CN117701495A - 一种干细胞无血清无饲养层培养基、制备方法及应用 - Google Patents

一种干细胞无血清无饲养层培养基、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种干细胞无血清无饲养层培养基、制备方法及应用，本发明提供了一种干细胞培养的体系，该体系包括基础培养基hPSM1和培养基添加物hPSM2，本发明还提供了一种无血清无饲养层培养基的制备方法以及由该方法制备的无血清无饲养层培养基，本发明还提供了相关的应用，包括在制备细胞培养基中的应用，在培养干细胞中的应用，并提供了体外培养干细胞的方法以及试剂盒。

Description

一种干细胞无血清无饲养层培养基、制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种干细胞无血清无饲养层培养基、制备方法及应用。
背景技术
多能干细胞(Pluripotency stem cell，PSC)是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种APSC多能细胞。维持多能干细胞多能性和自我更新并不容易，常需要多种细胞因子和化合物才能达到一定的效果。相应地，出现了多种含有这些细胞因子和化合物的培养基。传统的多能干细胞培养基往往需要引入小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为滋养层细胞和血清作为多能干细胞的营养成分，然而其批间差、动物源性、各类感染源性、成分不确定性等影响实验研究的判断和进一步深入地应用研究。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，提供以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种干细胞培养的体系，所述体系命名为hPSM，所述hPSM由基础培养基和培养基添加物组成，所述基础培养基命名为hPSM1，所述培养基添加物命名为hPSM2；
所述hPSM1包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-精氨酸·盐酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺·水、L-半胱氨酸·盐酸、L-半胱氨酸·2盐酸、L-谷氨酸、谷氨酰胺、L-组氨酸、L-羟脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、谷胱甘肽、D-生物素、D-泛酸、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醛、吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12、硫辛酸、氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、硝酸钙、磷酸氢钠、硫酸镁、酚红、硫酸亚铁、硝酸铁、硫酸铜、硫酸锌、丙酮酸钠、葡萄糖、硫酸卡那霉素、腐胺·2盐酸、对氨基苯甲酸、亚油酸、次黄嘌呤、胸腺嘧啶中的至少一种；
所述hPSM2亚硒酸钠、维生素C、肝素钠、胰岛素、转铁蛋白、FGF2-G3、TGFβ3、NRG1中的至少一种。
进一步，所述hPSM1为L-丙氨酸、L-精氨酸、L-精氨酸·盐酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺·水、L-半胱氨酸·盐酸、L-半胱氨酸·2盐酸、L-谷氨酸、谷氨酰胺、L-组氨酸、L-羟脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、谷胱甘肽、D-生物素、D-泛酸、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醛、吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12、硫辛酸、氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、硝酸钙、磷酸氢钠、硫酸镁、酚红、硫酸亚铁、硝酸铁、硫酸铜、硫酸锌、丙酮酸钠、葡萄糖、硫酸卡那霉素、腐胺·2盐酸、对氨基苯甲酸、亚油酸、次黄嘌呤、胸腺嘧啶的组合。
进一步，所述hPSM2为亚硒酸钠、维生素C、肝素钠、胰岛素、转铁蛋白、FGF2-G3、TGFβ3、NRG1的组合。
