CN113512533A - 一种高精密组织芯片的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高精密组织芯片的制备方法及应用,制备方法包括以下步骤:步骤一,将组织块用预冷凝胶进行包埋,凝固后根据组织大小进行修剪;步骤二,在修剪后的组织芯片中加入培养基,于37℃、5%CO2浓度下培养2~7天,培养过程中每隔2‑3天更换一次培养基。该高精密组织芯片具体为肿瘤高精密组织芯片应用于免疫功能评价。本发明的高精密组织芯片相对于组织块体外培养,精密组织切片厚度精确,组间差异小,保证实验的可重复性。同时,解决了传统的组织切片培养体系存在的细胞生长缓慢、血清批间差异大且带有免疫原性、实验的不确定性等弊端。
Description
技术领域
本发明涉及组织芯片制备技术领域,具体涉及一种高精密组织芯片的制备方法及应用。
背景技术
近年来,癌症免疫疗法领域取得了显著突破,改变了癌症的治疗格局。针对免疫检查点的抗体(例如CTLA-4和PD-1/PD-L1)的使用已显示出对患有晚期癌症包括黑色素瘤,非小细胞肺癌和错配修复缺陷的大肠癌患者具有明显的临床益处。此外,离体扩增的自体肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的过继转移已在黑色素瘤中显示出令人印象深刻的临床反应,并在子宫颈癌中显示出早期的临床信号。但仍有很大一部分患者由于免疫原性抗原数量少、抗原呈递和/或其他免疫检查点分子的表达缺陷等不同的原因导致当前的免疫疗法失败。考虑到癌症的免疫逃逸机制种类繁多,要预测单个患者是否对免疫疗法敏感、耐药性可能是哪种机制以及可能克服耐药性的替代治疗方法仍然非常困难。
目前,分离鉴定TIL或免疫检查点抑制剂的方法,是将从肿瘤患者体内分离切除的肿瘤组织,经过体外与肿瘤细胞共培养,利用酶联免疫吸附试验检测体外淋巴细胞IFN-γ分泌,进而测定淋巴细胞或检查点药物的肿瘤杀伤活性。但是,在体外分离富集TIL再重新与肿瘤细胞共培养的方法操作复杂、样本要求高、成功率低,且难以模拟体内TIL与实体瘤的浸润及真实的杀伤作用。研究个体患者的肿瘤T细胞相互作用并了解反应性决定因素(以个性化的方式诱导和分析肿瘤特异性T细胞对肿瘤的反应)的难题仍未解决。
体外组织培养被认为是介于细胞研究和动物研究之间的一种过渡性生物医学研究方法,在现代生物医学实验中被大量应用。单纯的体外细胞培养丧失了体内器官原有的种类繁多的细胞类型、细胞间联系和组织特异性的细胞外基质,而体外组织培养保留了其来源器官的所有细胞种类、细胞间联系和组织特异性的细胞外基质。与动物实验相比,患者来源的组织培养可消除动物体内复杂因素的影响,从而减少实验变量、降低研究经费、便于进行体外实时观察及测定,迅速得到准确的高通量实验数据。但传统的体外组织块培养难以精确控制组织块的大小,导致不同实验组之间的差异太大,无法保证实验的可重复性。此外,传统的体外组织块培养体系还存在细胞生长缓慢、血清批间差异大且带有免疫原性、实验的不确定性等弊端。
发明内容
针对现有技术存中的问题和缺陷,本发明提供一种高精密组织芯片的制备方法及应用,该方法的特异性组间差异小,实验重复性好,获得的高精密组织芯片厚度精确,且维持了组织正常的生理功能和结构。本发明的技术方案为:
第一方面,本发明提供一种高精密组织芯片的制备方法,包括以下步骤:
步骤一,将组织块用预冷凝胶进行包埋,凝固后根据组织大小进行修剪;
步骤二,在修剪后的组织芯片中加入培养基,于37℃、5%CO2浓度下培养2~7天,培养过程中每隔2-3天更换一次培养基。
