入2-3块肝癌组织，再加入100-120ul人工基质胶覆盖肝癌组织，继而添加400ul培养基。

如图2，为免疫荧光的原位末端标记（Tunel）法检测肝癌组织各组凋亡情况示意图，2D、3D每组5份中分化肝癌样本，图示为其中一份样本；

图中A表示：2D培养，ⅹ200；图中B表示：3D培养，ⅹ200；

由荧光显示可判断，采用3D培养的组织凋亡比2D培养的组织凋亡减少。

如图3，通过Image J 软件进行光密度半定量统计，通过GraphPad Prism软件进行统计分析，*：P<0.05；

结果显示：

1）在培养基添加PD98059相比添加霍乱毒素能减少组织凋亡；

2）在培养基添加PD98059相比添加PD98059与霍乱毒素能减少组织凋亡；

3）在培养基添加PD98059和人工基质胶后，减少组织凋亡的效果最佳。

Image J是一个基于java的公共的图像处理软件，由National Institutes ofHealth开发的，可运行于Microsoft Windows，MacOS，MacOSX，Linux，和SharpZaurusPDA等多种平台，基于java的特点，使得它编写的程序能以applet等方式分发；Image J支持图像栈（stack）功能，即在一个窗口里以多线程的形式层叠多个图像，并行处理；能打开任意多的图像进行处理，除了基本的图像操作，比如缩放，旋转，扭曲，平滑处理外，ImageJ还能进行图片的区域和像素统计，间距，角度计算，能创建柱状图和剖面图，进行傅里叶变换。GraphPad Prism软件为基础生物统计及绘图综合软件，集曲线适配和科学图表绘制于一体，组织、分析和注标重复性的实验结果；通过引导分析进程，测试得出试验对象和数据。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明的技术范围作任何限制，本行业的技术人员，在本技术方案的启迪下，可以做出一些变形与修改，凡是依据本发明的技术实质对以上的实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.人原代肝癌组织的体外模型的建立方法，其特征在于，所述的建立方法主要包括以下步骤：

1）收集经手术切除的新鲜肝癌组织标本；

3）然后于2h内完成低温运输并准备进一步处理；

7）每张切片均在荧光显微镜下取三个视野；

8）通过Image J软件统计各组平均光密度；

9）通过GraphPad Prism软件进行统计分析。

2.根据权利要求1所述的人原代肝癌组织的体外模型的建立方法，其特征在于，所述用于步骤1）的肝癌组织标本大小为1-3cm³。

3.根据权利要求1所述的人原代肝癌组织的体外模型的建立方法，其特征在于，所述用于步骤2）的培养液为无血清RPMI-1640培养液。

4.根据权利要求1所述的人原代肝癌组织的体外模型的建立方法，其特征在于，所述步骤5）的每个孔板加入400ul培养基，每三天换一次液，并置于5％CO₂、37℃的恒温箱中培养2个月。

5.根据权利要求1所述的人原代肝癌组织的体外模型的建立方法，其特征在于，所述步骤1）新鲜肝癌组织标本数量选取为5份。

6.根据权利要求1所述的人原代肝癌组织的体外模型的建立方法，其特征在于，所述步骤5）的培养基中，还添加有人工基质胶。