进一步，所述hPSM1包括L-丙氨酸2.225mg/L、L-精氨酸50mg/L、L-精氨酸·盐酸94.75mg/L、L-天冬氨酸8.325mg/L、L-天冬酰胺·水16.2525mg/L、L-半胱氨酸·盐酸7.88mg/L、L-半胱氨酸·2盐酸45.5725mg/L、L-谷氨酸8.675mg/L、谷氨酰胺549.65mg/L、L-组氨酸19.375mg/L、L-羟脯氨酸23.165mg/L、L-异亮氨酸5mg/L、L-亮氨酸65.935mg/L、L-赖氨酸68.225mg/L、L-蛋氨酸92.175mg/L、L-苯丙氨酸19.87mg/L、L-脯氨酸37.99mg/L、L-丝氨酸13.625mg/L、L-苏氨酸55.525mg/L、L-色氨酸9.76mg/L、L-酪氨酸42.36mg/L、L-缬氨酸54.825mg/L、谷胱甘肽0.25mg/L、D-生物素0.05185mg/L、D-泛酸2.1825mg/L、氯化胆碱6.24mg/L、叶酸2.575mg/L、肌醇16.85mg/L、烟酰胺2.25925mg/L、吡哆醛2mg/L、吡哆醇0.2655mg/L、核黄素0.2595mg/L、盐酸硫胺2.335mg/L、维生素B12 0.34125mg/L、硫辛酸0.0525mg/L、氯化钠6599.75mg/L、氯化钾355.9mg/L、氯化镁30.515mg/L、磷酸二氢钠62.5mg/L、碳酸氢钠3000mg/L、硝酸钙25mg/L、磷酸氢钠235.51mg/L、硫酸镁61.055mg/L、酚红6.56mg/L、硫酸亚铁0.2085mg/L、硝酸铁0.005mg/L、硫酸铜0.000625mg/L、硫酸锌0.216mg/L、丙酮酸钠110mg/L、葡萄糖2500mg/L、硫酸卡那霉素100mg/L、腐胺·2盐酸0.04025mg/L、对氨基苯甲酸0.25mg/L、亚油酸0.021mg/L、次黄嘌呤1.02mg/L、胸腺嘧啶0.1825mg/L中的至少一种。
进一步，所述hPSM2包括亚硒酸钠14μg/L、维生素C 64mg/L、肝素钠100μg/L、胰岛素19.4mg/L、转铁蛋白10.7mg/L、FGF2-G 340μg/L、TGFβ3 0.1μg/L、NRG1 0.1μg/L中的至少一种。
进一步，所述hPSM1为L-丙氨酸2.225mg/L、L-精氨酸50mg/L、L-精氨酸·盐酸94.75mg/L、L-天冬氨酸8.325mg/L、L-天冬酰胺·水16.2525mg/L、L-半胱氨酸·盐酸7.88mg/L、L-半胱氨酸·2盐酸45.5725mg/L、L-谷氨酸8.675mg/L、谷氨酰胺549.65mg/L、L-组氨酸19.375mg/L、L-羟脯氨酸23.165mg/L、L-异亮氨酸5mg/L、L-亮氨酸65.935mg/L、L-赖氨酸68.225mg/L、L-蛋氨酸92.175mg/L、L-苯丙氨酸19.87mg/L、L-脯氨酸37.99mg/L、L-丝氨酸13.625mg/L、L-苏氨酸55.525mg/L、L-色氨酸9.76mg/L、L-酪氨酸42.36mg/L、L-缬氨酸54.825mg/L、谷胱甘肽0.25mg/L、D-生物素0.05185mg/L、D-泛酸2.1825mg/L、氯化胆碱6.24mg/L、叶酸2.575mg/L、肌醇16.85mg/L、烟酰胺2.25925mg/L、吡哆醛2mg/L、吡哆醇0.2655mg/L、核黄素0.2595mg/L、盐酸硫胺2.335mg/L、维生素B12 0.34125mg/L、硫辛酸0.0525mg/L、氯化钠6599.75mg/L、氯化钾355.9mg/L、氯化镁30.515mg/L、磷酸二氢钠62.5mg/L、碳酸氢钠3000mg/L、硝酸钙25mg/L、磷酸氢钠235.51mg/L、硫酸镁61.055mg/L、酚红6.56mg/L、硫酸亚铁0.2085mg/L、硝酸铁0.005mg/L、硫酸铜0.000625mg/L、硫酸锌0.216mg/L、丙酮酸钠110mg/L、葡萄糖2500mg/L、硫酸卡那霉素100mg/L、腐胺·2盐酸0.04025mg/L、对氨基苯甲酸0.25mg/L、亚油酸0.021mg/L、次黄嘌呤1.02mg/L、胸腺嘧啶0.1825mg/L的组合。
进一步，所述hPSM2为亚硒酸钠14μg/L、维生素C 64mg/L、肝素钠100μg/L、胰岛素19.4mg/L、转铁蛋白10.7mg/L、FGF2-G 340μg/L、TGFβ3 0.1μg/L、NRG10.1μg/L的组合。
进一步，所述干细胞包括多能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞。
进一步，所述多能干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞、间充质干细胞。
在一些具体的实施方案中，所述hPSM1基础培养基包括硫辛酸、谷胱甘肽、对氨基苯甲酸。在一些更加具体的实施方案中，所述hPSM1中生物素、吡哆醇、酪氨酸和磷酸盐的浓度进行了特别的调整。在一些具体的实施方案中，为了防止细胞增殖过快导致的酸中毒，增加了碳酸氢钠的含量。
