CN116875528A - 一种上皮类器官培养基及培养方法 - Google Patents

一种上皮类器官培养基及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种上皮类器官培养基及培养方法，其解决了现有技术中类器官生长速率偏低以及形成率不高的技术问题，上皮类器官培养基含有基本组分和额外组分，基本组分含有DMEM/F12基础培养基、青霉素‑链霉素溶液、Glutamax添加剂、重组脊椎蛋白、重组头蛋白、Y‑27632、表皮生长因子、N‑2‑羟乙基哌嗪‑N‑2‑乙烷磺酸缓冲溶液、尼克酰胺、A83‑01和CHIR99021，额外组分含有Wnt‑3A、ITS‑X添加剂和氢化可的松。本发明同时提供了上皮类器官的培养方法。本发明可用于上皮类器官的培养。

Description

一种上皮类器官培养基及培养方法
技术领域
本发明涉及一种类器官培养基及培养方法，具体地说，涉及一种上皮类器官培养基及培养方法。
背景技术
体外三维细胞培养技术最早于1907年被应用于海绵细胞的体外培养。此后三维培养的细胞球模型在临床和基础研究中得到了广泛应用。2009年，荷兰学者Hans Clevers首次在体外构建了类器官模型，使体外实验获得了长足的进步。类器官(organoid)是由干细胞或祖细胞在体外经培养而形成的三维细胞聚集体。相比传统的细胞培养方式，类器官具有自我更新、自我组织能力，并保持了其来源组织的生理结构和功能。作为一种新兴的体外实验模型，类器官兼具细胞系和动物模型二者的优点，并且在体外长期扩增中可以保持基因组稳定性，可以用于构建活体生物库进行高通量筛选。此外，类器官模型可以有效再现宿主的个性化特征，为个性化治疗以及药物筛选提供了理想的平台。
近年来，类器官在研究领域得到了广泛的关注，但主要研究仍集中于肿瘤个性化治疗，对于正常组织类器官构建的研究较少。但现有研究中类器官的构建方法仍然基于Clevers教授提出的体系。目前已发表文献表明该体系仍存在类器官生长速率偏低以及形成率不高的不足。
目前已发表文献中常用方法仍基于神经类器官培养体系。该体系虽然可有效促进干细胞的分化和自我更新，但由于缺乏上皮细胞特异性生长因子，其在促进上皮细胞增殖和类器官发育方面仍存在不足，进而导致了类器官模型与体内组织在基因表达谱和功能层面存在较大差异。主要表现在现有针对上皮类器官模型构建方法存在构建成功率低，类器官生长速率低，与体内组织基因表达谱差异大等不足。
发明内容
本发明就是为了解决现有技术中类器官生长速率偏低以及形成率不高的技术问题，提供一种经过改良的培养基及培养方法，其可以提高类器官生长速率以及提高类器官对体内组织模拟相似度。
为此，本发明提供一种上皮类器官培养基，其含有基本组分和额外组分，所述基本组分含有DMEM/F12基础培养基、青霉素-链霉素溶液、Glutamax添加剂、重组脊椎蛋白、重组头蛋白、Y-27632、表皮生长因子、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲溶液、N-乙酰基-L-半胱氨酸、尼克酰胺、A83-01和CHIR99021，还含有额外组分，所述额外组分包括Wnt-3A生长因子、ITS-X添加剂和氢化可的松。
优选的，所述组分的含量或浓度范围为：Wnt-3A生长因子10ng/ml～40ng/ml；ITS-X添加剂0.5×～1×；氢化可的松2.5～10μg/L。
优选的，所述组分的浓度为：青霉素-链霉素溶液100U/ml、Glutamax添加剂1×、重组脊椎蛋白10ng/ml、重组头蛋白10ng/ml、Y-2763210μmol/L、表皮生长因子50ng/ml、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲溶液10mmol/L、N-乙酰基-L-半胱氨酸1mmol/L、尼克酰胺10mmol/L、A83-01 1μmol/L、CHIR99021 0.5μmol/L、Wnt-3A 10-40ng/ml、ITS-X添加剂0.5×-2×、氢化可的松2.5-10μg/L。
本发明同时提供一种上皮类器官的培养方法，其包括如下步骤：(1)上皮层组织的分离：收集的上皮组织块，保存于含有青霉素-链霉素双抗的DMEM/F12培养基中，上皮组织块经中性蛋白酶II消化，分离获得上皮层组织；(2)原代上皮干细胞的获取：将所述步骤(1)获得的上皮层组织分割为组织块；采用胶原酶I型与透明质酸酶混合消化液消化；(3)上皮干细胞接种基质胶：使用消化液2倍体积的含有10％胎牛血清DMEM培养基终止消化，使用移液枪反复吹打，离心后，弃去上清液，使用液态基质胶重悬，接种于孔板中，接种完毕后，孔板倒置于孵箱中；(4)培养体系的构建：向孔板中加入上皮类器官培养基，培养板放置培养箱；接种于孔板的类器官定时更换培养基，培养成熟。
