CN117143808B - 一种稳定获得鱼鳍上皮样细胞的培养方法 - Google Patents
一种稳定获得鱼鳍上皮样细胞的培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种稳定获得鱼鳍上皮样细胞的培养方法。本发明提供了组合物、培养基及细胞的培养方法，通过在培养基中添加一定浓度的Y‑27632、A83‑01和CHIR99021，促进鱼鳍中类上皮细胞的生长，抑制其凋亡，从而可以稳定地获得鱼鳍类上皮样细胞系，提高鱼类鱼鳍来源的上皮样细胞系的构建效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种稳定获得鱼鳍上皮样细胞的培养方法。
背景技术
细胞系是用来体外开展生命研究的重要工具，鱼类细胞系由于生长温度范围广，培养方法简单，在许多生物学研究中要优于哺乳动物细胞系或鸟类细胞系。因此，开发鱼类细胞系对鱼类遗传学、病原微生物和环境毒性等方面的研究具有重要意义。
鱼鳍细胞具有较强的增殖能力，且取样过程简单，可多次重复取样等特点，是理想的鱼类原代细胞培养材料。鱼类细胞系建立过程中，原代细胞培养最常用的培养方法为组织块培养法和单层细胞培养法（也即酶消化法）。组织块法是将组织块剪成大小约为1 mm×1 mm×1 mm，加入适量的培养基后直接进行培养，细胞会从组织块中溢出，围绕组织块进行生长。单层细胞培养法通过消化酶对组织块进行消化处理，消化酶一般采用Dispase II酶、胶原酶I、中性蛋白酶和胰蛋白酶等处理，然后分离收集游离的细胞，加入适量培养基进行单层培养。目前用于鱼类细胞培养的基础培养基包括L-15（Leibowits L-15），MEM（Modified Eagle's Medium），DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium），DMEM/F12，PRIM-1640和M199（media 199），其中，L-15基础培养基由于富含丰富的氨基酸，不依赖于环境CO2浓度，且许多鱼类细胞能在L-15中获得更加的生长性能，备受科研工作者青睐。多数鱼类细胞系的开发以L-15为基础培养基，添加20%胎牛血清（FBS）以及其它生长因子（如EGF）来建立可持续的细胞培养物，进而建立细胞系，少数则是通过使用其它基础培养基获得鱼类细胞系。
然而，通过以上方法建立的鱼类细胞系大多数为成纤维样（Fibroblast-like）细胞系，而获得的类上皮样（Epithelial-like）细胞系则很少，且存在一定的随机性，即使在培养条件相同的情况下，多次培养不一定均能获得类上皮样细胞，多数时候以成纤维样细胞为主，不能稳定获得类上皮样细胞系，非常不利于鱼类细胞系特别是类上皮样细胞系的稳定开发和应用。因此，开展鱼类鱼鳍类上皮样细胞培养技术的探索研究，不仅能丰富鱼类细胞系种类，也能为鱼类在细胞学知识及在相关基础理论研究方面提供丰富的体外实验材料。
根据现有需要，开发一种稳定获得鱼鳍上皮样细胞的培养方法成为亟需解决的问题。
现有的鱼类细胞培养方法由于受到培养基成分特别是胎牛血清FBS的限制，在培养鱼类组织细胞时，成纤维样细胞很容易获得优先生长，而类上皮样细胞在传代的过程由于生长缓慢和大量死亡，直接导致后期建立的鱼类细胞系大多为成纤维样细胞，类上皮样细胞系很难建立，而且存在一定的随机性，即使在相同的实验条件下也不能稳定建立类上皮样细胞系。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种稳定获得鱼鳍上皮样细胞的培养方法，通过在培养基中添加一定浓度的Y-27632、A83-01和CHIR99021，促进鱼鳍中类上皮细胞的生长，抑制其凋亡，从而可以稳定的获得鱼鳍类上皮样细胞系，提高鱼类鱼鳍来源的上皮样细胞系的构建效率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了组合物，包括ROCK抑制剂、TGF-β抑制剂和GSK-3抑制剂。