在一些实施方案中，所述hPSM2中组分简单明确，不含有异源蛋白质。在某些具体的实施方案中，所述hPSM2中包括亚硒酸钠、维生素C、肝素钠、胰岛素、转铁蛋白、成纤维细胞生长因子(FGF2-G3)、转化生长因子β3(TGFβ3)、神经调节蛋白1(NRG1)。在一些具体的实施方案中，为了克服多次传代后多能干细胞会出现的发散性分化的情况，引入TGFβ3，从而达到长期培养并稳定多能干细胞的目的。在一些具体的实施方案中，所述hPSM2中添加FGF2-G3，用于克服培养基中成纤维细胞生长因子热不稳定的情况。
本发明第二方面提供了一种无血清无饲养层培养基的制备方法，所述制备方法包括将前面所述的hPSM2添加到已溶解于水的前面所述的hPSM1中，混匀后调整pH值与渗透压，最后灭菌获得最终产物。
进一步，所述混匀温度为25℃。
进一步，所述pH值包括7.1-7.5。
在一些实施方案中，所述pH值为7.1、7.12、7.14、7.16、7.18、7.2、7.22、7.24、7.26、7.28、7.3、7.32、7.34、7.36、7.38、7.4、7.42、7.44、7.46、7.48、7.5。
进一步，所述pH值为7.4。
进一步，所述渗透压包括290mOSM/kg～340mOSM/kg。
在一些实施方案中，所述渗透压的范围包括290mOSM/kg、292mOSM/kg、294mOSM/kg、296mOSM/kg、298mOSM/kg、300mOSM/kg、302mOSM/kg、304mOSM/kg、306mOSM/kg、308mOSM/kg、310mOSM/kg、312mOSM/kg、314mOSM/kg、316mOSM/kg、318mOSM/kg、320mOSM/kg、322mOSM/kg、324mOSM/kg、326mOSM/kg、328mOSM/kg、330mOSM/kg、332mOSM/kg、334mOSM/kg、336mOSM/kg、338mOSM/kg、340mOSM/kg。
进一步，所述渗透压为340mOSM/kg。
进一步，所述灭菌为滤膜过滤灭菌。
进一步，所述滤膜过滤灭菌包括通过0.22μm直径微孔的滤膜过滤灭菌。
进一步，所述水包括去离子水或超纯水。
本发明第三方面提供了一种由前面所述的制备方法制备出的无血清无饲养层培养基。
本发明第四方面提供了前面所述的体系、前面所述的制备方法在制备细胞培养基中的应用。
进一步，所述细胞包括多能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞。
进一步，所述多能干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞、间充质干细胞。
本发明第五方面提供了前面所述的体系、前面所述的制备方法、前面所述的无血清无饲养层培养基在培养干细胞中的应用。
进一步，所述干细胞包括多能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞。
进一步，所述多能干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞、间充质干细胞。
本发明第六方面提供了一种体外培养干细胞的方法，所述方法包括使用前面所述的无血清培养基培养干细胞的步骤。
进一步，所述干细胞包括多能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞。
进一步，所述多能干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞、间充质干细胞。
本发明第七方面提供了一种培养干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括前面所述的体系，配制说明书。
进一步，所述配制说明书中包括前面所述的制备方法。
进一步，所述干细胞包括多能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞。
进一步，所述多能干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞、间充质干细胞。
本发明第八方面提供了前面所述的体系、前面所述的制备方法在制备自动化生产无血清无饲养层的系统或装置中的应用。
进一步，所述系统或装置包括一个或多个储存器，一个或多个处理器。
进一步，所述系统或装置由储存在储存器中的计算机程序控制操作。
进一步，所述处理器用于处理计算机程序提供的操作程序。
本发明的有益效果：
本发明的培养基体系成份明确，无血清、无异源蛋白，适合培养产品的临床转化。且培养的细胞代次多，增殖能力强，状态好符合临床转化的基本要求。
附图说明
图1是各组多能干细胞状态图；
图2是各组细胞多能基因的表达量图。
具体实施方式
以下描述和实例详细阐述了本公开内容的实施方案。应当理解，本公开内容不限于本文所述的特定实施方案，因此可以有所变化。本领域技术人员将意识到，本公开内容存在许多变化和修改，这些变化和修改均包含在本发明的范围内。