优选的，所述步骤(1)中，所述中性蛋白酶II的配制采用无血清DMEM培养基+Rock抑制剂Y-27632作为溶剂；取中性蛋白酶II，溶解于溶剂中，混匀后采用细菌过滤膜过滤。
优选的，所述步骤(3)中，所述基质胶提前从冰箱中取出，存放于冰箱，使之从固态转化为液态；吸取基质胶重悬细胞沉淀使用的枪头，提前放入冰箱预冷；离心后弃去上清的离心管，插入冰中，并在冰上进行重悬操作，避免基质胶发生不可逆凝固。
优选的，还包括如下步骤：(5)类器官生长速率表征：光镜下观察类器官的数量和直径，进而对其生长速率做定性评估。
优选的，还包括如下步骤：(6)类器官基因表达谱表征：提取类器官总RNA以及保存的上皮层组织总RNA进行转录组测序，转录组测序采用illumina二代测序方法。
优选的，所述步骤(6)中，将上皮层组织、基质胶内的类器官充分磨碎，而后采用Trizol裂解法，提取类器官内细胞的总RNA。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过改良类器官培养基，增加促进细胞增殖和代谢的成分，显著提高了类器官的生长速率；增加促进器官形成、发育以及稳态维持的成分，显著减少了类器官与体内组织上调与下调差异转录本的数量；使得类器官在发育、代谢、稳态维持方面的功能和通路与体内组织差异更小；本发明通过采用液氮速冻后金刚砂研磨+Trizol裂解法提取类器官总RNA，相比采用酶消化分离获得单个细胞+Trizol裂解法提取类器官总RNA可以获得更高的RNA量，降低RNA的降解率，同时降低RNA中蛋白质污染的引入，具体地说，
(1)本发明通过削减常规类器官培养基中非必要成分(B-27神经营养因子，毛侯素，成纤维细胞生长因子-2，成纤维细胞生长因子-10，前列腺素E2)，在确保类器官生长速率不变的前提下简化了培养基配置，降低了培养成本；
(2)本发明通过改良培养基，提高了类器官的生长速率(相同时间内类器官直径更大)和形成率(相同接种密度下类器官形成数量更多)；
(3)本发明通过改良类器官培养基，添加ITS-X(胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺)，氢化可的松和Wnt-3A蛋白，使得改良类器官与体内牙龈上皮组织的差异转录本数量显著少于常规培养类器官和体内牙龈上皮组织的差异转录本数量；
(4)本发明通过改良类器官培养基，添加ITS-X(胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺)，氢化可的松和Wnt-3A蛋白，使得改良类器官与体内牙龈上皮组织在GO功能富集的生物学过程、细胞组分、分子功能方面的差异显著小于常规培养类器官和体内牙龈上皮组织的差异；
(5)本发明通过改良类器官培养基，添加ITS-X(胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺)，氢化可的松和Wnt-3A蛋白，使得改良类器官与体内牙龈上皮组织在Reactome通路方面的差异显著小于常规培养类器官和体内牙龈上皮组织的差异；
(6)本发明通过改良类器官培养基，添加Wnt-3A蛋白，使得改良类器官与体内牙龈上皮组织在Wnt相关信号通路方面(包含经典的Wnt信号通路和非经典的Wnt信号通路)的差异显著小于常规培养类器官和体内牙龈上皮组织的差异；
(7)本发明通过改良类器官培养基，添加胰岛素，使得改良类器官与体内牙龈上皮组织在葡萄糖、蛋白质和脂质代谢及调控方面的差异显著小于常规培养类器官和体内牙龈上皮组织的差异；
(8)本发明通过改良类器官培养基，添加转铁蛋白，使得改良类器官与体内牙龈上皮组织在细胞铁离子平衡调节及DNA/RNA聚合酶活性调控方面的差异显著小于常规培养类器官和体内牙龈上皮组织的差异；
(9)本发明通过改良类器官培养基，添加硒元素(亚硒酸钠)，使得改良类器官与体内牙龈上皮组织在细胞周期调控、谷胱甘肽合成代谢以及细胞氧化应激反应调节方面的差异显著小于常规培养类器官和体内牙龈上皮组织的差异；
(10)本发明通过改良类器官培养基，添加乙醇胺，使得改良类器官与体内牙龈上皮组织在细胞增殖以及干细胞增殖调控方面的差异显著小于常规培养类器官和体内牙龈上皮组织的差异；