在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物中，所述ROCK抑制剂、所述TGF-β抑制剂和所述GSK-3抑制剂的摩尔比为A:B:1，其中：
A选自5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40；
B选自1、2、3、4、5、6、7、8。
在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物中，所述ROCK抑制剂、所述TGF-β抑制剂和所述GSK-3抑制剂的摩尔比为10:4:1。
在本发明的一些具体实施方案中，上述组合物中：
所述ROCK抑制剂包括Y-27632或Y-27632的衍生物；和/或
所述TGF-β抑制剂包括A83-01；和/或
所述GSK-3抑制剂包括CHIR99021。
本发明还提供了上述组合物在如下方面中的应用：
（I）、培养上皮样细胞；和/或
（II）、制备上皮样细胞培养基；
所述上皮样细胞包括鱼鳍上皮样细胞；
所述鱼鳍上皮样细胞包括鱼尾鳍上皮样细胞、背鳍上皮样细胞或胸鳍上皮样细胞中的一种、两种或多种。
本发明还提供了培养基，包括基质、上述组合物，以及可接受的辅料或助剂。
在本发明的一些具体实施方案中，上述培养基中，所述基质包括L-15培养基。
在本发明的一些具体实施方案中，上述培养基中，所述ROCK抑制剂的浓度为1 μM、2 μM、5 μM、10 μM、15 μM；所述TGF-β抑制剂的浓度1 μM、2 μM、4 μM、6 μM；所述GSK-3抑制剂的浓度为0.25 μM、0.5 μM、1 μM、2 μM。
本发明还提供了上述培养基在培养上皮样细胞中的应用；
所述上皮样细胞包括鱼鳍上皮样细胞；
所述鱼鳍上皮样细胞包括鱼尾鳍上皮样细胞、背鳍上皮样细胞或胸鳍上皮样细胞中的一种、两种或多种。
本发明还提供了上皮样细胞的培养方法，其基于上述组合物或上述培养基培养；
所述上皮样细胞包括鱼鳍上皮样细胞；
所述鱼鳍上皮样细胞包括鱼尾鳍上皮样细胞、背鳍上皮样细胞或胸鳍上皮样细胞中的一种、两种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，上述培养方法包括如下步骤：
步骤（1）：采集鱼鳍组织，清洁灭菌，剪碎，获得碎组织；
步骤（2）：取步骤（1）所述碎组织接入含有上述组合物、FBS和抗生素的L-15培养基，培养4～6天，更新培养基，使所述ROCK抑制剂、所述TGF-β抑制剂和所述GSK-3抑制剂的浓度分别下降一半，培养至第12天时，更新培养基，使所述ROCK抑制剂、所述TGF-β抑制剂和所述GSK-3抑制剂含量皆为零，培养，传代；
所述鱼鳍包括鱼尾鳍、背鳍或胸鳍中的一种、两种或多种；
所述FBS在所述L-15培养基中的含量为20%；
所述抗生素包括100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素和0.50 mg/mL庆大霉素的混合溶液。
本发明的培养方法有如下效果：
（1）培养基中添加Y-27632，A83-01和CHIR99021有助于上皮样细胞系的建立，处理时间超过12天，细胞出现严重的空泡化现象（如图1所示）；处理时间在2天时，成纤维样细胞出现严重的凋亡。对未处理组和处理组细胞进行传代，未处理组以成纤维样细胞为主，且传代培养细胞存活率低，处理组以上皮样细胞为主，且细胞数量远多于未处理组（如图2所示），可见，Y-27632，A83-01和CHIR99021的处理有助于上皮样细胞系的建立。
（2）经测试，培养基中添加Y-27632浓度为5～10 μM，A83-01浓度为1～2 μM，CHIR99021浓度为0.25～1 μM，均可显著促进细胞的增殖（如图3所示）。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示Y-27632、A83-01和CHIR99021组合对细胞培养的影响；其中，“未处理”示未添加Y-27632、A83-01和CHIR99021组；“D2”、“D4”、“D8”、“D12”和“D16”分别示Y-27632、A83-01和CHIR99021组合处理培养细胞2、4、8、12和16天；