所有术语旨在被理解为本领域技术人员将理解的。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
以下定义是对本领域定义的补充，并且针对于本申请，并且不应归于任何相关或不相关的情况，例如，不应归于任何共同拥有的专利或申请。本文描述了优选的材料和方法，但是任何与本文描述的那些相似或等价的方法和材料也可用于实践以测试本公开内容。因此，本文所用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而并非旨在限制。
定义
在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用表示“和/或”。本文所使用的术语“和/或”和“其任何组合”及其语法等同形式可互换使用。这些术语可表示任何组合都是特别考虑的。仅出于说明性目的，以下短语“A、B和/或C”或“A、B、C或其任何组合”可表示“单独的A；单独的B；单独的C；A和B；B和C；A和C；以及A、B和C”。术语“或”可结合使用或分别使用，除非上下文明确地指示分别使用。
说明书中提及的“一些实施方案”、“实施方案”、“一种实施方案”或“其他实施方案”是指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本公开内容的至少一些实施方案中，但不一定包含在所有实施方案中。
如在本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”都是包含性或开放性的，并且不排除其他未提及的要素或方法步骤。设想的是本说明书中讨论的任何实施方案可以对于本公开内容的任何方法或组合物实施，反之亦然。此外，本公开内容的组合物可用于实现本公开内容的方法。
术语“约”或“近似”意指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于如何测量或确定该值，例如，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以意指在1个标准差内或者大于1个标准差。可选地，“约”可以意指给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。在另一实例中，量“约10”包括10和从9到11的任何量。在又一实例中，关于参考数值的术语“约”还可包括该数值加减10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的值的范围。可选地，特别是对于生物系统或过程而言，该术语“约”可以意指在值的一个数量级以内，优选在值的5倍以内，并且更优选在值的2倍以内。在本申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应当假定术语“约”意指在该特定值的可接受误差范围内。
如本文所用，术语“干细胞”可以指能够增殖并产生更多的具有产生大量母细胞的能力的祖细胞的未分化的细胞，这些母细胞继而可以产生分化的或可分化的子细胞。子细胞本身可以被诱导增殖并产生子代，该子代随后分化为一种或更多种成熟细胞类型，同时还保留一种或更多种具有亲本发育潜力的细胞。术语“干细胞”可以指祖细胞的子集，其在特定情况下具有分化为特化或分化程度更高的表型的能力或潜力，并且在某些情况下保留增殖但基本不分化的能力。在一种实施方案中，术语干细胞通常是指天然存在的母细胞，其后代(子代)通常在不同的方向上通过分化(例如，通过获得完全独立的特征)而进行特化，这发生在胚胎细胞和组织的逐步多样化中。细胞分化是通常通过许多细胞分裂而发生的复杂过程。分化的细胞可以衍生自专能细胞，该专能细胞本身也衍生自专能细胞，等等。虽然这些专能细胞中的每一种都可以被认为是干细胞，但是每种细胞所能产生的细胞类型的范围可能相差很大。一些分化的细胞也具有产生具有更大发育潜力的细胞的能力。这样的能力可以是天然的，也可以在用各种因素处理时由人工诱导。在许多生物学情况下，干细胞也是“专能的”，因为它们可以产生不止一种不同细胞类型的子代，但这不是“干性”所必需的。自我更新是干细胞定义的另一个经典部分，在本文中的使用是必不可少的。从理论上讲，自我更新可以通过两种主要机制之一发生。干细胞可以不对称分裂，一个子代保持干细胞状态，另一个子代表现出一些不同的其他特定功能和表型。可选地，群体中的一些干细胞可以对称地分为两个干细胞，从而整体上维持群体中的一些干细胞，而群体中的其他细胞仅产生分化的子代。从形式上讲，开始于干细胞的细胞可能会走向分化的表型，但是然后“逆转”并重新表现干细胞表型，这在术语上通常被本领域普通技术人员称为“去分化”或“重编程”或“反分化”。如本文所用，术语“多能干细胞”包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞，等等。