(11)本发明通过采用液氮速冻后精细研磨的方法破碎类器官中的细胞进而用Trizol提取细胞总RNA，相较于传统的消化类器官获得单个细胞后Trizol提取法。其中精细研磨法获得总RNA的O.D.260/280(反映蛋白质污染物的多少，数值越高污染越少)相较酶消化法提高了49.46％，RNA总量(μg)提高了1056.14±339.91％，RNA完整性(RIN值，数值越高RNA完整性越高)提高了325.00±169.95％。
附图说明
图1是本发明实施例1中常规培养基与改良培养基培养的类器官在接种后第3，5、7天光学显微镜下类器官尺寸差异(镜下标尺：200μm)；
图2是本发明实施例1中基础培养基、常规培养基与改良培养基培养的类器官在接种后第7天光学显微镜下类器官数量及尺寸差异(镜下标尺：左侧400μm，中间200μm，右侧100μm)；
图3是本发明实施例2、3、4中基础培养基额外分别添加0.5×、1×、2×的ITS-X添加剂后培养至第7天光学显微镜下类器官数量及尺寸差异(镜下标尺：左侧400μm，中间200μm，右侧100μm)；
图4是本发明实施例5、6、7中基础培养基额外分别添加2.5μg/L、5μg/L、10μg/L氢化可的松后培养至第7天光学显微镜下类器官数量及尺寸差异(镜下标尺：左侧400μm，中间200μm，右侧100μm)；
图5是本发明实施例8、9、10中基础培养基额外分别添加10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL的Wnt-3A添加剂后培养至第7天光学显微镜下类器官数量及尺寸差异(镜下标尺：左侧400μm，中间200μm，右侧100μm)；
图6a是本发明实施例12中分别采用常规消化法和研磨法提取获得的类器官总RNA通过荧光分光广度计测得的O.D.260/280数值差异柱状图；
图6b本发明实施例12中分别采用常规消化法和研磨法提取获得的类器官总RNA采用Nanodrop测定的RNA浓度换算获得的RNA总质量差异柱状图；
图6c本发明实施例12中分别采用常规消化法和研磨法提取获得的类器官总RNA采用安捷伦2100生物分析仪测定RNA的RIN值差异柱状图；
图7是本发明实施例13中常规培养类器官和改良培养类器官分别与体内粘膜上皮组织比较得到的差异转录本柱状图；纵轴代表差异转录本数量，横轴显示样本分组，深色代表差异上调的转录本，浅色代表差异下调的转录本；
图8a、图8b和图8c分别是本发明实施例13中规培养类器官和改良培养类器官分别与体内粘膜上皮组织比较得到的差异转录本通过GO功能富集分析得到的生物学过程(图8a)、细胞组分(图8b)、分子功能(图8c)三方面功能主要差异条目热图；纵轴代表差异功能条目，横轴代表样本分组；颜色越深代表该条目下注释到的差异转录本数量越多；
图9是本发明实施例13中规培养类器官和改良培养类器官分别与体内粘膜上皮组织比较得到的差异转录本通过Reactome通路富集分析得到的主要差异条目热图；纵轴代表差异功能条目，横轴代表样本分组；颜色越深代表该条目下注释到的差异转录本数量越多；
图10是本发明实施例13中规培养类器官和改良培养类器官分别与体内粘膜上皮组织比较得到的差异转录本富集到Wnt相关信号通路的热图；纵轴代表相关通路名称，横轴代表样本分组；颜色越深代表该条目下注释到的差异转录本数量越多；
图11a、图11b和图11c分别是本发明实施例13中常规培养类器官和改良培养类器官分别与体内粘膜上皮组织比较得到的差异转录本富集到葡萄糖(图11a)、蛋白质(图11b)和脂质(图11c)代谢及调控相关功能的热图；纵轴代表相关通路名称，横轴代表样本分组；颜色越深代表该条目下注释到的差异转录本数量越多；
图12是本发明实施例13中规培养类器官和改良培养类器官分别与体内粘膜上皮组织比较得到的差异转录本富集到细胞铁离子平衡调节及DNA/RNA聚合酶活性调控相关功能的热图；纵轴代表相关通路名称，横轴代表样本分组；颜色越深代表该条目下注释到的差异转录本数量越多；
图13a、图13b和图13c分别是本发明实施例13中规培养类器官和改良培养类器官分别与体内粘膜上皮组织比较得到的差异转录本富集到细胞周期调控(图13a)、谷胱甘肽合成代谢(图13b)以及细胞氧化应激反应调节(图13c)相关功能的热图；纵轴代表相关通路名称，横轴代表样本分组；颜色越深代表该条目下注释到的差异转录本数量越多；
图14是本发明实施例13中规培养类器官和改良培养类器官分别与体内粘膜上皮组织比较得到的差异转录本富集到细胞增殖以及干细胞增殖调控相关功能的热图。纵轴代表相关通路名称，横轴代表样本分组；颜色越深代表该条目下注释到的差异转录本数量越多。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