进一步地,所述凝胶为浓度2~8mg/mL的人源I型胶原溶液与质量百分比为0.1~0.5%的1,4-丁二醇缩水甘油醚溶液交联而成。1,4-丁二醇缩水甘油醚浓度太高会导致凝胶脆性及毒性增加,浓度太低硬度不够,起不到包埋固定的作用。
优选地,所述凝胶为浓度4mg/mL的人源I型胶原溶液与质量百分比为0.25%的1,4-丁二醇缩水甘油醚溶液交联而成。
进一步地,修剪后组织芯片的厚度为250-350μm。芯片太薄操作难度增加,容易破碎,组织芯片太厚一个组织只能切到很少的几个芯片。此外,切片时在切片机盒中加入冰块。这样可以在切片的过程中防止组织芯片的干燥和变性。
优选地,修剪后组织芯片的厚度为300μm。
进一步地,所述培养基包括以下终浓度组分:20-500ng/mL的Noggin;20-500ng/mL的R-spondin 1;20-500ng/mL的Wnt3a;1-50ng/mL的wnt7a;10-2000nM的A-83-01-HCl;100-1000nM的PD 169316-HCl;1-100μM的Ripasudil(K-115)hydrochloride dihydrate;100U/mL的青霉素;0.1mg/mL的链霉素,以上成分溶于DMEM/F12培养基中。
进一步地,所述培养基还包括:1-10mg/mL的植物源重组人血清白蛋白(OsrHSA)。
第二方面,本发明提供一种高精密组织芯片,是采用上述制备方法获得。
第三方面,本发明提供上述高精密组织芯片在免疫功能评价中的应用。
进一步地,所述高精密组织芯片具体为肿瘤高精密组织芯片。
进一步地,所述应用包括以下步骤:
(1)将肿瘤高精密组织芯片分为实验组及对照组,在实验组中加入40μg/mL的PD1抗体,对照组中加入等体积的培养基,孵育24-96小时;
(2)将实验组和对照组的培养基移除,用HBSS清洗2次,加入100uL Hoechst33342dye(1:2000)、EpCam-FITC(1:20)、PI(1:1000),充分混匀后放置37℃培养箱中孵育20-30分钟;
(3)移除染色试剂,然后加入预热HBSS,孵育5-10分钟,移除HBSS,重复前述过程2-3次;
(4)将染色的肿瘤组织芯片进行高内涵分析设备层扫拍照,分析计算细胞活性。
优选地,所述步骤(1)中孵育时间为72小时。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明的高精密组织芯片相对于组织块体外培养,精密组织切片厚度精确,组间差异小,保证实验的可重复性。同时,解决了传统的组织切片培养体系存在的细胞生长缓慢、血清批间差异大且带有免疫原性、实验的不确定性等弊端。除此之外,高精密组织芯片能够保持几乎正常的细胞之间的连接,维持组织正常的生理功能和结构的特异性,比如针对肿瘤组织而制备的高精密肿瘤组织芯片,可以体现肿瘤的异质性。并且与肿瘤细胞或肿瘤类器官的免疫共培养法相比,高精密组织芯片操作简单,能直接保留重现体内实体瘤组织免疫微环境。
附图说明
图1为实施例5中小鼠小肠高精密组织芯片的组织形态图。
图2为实施例6中小鼠肺高精密组织芯片的组织形态图。
图3为实施例7中人结直肠癌高精密组织芯片的组织形态图。
图4为实施例8中人卵巢癌高精密组织芯片的组织形态图。
具体实施方式
在本发明的描述中,需要说明的是,实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明,所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一种制备小鼠小肠高精密组织芯片的方法,包括以下步骤:
步骤1.制备精密组织芯片:取新鲜的小鼠小肠组织用预冷凝胶进行包埋,放置37℃培养箱,凝固后根据组织大小进行修剪为300μm的精密组织芯片。所述凝胶为浓度4mg/mL的人源I型胶原溶液与质量百分比为0.25%的1,4-丁二醇缩水甘油醚溶液交联而成。
步骤2.精密组织芯片建模:将得到的精密组织芯片分别置于低粘附细胞培养板中,优选48孔板以进行后期高通量检测,然后在培养板内加入培养基,使得培养基液面高度充分浸没组织芯片。所述培养基为以下终浓度组成:50ng/mL的Noggin;100ng/mL的R-spondin 1;50ng/mL的Wnt3a;20ng/mL的wnt7a;200nM的A-83-01-HCl;200nM的PD 169316-HCl;20μM的Ripasudil(K-115)hydrochloride dihydrate;100U/mL的青霉素;0.1mg/mL的链霉素,溶剂为DMEM/F12培养基。此外,培养基中也可以进一步加入终浓度为1-10mg/mL的OsrHSA,培养速度会加快。
步骤3.将小鼠小肠精密组织芯片置于恒温培养箱在37℃,5%CO2浓度下培养。每隔2天更换一次培养基,培养7天后进行鉴定与活性检测实验。
实施例2
本实施例提供一种制备小鼠肺高精密组织芯片的方法,包括以下步骤:
步骤1.制备精密组织芯片:取新鲜的小鼠肺组织用预冷的凝胶进行包埋,放置37℃培养箱,凝固后根据组织大小进行修剪为300μm的精密组织芯片。所述凝胶为浓度8mg/mL的人源I型胶原溶液与质量百分比为0.5%的1,4-丁二醇缩水甘油醚溶液交联而成。
步骤2.精密组织芯片建模:将得到的精密组织芯片分别置于低粘附细胞培养板中,优选48孔板以进行后期高通量检测,然后在培养板内加入本发明培养基,使得培养基液面高度充分浸没组织芯片。所述培养基包括以下终浓度组成:5mg/mL的OsrHSA;100ng/mL的Noggin;300ng/mL的R-spondin 1;150ng/mL的Wnt3a;50ng/mL的wnt7a;50nM的A-83-01-HCl;500nM的PD169316-HCl;50μM的Ripasudil(K-115)hydrochloride dihydrate;100U/mL的青霉素;0.1mg/mL的链霉素,溶剂为DMEM/F12培养基。
步骤3.将小鼠肺精密组织芯片置于恒温培养箱在37℃,5%CO2浓度下培养。每隔2天更换一次培养基,培养4天后进行鉴定与活性检测实验。
实施例3
本实施例提供一种制备人结直肠癌高精密组织芯片的方法,包括以下步骤:
步骤1.制备精密组织芯片:取新鲜的手术废弃人结直肠肿瘤组织用预冷的凝胶进行包埋,放置37℃培养箱,凝固后根据组织大小进行修剪为300μm的精密组织芯片。所述凝胶为浓度2mg/mL的人源I型胶原溶液与质量百分比为0.1%的1,4-丁二醇缩水甘油醚溶液交联而成。
步骤2.精密组织芯片建模:将得到的精密组织芯片分别置于低粘附细胞培养板中,优选48孔板以进行后期高通量检测,然后在培养板内加入本发明培养基,使得培养基液面高度充分浸没组织芯片。所述培养基包括以下终浓度组成:1.5mg/mL的OsrHSA ;200ng/mL的Noggin;20ng/mL的R-spondin 1;300ng/mL的Wnt3a;10ng/mL的wnt7a;500nM的A-83-01-HCl;100nM的PD 169316-HCl;5μM的Ripasudil(K-115)hydrochloride dihydrate;100U/mL的青霉素;0.1mg/mL的链霉素,溶剂为DMEM/F12培养基。
步骤3.将人结直肠癌精密组织芯片置于恒温培养箱在37℃,5%CO2浓度下培养。每隔2天更换一次培养基,培养4天后进行鉴定与活性检测实验。