术语“培养基”在本领域是公认的，并且通常是指被用于培养活细胞的任何物质或制剂。如关于细胞培养所用的术语“培养基”，包括所述细胞周围环境的组分。培养基可以为固体、液体、气体或者相和物质的混合物。培养基包括液体生长培养基以及不维持细胞生长的液体培养基。培养基还包括凝胶状培养基，如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原基质。示例性的气体培养基包括在有盖培养皿或者其他固体或半固体支持体上生长的细胞所被暴露于其中的气相。术语“培养基”还指打算被用于细胞培养的物质，即使其还未与细胞接触。换言之，制备的用于细菌培养的富含营养物的液体即为培养基。
术语“多能干细胞”指这样的干细胞，其具有分化成三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)中的任意一种的潜能。多能干细胞可产生任何胎儿或成体细胞类型。然而，多能细胞的单个细胞或聚集体不能发育成胎儿或成体动物，这是因为它们缺乏组织成胚胎的潜能。
术语“寡能干细胞”指这样的干细胞，其仅可分化成几种细胞，例如淋巴或髓干细胞。
术语“胚胎干细胞”指这样的多能干细胞，其来源于囊胚期或较早桑椹胚期胚胎的内细胞团的外胚层组织。人胚胎在受精后4至5天到达囊胚期，在这个时候它们由50至150个细胞组成。
如本文所用，术语“饲养层”是指共培养中使用的维持多能干细胞的细胞。对于人胚胎干细胞培养，典型的饲养层包括小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)或人胚胎成纤维细胞，其已经过处理，以防止它们在培养中分裂。
本文所用术语“渗透压”、“同渗容摩”指每升溶液中含有的溶解物质(溶质)的浓度(渗透压摩尔，Osm)，其形成溶液的渗透压。
术语“自动化”是指没有人工干预的情况下进行的化学合成。
术语“处理器”或“处理电路”通常可单独指代前述逻辑电路中的任一者或者可指代其与其他逻辑电路或任何其他等效电路的组合。
术语“存储器”是指任何类型的长期、短期、易失性、非易失性或其它存储器，并且不限于任何特定类型的存储器或特定数量的存储器，或其上存储有存储器的介质的类型。
存储在存储器内的数据不能简单地被删除或覆写以便释放存储器内的位置用于新写入。存储器中的一些数据可以是静态数据。静态数据是不经常访问的数据，并且它或者不会随着时间的推移而改变，或者不会像动态数据那样频繁地改变。静态数据也被称为持久数据。(应当注意的是，静态数据或持久数据与存储在诸如硬盘或非易失性存储之类的“持久”类型的存储中的数据不同。静态/持久数据可以位于任何地方，诸如高速缓存、RAM或主存储器中，而并不排他地限于持久类型的存储中)。静态数据可以被认为是动态数据的反面，动态数据是可以频繁改变的数据。一种类型的静态数据是只读数据。另一种类型的静态数据是很少读取的数据。
实施例1
1、实验材料
L-丙氨酸(阿拉丁，A118860-25g)、L-精氨酸(Pfanstiehl，A-170)、L-精氨酸·盐酸(阿拉丁，A103485-500g)、L-天冬氨酸(sigma，1001291000)、L-天冬酰胺·水(sigma，A8381-100G)、L-半胱氨酸·盐酸(sigma，C7477-25G)、L-半胱氨酸·2盐酸(阿拉丁，L133106-25g)、L-谷氨酸(sigma，G1251-100G)、谷氨酰胺(LONZA，17-605E)、L-组氨酸(sigma，H6034-100G)、L-羟脯氨酸(sigma，PHR1939-500MG)、L-异亮氨酸(Sigma，I2752-1G)、L-亮氨酸(Sigma，4330-100GM)、L-赖氨酸(Sigma，P1399-25MG)、L-蛋氨酸(Sigma，M9625-5G)、L-苯丙氨酸(Sigma，78019-25G)、L-脯氨酸(Sigma，P0380-10MG)、L-丝氨酸(Sigma，S4500-1G)、L-苏氨酸(Sigma，T8625-1G)、L-色氨酸(Sigma，T0254-1G)、L-酪氨酸(Sigma，T3754-50G)、L-缬氨酸(Sigma，V0500-1G)、谷胱甘肽(Sigma，G4251-5G)、D-生物素(Sigma，8512090001)、D-泛酸(阿拉丁，D431996-100g)、氯化胆碱(Sigma，C7017-10MG)、叶酸(Sigma，F8758)、肌醇(Sigma，I7508-50G)、烟酰胺(Sigma，72340-100G)、吡哆醛(Sigma，P9130-500MG)、吡哆醇(Sigma，P9755-25G)、核黄素(Sigma，R4500-5G)、盐酸硫胺(Sigma，1656002-500MG)、维生素B12(Sigma，PHR1234-1G)、硫辛酸(Sigma，Y0000546)、