本发明中使用的培养基为改良培养基，对照组使用的培养基为常规培养基，二者共同成分包括DMEM/F12基础培养基，青霉素-链霉素溶液，Glutamax添加剂、重组脊椎蛋白(R-Spondin)、重组头蛋白(Noggin)、Y-27632、表皮生长因子(EGF)、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(HEPES)缓冲溶液、尼克酰胺、A83-01、CHIR99021；常规培养基含有的额外成分包括B-27添加剂、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、成纤维细胞生长因子-10(FGF-10)、毛侯素、前列腺素E2(PGE2)；改良培养基含有的额外成分包括Wnt-3A、ITS-X添加剂和氢化可的松。
常规培养基和改良培养基分别的组分以及浓度见表1和表2。
表1.常规培养基成分及浓度表格
表2.改良培养基成分及浓度表格
实施例1
(1)上皮组织的获取与保存：人牙龈上皮来源于临床牙周手术的废弃牙龈，使用生理盐水冲去表面血迹后4℃保存于含有10μmol/L Y-27632,5％青霉素-链霉素双抗的DMEM/F12培养基中；上皮组织确保在2小时内开始下一步的分离；
(2)上皮细胞的分离获取：通过中性蛋白酶II型4℃消化8小时分离上皮层与上皮下层组织；将分离获得的上皮组织使用手术刀切分成1x1mm2大小的组织块，加入由2mg/mL胶原酶I型+1mg/mL透明质酸酶组成的混合消化液消化1小时，达到消化时间后加入2倍体积的含有10％胎牛血清DMEM培养基终止消化，经100μm细胞滤网过滤后1000rpm离心5分钟(4℃)，弃去上清液，d-PBS重悬沉淀后再次1000rpm离心5分钟(4℃)；
(3)口腔粘膜上皮类器官的接种培养：弃去离心后的上清液，沉淀使用4℃复温的Matrigel基质胶重悬后，以每孔50μL接种于24孔细胞培养板；细胞培养孔板倒置存放于细胞培养箱中30-40分钟(37℃)；以每孔500μL加入类器官培养基，培养于37℃、饱和湿度、CO2体积分数5％的培养箱中；培养期间每48小时更换新培养基。
本实施例中使用的基础类器官培养基的组分及浓度为：DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素溶液100U/ml、Glutamax添加剂1×、重组脊椎蛋白10ng/ml、重组头蛋白10ng/ml、Y-27632 10μmol/L、表皮生长因子50ng/ml、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲溶液10mmol/L、N-乙酰基-L-半胱氨酸1mmol/L、尼克酰胺10mmol/L、A83-01 1μmol/L、CHIR990210.5μmol/L。
本实施例中使用的改良类器官培养基的组分及浓度为：DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素溶液100U/ml、Glutamax添加剂1×、重组脊椎蛋白10ng/ml、重组头蛋白10ng/ml、Y-27632 10μmol/L、表皮生长因子50ng/ml、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲溶液10mmol/L、N-乙酰基-L-半胱氨酸1mmol/L、尼克酰胺10mmol/L、A83-01 1μmol/L、CHIR990210.5μmol/L、Wnt-3A 20ng/ml、ITS-X添加剂1×和氢化可的松5μg/L。
本实施例中使用的对照类器官培养基的组分及浓度为：DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素溶液100U/ml、Glutamax添加剂1×、重组脊椎蛋白10ng/ml、重组头蛋白10ng/ml、Y-27632 10μmol/L、表皮生长因子50ng/ml、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲溶液10mmol/L、N-乙酰基-L-半胱氨酸1mmol/L、尼克酰胺10mmol/L、A83-01 1μmol/L、CHIR990210.5μmol/L、B-27添加剂1×、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)5ng/ml、成纤维细胞生长因子-10(FGF-10)10ng/ml、毛侯素1μmol/L、前列腺素E2(PGE2)1μmol/L。
实施例2