实施例4
本实施例提供一种制备人卵巢癌高精密组织芯片的方法,包括以下步骤:
步骤1.制备精密组织芯片:取新鲜的手术废弃人卵巢肿瘤组织用预冷的本发明凝胶进行包埋,放置37℃培养箱,凝固后根据组织大小进行修剪为300μm的精密组织芯片。所述凝胶为浓度4mg/mL的人源I型胶原溶液与质量百分比为0.25%的1,4-丁二醇缩水甘油醚溶液交联而成。
步骤2.精密组织芯片建模:将得到的精密组织芯片分别置于低粘附细胞培养板中,优选48孔板以进行后期高通量检测,然后在培养板内加入本发明培养基,使得培养基液面高度充分浸没组织芯片。所述培养基包括以下终浓度组成:10mg/mL的OsrHSA;500ng/mL的Noggin;500ng/mL的R-spondin 1;20ng/mL的Wnt3a;5ng/mL的wnt7a;1000nM的A-83-01-HCl;1000nM的PD 169316-HCl;100μM的Ripasudil(K-115)hydrochloride dihydrate;100U/mL的青霉素;0.1mg/mL的链霉素,溶剂为DMEM/F12培养基。
步骤3.将人卵巢癌精密组织芯片置于恒温培养箱在37℃,5%CO2浓度下培养。每隔2天更换一次培养基,培养4天后进行鉴定与活性检测实验。
实施例5
本实施例对实施例1获得的小鼠小肠高精密组织芯片进行形态鉴定与活性检测,具体如下:
1)芯片固定:将步骤2得到的组织芯片投入预先配好的固定液中(4%的甲醛固定)固定2小时。完成固定后弃去福尔马林固定液;
2)梯度脱水:将固定后的组织芯片依次浸入85%酒精、95%酒精和100%酒精各30分钟;
3)透明浸蜡:加入二甲苯没过类器官处理20分钟,重复两次;然后加入石蜡,在60℃浸蜡1.5小时;
4)包埋切片:用包埋模具包组织芯片,然后切片机切成4-6μm的切片贴于防脱载玻片;
5)烤片:将载玻片放置在玻片架上,放入烘箱中,65℃,30分钟,将载玻片上的水分烤干、石蜡烤融即可;
6)脱蜡:使用二甲苯脱蜡三次,每次10分钟;然后用100%酒精浸洗三次,每次1分钟;最后用流水浸洗1分钟;
7)形态学和免疫组织化学分析:形态学分析用H&E(Hematoxylin and eosin)进行染色,采用Ki-67免疫组化法进行增殖活性分析;
8)在普通光学显微镜下观察组织形态结构,如图1所示,表明所获得的小鼠小肠高精密组织芯片具有良好的组织形态,使用Image J定量计算细胞活性,结果如表1所示,表明小鼠小肠高精密组织芯片能够保持良好的细胞增殖活性。
实施例6
本实施例对实施例2获得的小鼠肺高精密组织芯片进行形态鉴定与活性检测,具体操作参照实施例5,如图2所示,表明所获得的小鼠肺高精密组织芯片具有良好的组织形态。使用Image J定量计算细胞活性,结果如表1所示,表明小鼠肺高精密组织芯片能够保持良好的细胞增殖活性。
实施例7
本实施例对实施例3获得的人结直肠癌高精密组织芯片进行形态鉴定,具体操作参照实施例5,如图3所示,表明所获得的人结直肠癌高精密组织芯片具有良好的组织形态。使用Image J定量计算细胞活性,结果如表1所示,表明人结直肠癌高精密组织芯片能够保持良好的细胞增殖活性。
实施例8
本实施例对实施例4获得的人卵巢癌高精密组织芯片进行形态鉴定及免疫评价验证,具体操作参照实施例5,如图4所示,表明所获得的人卵巢癌高精密组织芯片具有良好的组织形态。使用Image J定量计算细胞活性,结果如表1所示,表明人卵巢癌高精密组织芯片能够保持良好的细胞增殖活性。
表1实施例5-8中不同高精密组织芯片增殖活性
对比例1