氯化钠(国药，LHN-500g)、氯化钾(国药，10016308)、氯化镁(西安晋湘，MgCl2)、磷酸二氢钠(国药，LSEQN-WS-500g)、碳酸氢钠(金山制药，TANSUANQINGNA)、硝酸钙(Sigma，202967-10G)、磷酸氢钠(Sigma，S9763-100G)、硫酸镁(国药，20025118)、酚红(sigma，P3532-5G)、硫酸亚铁(Sigma，1270355-2X1G)、硝酸铁(Sigma，254223-10G)、硫酸铜(Sigma，C1297-100G)、硫酸锌(SIGMA，Z0251-100G)、丙酮酸钠(SIGMA，P5280-25G)、葡萄糖(生工，A501991-0500)、硫酸卡那霉素(索莱宝，K8020-25g)、腐胺·2盐酸(Sigma，P7505)、对氨基苯甲酸(阿拉丁，A108862-25g)、亚油酸(阿拉丁，L100441-1g)、次黄嘌呤(阿拉丁，H433326-1g)、胸腺嘧啶(阿拉丁，T108392-5g)、亚硒酸钠(SIGMA，214485-5G)、维生素C(阿拉丁，A103539-25g)、肝素钠(万邦医药，GSNZSY)、胰岛素(万邦医疗，YIDAOSUZHUSHEYE)、转铁蛋白(SIGMA，T0665-100mg)、FGF2-G3(同立海源，JDS-1691M)、TGFβ3(同立海源，GMP-TL646)、NRG1(biolegend，765104)、多能干细胞(赛贝生物，CA4025106)。
2、实验分组
1)实验例
使用多能干细胞基础培养基hPSM1(见表1)和多能干细胞添加物hPSM2(见表2)。在25℃下，均匀混合得到混合物M1；将氢氧化钠或者盐酸加入至上述混合物M1中以将pH调至7.4，再加入氯化钠调节渗透压至340mOsm/kg，制得混合物M2；将上述混合物M2通过具有0.22μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得多能干细胞培养基hPSM。配好的培养基4℃保存。
2)对比例1
使用DMEM/F12基础培养基和多能干细胞添加物hPSM2。在25℃下，均匀混合得到混合物M1；将氢氧化钠或者盐酸加入至上述混合物M1中以将pH调至7.4，再加入氯化钠调节渗透压至340mOsm/kg，制得混合物M2；将上述混合物M2通过具有0.22μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得多能干细胞基础培养基。配好的培养基4℃保存。
3)对比例2
使用北京赛贝生物技术有限公司生产的多能干细胞培养基PMG1培养基设为对照组。
表1多能干细胞基础培养基hPSM1
组分 浓度mg/L 组分 浓度mg/L 组分 浓度mg/L
L-丙氨酸 2.225 L-色氨酸 9.76 磷酸二氢钠 62.5
L-精氨酸 50 L-酪氨酸 42.36 碳酸氢钠 3000
L-精氨酸·盐酸 94.75 L-缬氨酸 54.825 硝酸钙 25
L-天冬氨酸 8.325 谷胱甘肽 0.25 磷酸氢钠 235.51
L-天冬酰胺·水 16.2525 D-生物素 0.05185 硫酸镁 61.055
L-半胱氨酸·盐酸 7.88 D-泛酸 2.1825 酚红 6.56
L-半胱氨酸·2盐酸 45.5725 氯化胆碱 6.24 硫酸亚铁 0.2085
L-谷氨酸 8.675 叶酸 2.575 硝酸铁 0.005
谷氨酰胺 549.65 肌醇 16.85 硫酸铜 0.000625
L-组氨酸 19.375 烟酰胺 2.25925 硫酸锌 0.216
L-羟脯氨酸 23.165 吡哆醛 2 丙酮酸钠 110
L-异亮氨酸 5 吡哆醇 0.2655 葡萄糖 2500
L-亮氨酸 65.935 核黄素(B2) 0.2595 硫酸卡那霉素 100
L-赖氨酸 68.225 盐酸硫胺(B1) 2.335 腐胺·2盐酸 0.04025
L-蛋氨酸 92.175 维生素B12 0.34125 对氨基苯甲酸 0.25
L-苯丙氨酸 19.87 硫辛酸 0.0525 亚油酸 0.021
L-脯氨酸 37.99 氯化钠 6599.75 次黄嘌呤 1.02
L-丝氨酸 13.625 氯化钾 355.9 胸腺嘧啶 0.1825
L-苏氨酸 55.525 氯化镁 30.515
表2多能干细胞培养基添加物hPSM2
名称 浓度
亚硒酸钠 14μg/L
维生素C 64mg/L
肝素钠 100μg/L
胰岛素 19.4mg/L
转铁蛋白 10.7mg/L
FGF2-G3 40μg/L
TGFβ3 0.1μg/L
NRG1 0.1μg/L
3、实验方法
1)多能干细胞形态观察
将第29代iPSc按照4×104cell/cm2的密度接种于Matrigel包被好的6孔板中，分别加入上述各组培养基进行培养，第2天开始每天换液，培养至第5天，倒置显微镜下观察各组iPSc形态和采集图像。