本实施例中使用的改良类器官培养基的组分及浓度为：DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素溶液100U/ml、Glutamax添加剂1×、重组脊椎蛋白10ng/ml、重组头蛋白10ng/ml、Y-27632 10μmol/L、表皮生长因子50ng/ml、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲溶液10mmol/L、N-乙酰基-L-半胱氨酸1mmol/L、尼克酰胺10mmol/L、A83-01 1μmol/L、CHIR990210.5μmol/L、ITS-X添加剂0.5×。
除了上述改良培养基的组分及浓度外，对照培养基及其它同实施例1。
实施例3
本实施例中使用的改良类器官培养基的组分及浓度为：DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素溶液100U/ml、Glutamax添加剂1×、重组脊椎蛋白10ng/ml、重组头蛋白10ng/ml、Y-27632 10μmol/L、表皮生长因子50ng/ml、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲溶液10mmol/L、N-乙酰基-L-半胱氨酸1mmol/L、尼克酰胺10mmol/L、A83-01 1μmol/L、CHIR990210.5μmol/L、ITS-X添加剂1×。
除了上述改良培养基的组分及浓度外，对照培养基及其它同实施例1。
实施例4
本实施例中使用的改良类器官培养基的组分及浓度为：DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素溶液100U/ml、Glutamax添加剂1×、重组脊椎蛋白10ng/ml、重组头蛋白10ng/ml、Y-27632 10μmol/L、表皮生长因子50ng/ml、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲溶液10mmol/L、N-乙酰基-L-半胱氨酸1mmol/L、尼克酰胺10mmol/L、A83-01 1μmol/L、CHIR990210.5μmol/L、ITS-X添加剂2×。
除了上述改良培养基的组分及浓度外，对照培养基及其它同实施例1。
实施例5
本实施例中使用的改良类器官培养基的组分及浓度为：DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素溶液100U/ml、Glutamax添加剂1×、重组脊椎蛋白10ng/ml、重组头蛋白10ng/ml、Y-27632 10μmol/L、表皮生长因子50ng/ml、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲溶液10mmol/L、N-乙酰基-L-半胱氨酸1mmol/L、尼克酰胺10mmol/L、A83-01 1μmol/L、CHIR990210.5μmol/L、氢化可的松2.5μg/L。
除了上述改良培养基的组分及浓度外，对照培养基及其它同实施例1。
实施例6
本实施例中使用的改良类器官培养基的组分及浓度为：DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素溶液100U/ml、Glutamax添加剂1×、重组脊椎蛋白10ng/ml、重组头蛋白10ng/ml、Y-27632 10μmol/L、表皮生长因子50ng/ml、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲溶液10mmol/L、N-乙酰基-L-半胱氨酸1mmol/L、尼克酰胺10mmol/L、A83-01 1μmol/L、CHIR990210.5μmol/L、氢化可的松5μg/L。
除了上述改良培养基的组分及浓度外，对照培养基及其它同实施例1。
实施例7
本实施例中使用的改良类器官培养基的组分及浓度为：DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素溶液100U/ml、Glutamax添加剂1×、重组脊椎蛋白10ng/ml、重组头蛋白10ng/ml、Y-27632 10μmol/L、表皮生长因子50ng/ml、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲溶液10mmol/L、N-乙酰基-L-半胱氨酸1mmol/L、尼克酰胺10mmol/L、A83-01 1μmol/L、CHIR990210.5μmol/L、氢化可的松10μg/L。