图2示Y-27632、A83-01和CHIR99021组合对原代细胞的影响；其中，“Control”为未处理组，“Cocktail”为Y-27632、A83-01和CHIR99021的组合；
图3示Y-27632、A83-01和CHIR99021浓度对原代细胞的影响；其中，A示Y-27632，B示A83-01，C示CHIR99021，统计图上小写字母不同表示具有显著性差异；
图4示本发明分解示意图；
图5示从灰刻齿雀鲷尾鳍中组织培养出来的细胞；其中，A、C、E是未加Y-27632、A83-01和CHIR99021进行培养，分别为原代培养，第一次传代和第30代，细胞形态呈现成纤维样，并且在第一次传代时类上皮细胞出现大量空泡化（箭头所示）；B、D、F是添加Y-27632、A83-01和CHIR99021进行培养，分别为原代培养，第一次传代和第25代；细胞呈现明显类上皮样形态；标尺：100 μm；
图6示从石斑鱼尾鳍中组织培养出来的细胞；其中，A、C是未加Y-27632，A83-01和CHIR99021进行培养，分别为原代培养和第三代，细胞呈现成纤维样；B、D是添加Y-27632、A83-01和CHIR99021进行培养，分别为原代培养和第三代，细胞呈现明显类上皮样形态；标尺：100 μm。
具体实施方式
本发明公开了一种稳定获得鱼鳍上皮样细胞的培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
针对目前鱼类细胞培养方法中不容易获得类上皮样细胞的特点，本发明方法以增殖活性较强的鱼鳍为材料进行组织培养，通过在L-15培养基中添加一定浓度的小分子化合物，促进鱼鳍类上皮样细胞的生长，抑制类上皮样细胞的凋亡，从而促进稳定获得鱼鳍组织类上皮样细胞系。本发明方法可以极大促进从鱼鳍组织中获得类上皮样细胞，建立类上皮样细胞系的可能性，但受鱼类种类，培养基成分的限制，不能完全保证能成功建立类上皮样细胞系；本发明只针对鱼鳍组织进行了细胞培养实验，对其它组织没有进行测试，效果尚不明确。
本发明的首要目的在于提供一种稳定获得鱼鳍上皮样细胞的培养方法。
根据本发明的实施例，该构建方法为：剪取鱼尾鳍，背鳍或胸鳍组织，通过快速无菌操作去除微生物污染，剪碎清洗后转入25 mL细胞培养瓶或6孔板中进行培养。用含有一定浓度的Y-27632、A83-01和CHIR99021的L-15培养基进行原代培养，然后传代培养直至形成稳定形态的细胞系。
据本发明的实施例，包括以下步骤：
（1）组织处理：剪取鱼尾鳍，背鳍或胸鳍组织，加入无血清L-15培养基中进行清洗3次，然后放入在75%酒精中浸泡3 s后，迅速放入含有2×抗生素的L-15基础培养基中，用1mL枪头进行吹打清洗3次，转入新的无菌离心管中，剪碎成约1 mm3大小，用含有2×抗生素的L-15基础培养基进行轻轻吹打重悬。
（2）原代培养：将碎组织块转入25 mL细胞培养瓶或6孔板中，加入L-15培养基，培养基中含有20% FBS，1×抗生素，Y-27632，A83-01和CHIR99021，放入培养箱中培养。当培养至4～6天时，更换1/2新鲜的不含Y-27632，A83-01和CHIR99021培养基，培养至12天时，完全更换新鲜的不含Y-27632，A83-01和CHIR99021培养基。
（3）传代培养：当原代培养细胞铺满培养瓶底90％以上时，去掉培养液，加入胰蛋白酶消化，待消化一段时间后加入FBS终止消化反应，离心收集消化的细胞，加入新鲜L-15培养基继续培养，这时能看到多数呈类上皮样形态的细胞能贴壁后继续生长，很少出现空泡化。当细胞铺满培养瓶底90％以上时，继续进行传代培养，直至细胞形成均一稳定的形态。