本对比例为传统肿瘤组织切片制备及培养方法,以人结直肠癌为例,包括以下步骤:
步骤1:病人样品置于直径10cm细胞培养皿中进行修块,所述的培养皿中含有Hank's平衡盐溶液,所述的溶液中还添加有青霉素和链霉素,在所述的溶液中,所述的青霉素的浓度为100U/mL,所述的链霉素的浓度为100U/mL。将肿瘤组织周围的结缔组织、坏死组织去掉。用震动切片机将肿瘤组织切成200-300μm的人结直肠癌肿瘤组织切片。
步骤2:单个肿瘤组织切片用直径30mm,厚度0.4μm插入式细胞培养皿在6孔细胞培养板中进行培养。切片培养所使用的培养基的基础成份为含0.58mg/mL L-谷氨酰胺、4.5mg/mL葡萄糖和0.11mg/mL丙酮酸钠的DMEM高糖培养液,在所述的培养液中还含有如下的组份,各组份的浓度为:人血清0.02-2%(质量百分比);胎牛血清5-15%(质量百分比);青链霉素10-300U/mL;谷氨酰胺0.01-300mM;2巯基乙醇1-200μM;甘氨酸0.1-1mM;L-丙氨酸0.1-1mM;L-天门冬酰胺0.1-1mM;L-天门冬氨酸0.1-1mM;L-谷氨酸0.1-1mM;L-脯氨酸0.1-1mM;L-丝氨酸0.1-1mM;丙酮酸钠0.05-50mM;重组人白介素2 1-200ng/mL;胰岛素0.01-0.05mg/mL;转铁蛋白5.5-27.5μg/mL;亚硒酸钠0.67-3.35μg/mL;重组人巨噬细胞集落刺激因子0.001-0.08ng/mL;培养在含体积百分比为5%CO2的37℃培养箱中进行,培养3-7天,每2~3天换一次培养基。实时采用流式细胞仪检测CTL细胞(CD3+、CD8+)占比。
对比例2
本对比例为公开的肿瘤类器官免疫共培养方法,以人结直肠癌为例,包括以下步骤:
本对比例所使用的第一培养基为加入10%体积FBS、2mM超谷氨酰胺I、10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、20%Rspondin1、10μM的Y-27632、不含维生素A的B27补充剂、1.25mM乙酰半胱氨酸、10mM烟酰胺、50ng/mL EGF、500nM A83-01、3μM SB202190后的RPMI 1640培养基。
步骤1.刺激后的单核细胞的制备:取患者新鲜抽取的外周血,于800g/分钟离心10分钟,取上层血浆灭活后离心后吸取上清,转移至离心管中备用。向血液下层沉淀中加入生理盐水,形成生理盐水血样混合液。取等体积的淋巴细胞分离液于新的离心管中,将上述生理盐水血样混合液缓慢加入至淋巴分离液上层,于18-20℃条件下800g/分钟离心20分钟,取中间的白膜层置新的离心管中,随即加入三倍体积的PBS溶液清洗两遍后,获得单核细胞。将所述单核细胞与终浓度为5μg/mL的CD28抗体和150U/mL的所述IL-2接触12小时,得到刺激后的单核细胞。
步骤2.肿瘤细胞的分离:取患者手术切除的新鲜人结直肠癌肿瘤组织样本,将其转移至100mm2的无菌培养皿中,使用灭菌器械将其置于PBS溶液中漂洗3次。向培养皿中加入适量的1.5mg/mL的II型胶原酶,并使用无菌器械将其切成小块,置于37℃恒温培养箱中进行酶解1h。吸取酶解后溶液经100μm细胞筛过滤至新的离心管中,4℃条件下300g离心3分钟,去除上清,取下层沉淀物。
步骤3.肿瘤类器官前体的培养与传代:在低温条件下,将分离得到的肿瘤细胞加入第一培养基中,将其制成终浓度为2×105肿瘤细胞/mL的单细胞悬液。将单细胞悬液与温敏水凝胶等体积混合得到第一混合物,随后将第一混合物小心的沿边缘轻轻的加入6孔细胞培养板中的培养孔中于37℃,5%二氧化碳培养箱培养。观察培养箱中的第一混合物的生长状态,当第一混合物长至70%~80%孔径时,吸出培养液,使用PBS清洗两遍,随后加入TrypLETM Express解离,使其分解为单细胞后重新铺于细胞培养板中继续培养,得到人结直肠癌肿瘤类器官前体。