2)多能干细胞细胞增殖活性检测
将第29代iPSc按照4×104cell/cm2的密度接种于Matrigel包被好的6孔板中，分别加入上述各组培养基进行培养，第2天开始每天换液，培养至第4天，收集各组细胞计算细胞扩增倍数(计算公式为：第4天收集细胞数/初始种板数)及细胞活率(计算公式为：(活细胞数/总细胞数)×100％)。
3)细胞多能性基因检测
将第29代iPSc按照4×104cell/cm2的密度接种于Matrigel包被好的6孔板中，分别加入上述各组培养基进行培养，第2天开始每天换液，培养至第5天，分别提取各组ESCs总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用荧光定量PCR检测ESCs多能性基因Oct4、Sox2和Nanog的表达水平，qPCR引物序列见表3。
表3多能干细胞多能性基因qPCR引物序列
4、实验结果
1)多能干细胞形态观察，结果如图1所示，结果显示，各组细胞均呈典型的集落状态，细胞排列致密、核仁明显、核质比高，日常换液培养时培养基中漂浮的死细胞较少；表明本发明所涉及的无血清培养基能很好地维持胚胎干细胞的形态，保持未分化状态。
2)多能干细胞细胞增殖活性检测，结果如表4统计，结果显示，本发明的技术方案，即实验例的无血清培养基培养的第29代多能干细胞扩增倍数最高，在第4天扩增倍数达到了155.11倍，而对比例1或2的扩增倍数仅有132.54倍和120.54倍；本发明的技术方案，即实验例的无血清培养基培养的第29代多能干细胞细胞活率最高，达到了98.21％，对比例1为98.11％，对比例2为95.32％。
表4各组细胞扩增倍数及细胞活率
组别 细胞扩增倍数 细胞活率
实验例 155.11 98.21％
对比例1 132.54 98.11％
对比例2 120.54 95.32％
3)细胞多能性基因检测结果如图2所示，结果显示，在各组细胞的多能基因的表达量的检测中，实验例提供的无血清培养基培养的细胞其Oct4、Nanog、Sox2基因的表达量最高，表明实验例提供的无血清培养基能够最多的保持细胞的多能性。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种干细胞培养的体系，其特征在于，所述体系命名为hPSM，所述hPSM由基础培养基和培养基添加物组成，所述基础培养基命名为hPSM1，所述培养基添加物命名为hPSM2；
所述hPSM1包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-精氨酸·盐酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺·水、L-半胱氨酸·盐酸、L-半胱氨酸·2盐酸、L-谷氨酸、谷氨酰胺、L-组氨酸、L-羟脯氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、谷胱甘肽、D-生物素、D-泛酸、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醛、吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12、硫辛酸、氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、硝酸钙、磷酸氢钠、硫酸镁、酚红、硫酸亚铁、硝酸铁、硫酸铜、硫酸锌、丙酮酸钠、葡萄糖、硫酸卡那霉素、腐胺·2盐酸、对氨基苯甲酸、亚油酸、次黄嘌呤、胸腺嘧啶中的至少一种；
所述hPSM2包括亚硒酸钠、维生素C、肝素钠、胰岛素、转铁蛋白、FGF2-G3、TGFβ3、NRG1中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的体系，其特征在于，所述hPSM1包括L-丙氨酸2.225mg/L、L-精氨酸50mg/L、L-精氨酸·盐酸94.75mg/L、L-天冬氨酸8.325mg/L、L-天冬酰胺·水16.2525mg/L、L-半胱氨酸·盐酸7.88mg/L、L-半胱氨酸·2盐酸45.5725mg/L、L-谷氨酸8.675mg/L、谷氨酰胺549.65mg/L、L-组氨酸19.375mg/L、L-羟脯氨酸23.165mg/L、L-异亮氨酸5mg/L、L-亮氨酸65.935mg/L、L-赖氨酸68.225mg/L、L-蛋氨酸92.175mg/L、L-苯丙氨酸19.87mg/L、L-脯氨酸37.99mg/L、L-丝氨酸13.625mg/L、L-苏氨酸55.525mg/L、L-色氨酸9.76mg/L、L-酪氨酸42.36mg/L、L-缬氨酸54.825mg/L、谷胱甘肽0.25mg/L、D-生物素0.05185mg/L、D-泛酸2.1825mg/L、氯化胆碱6.24mg/L、叶酸2.575mg/L、肌醇16.85mg/L、烟酰胺2.25925mg/L、吡哆醛2mg/L、吡哆醇0.2655mg/L、核黄素0.2595mg/L、盐酸硫胺2.335mg/L、维生素B12 