根据本发明的实施例，步骤（2）所述抗生素为青霉素-链霉素-庆大霉素混合溶液，浓度分别为100 U/mL，0.1 mg/mL，和0.50 mg/mL。
根据本发明的实施例，步骤（2）培养温度为25℃。
根据本发明的实施例，步骤（2）中培养瓶，6孔板均事前用0.5 mg/mL matrigel进行包被处理，处理时间为12～15 h。
根据本发明的实施例，步骤（2）中培养基Y-27632，A83-01和CHIR99021的浓度分别为5 μM、2 μM和0.5 μM。
根据本发明的实施例，步骤（3）所述胰蛋白酶消化温度为25℃～28℃，消化时间为不超过5 min。
根据本发明的实施例，步骤（3）所述培养基无需添加Y-27632，A83-01和CHIR99021等抑制剂。持续处理会抑制细胞增殖。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：Y-27632、A83-01和CHIR99021组合对原代细胞培养的影响
实验材料：灰刻齿雀鲷尾鳍
具体步骤：（1）剪取灰刻齿雀鲷尾鳍，加入无血清L-15培养基中进行清洗3次，然后放入在75%酒精中浸泡3 s后，迅速放入含有2×抗生素的L-15基础培养基中，用1 mL枪头进行吹打清洗3次，转入新的无菌离心管中，剪碎成约1 mm3大小，用含有2×抗生素的L-15基础培养基进行轻轻吹打重悬。（2）将碎组织块转入6孔板中，加入L-15培养基，培养基中含有20% FBS，1×抗生素，Y-27632（5 μM），A83-01（2 μM）和CHIR99021（0.5 μM），放入培养箱中25oC培养。
实验结果：如图1所示，培养基中添加Y-27632，A83-01和CHIR99021有助于上皮样细胞系的建立。处理时间在2天时，成纤维样细胞出现严重的凋亡，处理时间超过12天，上皮样细胞出现严重的凋亡。
实施例2：Y-27632、A83-01和CHIR99021组合对原代细胞培养的影响
实验材料：灰刻齿雀鲷尾鳍
具体步骤：（1）剪取灰刻齿雀鲷尾鳍，加入无血清L-15培养基中进行清洗3次，然后放入在75%酒精中浸泡3 s后，迅速放入含有2×抗生素的L-15基础培养基中，用1 mL枪头进行吹打清洗3次，转入新的无菌离心管中，剪碎成约1 mm3大小，用含有2×抗生素的L-15基础培养基进行轻轻吹打重悬。（2）将碎组织块转入6孔板中进行外植体培养，加入L-15培养基，其中含有20% FBS，1×抗生素，Y-27632（5 μM），A83-01（2 μM）和CHIR99021（0.5 μM），放入培养箱中25oC培养。（3）在第2,4和6天消化细胞，进行细胞计数。
实验结果：如图2、表1所示，对未处理组和处理组细胞进行传代，未处理组以成纤维样细胞为主，且传代培养细胞存活率低，处理组以上皮样细胞为主，且细胞数量远多于未处理组。
表1：Y-27632，A83-01和CHIR99021组合对原代细胞数量的影响
实施例3：Y-27632、A83-01和CHIR99021含量梯度对原代细胞培养的影响
实验材料：灰刻齿雀鲷尾鳍
具体步骤：（1）剪取灰刻齿雀鲷尾鳍，加入无血清L-15培养基中进行清洗3次，然后放入在75%酒精中浸泡3 s后，迅速放入含有2×抗生素的L-15基础培养基中，用1 mL枪头进行吹打清洗3次，转入新的无菌离心管中，剪碎成约1 mm3大小，用含有2×抗生素的L-15基础培养基进行轻轻吹打重悬。（2）将碎组织块转入6孔板中进行外植体培养，加入L-15培养基，其中含有20% FBS，1×抗生素；（3）Y-27632添加浓度分别为0 μM，1 μM，2 μM，5 μM，10 μM，15 μM；A83-01添加浓度分别为0 μM，1 μM，2 μM，4 μM，6 μM；CHIR99021添加浓度分别为0μM，0.25 μM，0.5 μM，1 μM，2 μM。（4）在第6天消化细胞，进行细胞计数。