步骤4.肿瘤免疫微环境的肿瘤类器官的构建:
(1)将所述肿瘤类器官前体与终浓度200ng/mL的IFNγ接触12小时,使用TrypLETMExpress解离为刺激后的肿瘤细胞,并重悬于RPMI1640完全培养基中。
(2)离心收集刺激后的肿瘤细胞,去除上清,将刺激后的肿瘤细胞与所述刺激后的单核细胞以1:5的配比方式进行混合得到第二混合物,加入20μg/mL的PD-1抗体刺激第二混合物,将刺激后的第二混合物与第一培养基制成终浓度为2×106个/ml的单细胞悬液,然后与温敏水凝胶等体积混合,取2mL混合液小心的沿边缘轻轻的加入细胞培养板,置于摇床上以60rpm的转速匀速摇晃,于37℃,5%二氧化碳培养箱中恒温培养。其中,细胞培养板是提前用5μg/mL的CD28抗体将U型底平板包被,在4℃下放置12小时的细胞培养板,使用时用PBS溶液将CD28抗体包被的细胞培养板洗涤两次。
(3)在培养过程中,将培养皿于37℃,5%二氧化碳培养箱中静置30分钟,吸除每孔中原培养液上清1mL,另取终浓度为150U/mL的IL-2、终浓度为20μg/mL的PD-1抗体和第一培养基加入原培养液上清中培养,每3天换液1次。实时采用流式细胞仪检测CTL细胞(CD3+、CD8+)占比。
测试例1
分别进行实施例3、对比例1和对比例2操作实验重复5次,将构建成功的模型换液后,加入20μg/mL的PD-1抗体,实时采用流式细胞仪检测CTL细胞(CD3+、CD8+)占比。通过流式细胞仪检测人结直肠癌高精密组织芯片、传统人结直肠癌组织切片及人结直肠癌类器官免疫共培养模型中,不同时间点CD3+CD8+的比例并计算平均值,同时计算重复操作中各指标的变异系数(coefficient of variation,CV值,标准偏差与平均值之比),结果如表2所示。
表2不同时间点模型中CD3+CD8+比例
表2的数据表明实施例3获得的肿瘤高精密组织芯片在孵育过程中CD3+CD8+的比例平均值明显高于对比例1和2,且各指标的变异系数明显降低,实施例3的肿瘤高精密组织芯片可以很好地用于体外的免疫检查抑制剂的评价。
测试例2
检测肿瘤组织芯片活性:分别在实施例3得到的人结直肠癌高精密组织芯片、对比例1得到的传统人结直肠癌组织切片及对比例2中得到的人结直肠癌类器官免疫共培养模型中加入40μg/mL的PD-1抗体,孵育72小时移除培养基,用HBSS清洗2次,加入100μLHoechst 33342dye(1:2000)、EpCam-FITC(1:20)、PI(1:1000),充分混匀后放置37℃培养箱中孵育30分钟。移除染色试剂后,加入预热HBSS,孵育5分钟,移除HBSS。重复2-3次。将染色的肿瘤组织芯片使用BioTek Cytation 5全自动细胞成像系统进行层扫拍照,分析计算肿瘤细胞活性。重复5次实验得到CV值,结果见表3所示。
表3不同模型中肿瘤细胞杀伤效力
表3的数据表明,在考察用实施例3、对比例1、对比例2的人结直肠癌高精密组织芯片的免疫响应时,实施例3的肿瘤细胞凋亡率平均值显著高于对比例。
综上所述,本发明的高精密组织芯片是利用高精度组织切片机制备精确厚度的活组织芯片,然后进行无血清体外培养的一种组织操控建模技术,其中可将肿瘤高精度组织芯片用于个人化患者的免疫治疗评价,其技术特点如下:
①相对于组织块体外培养,精密组织切片厚度精确,组间差异小,保证实验的可重复性;