0.34125mg/L、硫辛酸0.0525mg/L、氯化钠6599.75mg/L、氯化钾355.9mg/L、氯化镁30.515mg/L、磷酸二氢钠62.5mg/L、碳酸氢钠3000mg/L、硝酸钙25mg/L、磷酸氢钠235.51mg/L、硫酸镁61.055mg/L、酚红6.56mg/L、硫酸亚铁0.2085mg/L、硝酸铁0.005mg/L、硫酸铜0.000625mg/L、硫酸锌0.216mg/L、丙酮酸钠110mg/L、葡萄糖2500mg/L、硫酸卡那霉素100mg/L、腐胺·2盐酸0.04025mg/L、对氨基苯甲酸0.25mg/L、亚油酸0.021mg/L、次黄嘌呤1.02mg/L、胸腺嘧啶0.1825mg/L中的至少一种；
优选地，所述hPSM2包括亚硒酸钠14μg/L、维生素C 64mg/L、肝素钠100μg/L、胰岛素19.4mg/L、转铁蛋白10.7mg/L、FGF2-G 340μg/L、TGFβ3 0.1μg/L、NRG1 0.1μg/L中的至少一种；
优选地，所述干细胞包括多能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞；
优选地，所述多能干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞、间充质干细胞。
3.一种无血清无饲养层培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将权利要求1或2所述的hPSM2添加到已溶解于水的权利要求1或2所述的hPSM1中，混匀后调整pH值与渗透压，最后灭菌获得最终产物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述混匀温度为25℃；
优选地，所述pH值包括7.1-7.5；
优选地，所述pH值为7.4；
优选地，所述渗透压包括290mOSM/kg～340mOSM/kg；
优选地，所述渗透压为340mOSM/kg；
优选地，所述灭菌为滤膜过滤灭菌；
优选地，所述滤膜过滤灭菌包括通过0.22μm直径微孔的滤膜过滤灭菌；
优选地，所述水包括去离子水或超纯水。
5.一种由权利要求3或4所述的制备方法制备出的无血清无饲养层培养基。
6.权利要求1或2所述的体系、权利要求3或4所述的制备方法在制备细胞培养基中的应用；
优选地，所述细胞包括多能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞；
优选地，所述多能干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞、间充质干细胞。
7.权利要求1或2所述的体系、权利要求3或4所述的制备方法、权利要求5所述的无血清无饲养层培养基在培养干细胞中的应用；
优选地，所述干细胞包括多能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞；
优选地，所述多能干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞、间充质干细胞。
8.一种体外培养干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求5所述的无血清培养基培养干细胞的步骤；
优选地，所述干细胞包括多能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞；
优选地，所述多能干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞、间充质干细胞。
9.一种培养干细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的体系，配制说明书；
优选地，所述配制说明书中包括权利要求3或4所述的制备方法；
优选地，所述干细胞包括多能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞；
优选地，所述多能干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞、间充质干细胞。
10.权利要求1或2所述的体系、权利要求3或4所述的制备方法在制备自动化生产无血清无饲养层的系统或装置中的应用；
优选地，所述系统或装置包括一个或多个储存器，一个或多个处理器；
优选地，所述系统或装置由储存在储存器中的计算机程序控制操作；
优选地，所述处理器用于处理计算机程序提供的操作程序。
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