实验结果：如图3、表2所示，培养基中添加Y-27632浓度为5～10 μM，A83-01浓度为1～2 μM，CHIR99021浓度为0.25～1 μM，均可显著促进细胞的增殖。
表2：Y-27632、A83-01和CHIR99021含量梯度对原代细胞培养的影响
实施例4：灰刻齿雀鲷尾鳍上皮样细胞的培养
（1）组织处理：剪取鱼尾鳍组织，加入无血清L-15培养基中进行清洗3次，然后放入在75%酒精中浸泡3 s后，迅速放入含有2×抗生素（为青霉素-链霉素-庆大霉素混合溶液，浓度分别为100 U/mL，0.1 mg/mL，和0.50 mg/mL）的L-15基础培养基中，用1 mL枪头进行吹打清洗3次，转入新的无菌离心管中，剪碎成约1 mm3大小，用含有2×抗生素的L-15基础培养基进行轻轻吹打重悬。
（2）原代培养：培养瓶事前用0.5 mg/mL matrigel进行包被处理，处理时间为12～15 h。将碎组织块转入25 mL细胞培养瓶或6孔板中，加入L-15培养基，培养基中含有20%FBS，1×抗生素，Y-27632，A83-01和CHIR99021（Y-27632、A83-01和CHIR99021的浓度分别为5 μM、2 μM和0.5 μM），放入培养箱中培养，培养温度为25℃。当培养至4～6天时，更换1/2新鲜的不含Y-27632，A83-01和CHIR99021培养基，培养至12天时，完全更换新鲜的不含Y-27632，A83-01和CHIR99021培养基。
（3）传代培养：当原代培养细胞铺满培养瓶底90％以上时，去掉培养液，加入胰蛋白酶消化（消化温度为25℃～28℃，消化时间不超过5 min），待消化一段时间后加入FBS终止消化反应，离心收集消化的细胞，加入新鲜L-15培养基继续培养（不含Y-27632，A83-01和CHIR99021），这时能看到多数呈类上皮样形态的细胞能贴壁后继续生长，很少出现空泡化。当细胞铺满培养瓶底90％以上时，继续进行传代培养，直至细胞形成均一稳定的形态。
结果如图5所示，A、C、E是未加Y-27632、A83-01和CHIR99021进行培养，分别为原代培养、第一次传代和第30代，细胞形态呈现成纤维样，并且在第一次传代时类上皮细胞出现大量空泡化（箭头所示）；B、D、F是添加Y-27632、A83-01和CHIR99021进行培养，分别为原代培养、第一次传代和第25代；细胞呈现明显类上皮样形态。标尺：100 μm。
实施例5：石斑鱼尾鳍上皮样细胞的培养
方法同实施例4，结果如图6所示：A、C是未加Y-27632、A83-01和CHIR99021进行培养，分别为原代培养和第三代，细胞呈现成纤维样；B、D是添加Y-27632、A83-01和CHIR99021进行培养，分别为原代培养和第三代，细胞呈现明显类上皮样形态。标尺：100 μm。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.鱼鳍上皮样细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1）：采集鱼鳍组织，清洁灭菌，剪碎，获得碎组织；
步骤（2）：取步骤（1）所述碎组织接入含有Y-27632、A83-01、CHIR99021、FBS和抗生素的L-15培养基，培养4～6天，更新培养基，使所述Y-27632、所述A83-01和所述CHIR99021的浓度分别下降一半，培养至第12天时，更新培养基，使所述Y-27632、所述A83-01和所述CHIR99021含量皆为零，培养，传代；
所述Y-27632、所述A83-01和所述CHIR99021的摩尔比为10:4:1；
所述鱼鳍包括鱼尾鳍、背鳍或胸鳍中的一种或多种；
所述FBS在所述L-15培养基中的含量为20%；
所述抗生素包括100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素和0.50 mg/mL庆大霉素的混合溶液。
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