②解决了传统的组织切片培养体系存在的细胞生长缓慢、成功率低、实验稳定性差等弊端;
③使用无血清培养体系,组分组成更简单,节约成本的同时降低异源血清使用存在的外源病毒污染和致病因子感染风险;
④能够保持几乎正常的细胞之间的连接,维持组织正常的生理功能和结构的特异性,体现肿瘤的异质性;
⑤用于个体化肿瘤免疫评价时,与肿瘤细胞或肿瘤类器官的免疫共培养法相比,操作简单,能更好的保留体内实体瘤组织免疫微环境。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种高精密组织芯片的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
步骤一,将组织块用预冷凝胶进行包埋,凝固后根据组织大小进行修剪;
步骤二,在修剪后的组织芯片中加入培养基,于37℃、5%CO2浓度下培养2~7天,培养过程中每隔2-3天更换一次培养基。
2.根据权利要求1所述的一种高精密组织芯片的制备方法,其特征在于:所述凝胶为浓度2~8mg/mL的人源I型胶原溶液与质量百分比为0.1~0.5%的1,4-丁二醇缩水甘油醚溶液交联而成。
3.根据权利要求1或2所述的一种高精密组织芯片的制备方法,其特征在于:所述凝胶为浓度4mg/mL的人源I型胶原溶液与质量百分比为0.25%的1,4-丁二醇缩水甘油醚溶液交联而成。
4.根据权利要求1所述的一种高精密组织芯片的制备方法,其特征在于:修剪后组织芯片的厚度为250-350μm。
5.根据权利要求1所述的一种高精密组织芯片的制备方法,其特征在于:所述培养基包括以下终浓度组分:20-500ng/mL的Noggin;20-500ng/mL的R-spondin 1;20-500ng/mL的Wnt3a;1-50ng/mL的wnt7a;10-2000nM的A-83-01-HCl;100-1000nM的PD 169316-HCl;1-100μM的Ripasudil(K-115)hydrochloride dihydrate;100U/mL的青霉素;0.1mg/mL的链霉素,以上成分溶于DMEM/F12培养基中。
6.根据权利要求5所述的一种高精密组织芯片的制备方法,其特征在于:所述培养基还包括:1-10mg/mL的OsrHSA。
7.一种高精密组织芯片,其特征在于:是采用权利要求1~6任意一项所述的制备方法获得。
8.权利要求1~6任意一项所述的制备方法获得的高精密组织芯片或者权利要求7所述的高精密组织芯片在免疫功能评价中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于:所述高精密组织芯片具体为肿瘤高精密组织芯片。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:所述应用包括:
(1)将肿瘤高精密组织芯片分为实验组及对照组,在实验组中加入40μg/mL的PD1抗体,对照组中加入等体积的培养基,孵育24-96小时;
(2)将实验组和对照组的培养基移除,用HBSS清洗2次,加入100uL Hoechst 33342dye(1:2000)、EpCam-FITC(1:20)、PI(1:1000),充分混匀后放置37℃培养箱中孵育20-30分钟;
(3)移除染色试剂,然后加入预热HBSS,孵育5-10分钟,移除HBSS,重复前述过程2-3次;
(4)将染色的肿瘤组织芯片进行高内涵分析设备层扫拍照,分析计算细胞活性。
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