除了上述改良培养基的组分及浓度外，对照培养基及其它同实施例1。
实施例8
本实施例中使用的改良类器官培养基的组分及浓度为：DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素溶液100U/ml、Glutamax添加剂1×、重组脊椎蛋白10ng/ml、重组头蛋白10ng/ml、Y-27632 10μmol/L、表皮生长因子50ng/ml、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲溶液10mmol/L、N-乙酰基-L-半胱氨酸1mmol/L、尼克酰胺10mmol/L、A83-01 1μmol/L、CHIR990210.5μmol/L、Wnt-3A 10ng/ml。
除了上述改良培养基的组分及浓度外，对照培养基及其它同实施例1。
实施例9
本实施例中使用的改良类器官培养基的组分及浓度为：DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素溶液100U/ml、Glutamax添加剂1×、重组脊椎蛋白10ng/ml、重组头蛋白10ng/ml、Y-27632 10μmol/L、表皮生长因子50ng/ml、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲溶液10mmol/L、N-乙酰基-L-半胱氨酸1mmol/L、尼克酰胺10mmol/L、A83-01 1μmol/L、CHIR990210.5μmol/L、Wnt-3A 20ng/ml。
除了上述改良培养基的组分及浓度外，对照培养基及其它同实施例1。
实施例10
本实施例中使用的改良类器官培养基的组分及浓度为：DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素溶液100U/ml、Glutamax添加剂1×、重组脊椎蛋白10ng/ml、重组头蛋白10ng/ml、Y-27632 10μmol/L、表皮生长因子50ng/ml、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲溶液10mmol/L、N-乙酰基-L-半胱氨酸1mmol/L、尼克酰胺10mmol/L、A83-01 1μmol/L、CHIR990210.5μmol/L、Wnt-3A 40ng/ml。
除了上述改良培养基的组分及浓度外，对照培养基及其它同实施例1。
实施例11
口腔粘膜类器官生长速率表征：分别于类器官接种第3、5、7天光镜下观察类器官的数量和直径，实验组和对照组各取相同倍数下的9个视野观察，对其生长速率做评估。
实施例12
口腔粘膜类器官总RNA提取：类器官培养第12天弃去培养基，无菌PBS冲洗3遍，吸净孔板内所有液体，将孔板连同吸附于其上的固态基质胶液氮速冻10分钟，分离孔板与固态基质胶，将基质胶放置于冻存管中-80℃保存。提取总RNA采用金刚砂精细研磨，将固态基质胶磨碎后加入10倍体积的Trizol提取总RNA。
(1)采用荧光分光光度法测定RNA样本的O.D.260/280数值；
(2)采用Nanodrop测定RNA浓度(RNA含量)；
(3)采用安捷伦2100生物分析仪测定RNA的RIN值。
实施例13
口腔黏膜类器官表型高通量鉴定：对口腔粘膜上皮组织，常规培养口腔黏膜类器官，改良培养的口腔黏膜类器官进行转录组学测序。分别对比粘膜上皮组织-常规培养粘膜类器官以及粘膜上皮组织-改良培养粘膜类器官之间的差异转录本，并对差异转录本进行功能以及通路富集分析。
惟以上所述者，仅为本发明的具体实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围，故其等同组件的置换，或依本发明专利保护范围所作的等同变化与修改，皆应仍属本发明权利要求书涵盖之范畴。

Claims (9)

1.一种上皮类器官培养基，其含有基本组分和额外组分，所述基本组分含有DMEM/F12基础培养基、青霉素-链霉素溶液、Glutamax添加剂、重组脊椎蛋白、重组头蛋白、Y-27632、表皮生长因子、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲溶液、N-乙酰基-L-半胱氨酸、尼克酰胺、A83-01和CHIR99021，其特征是，还含有额外组分，所述额外组分包括Wnt-3A生长因子、ITS-X添加剂和氢化可的松。
2.根据权利要求1所述的上皮类器官培养基，其特征是，所述组分的含量或浓度范围为：Wnt-3A生长因子10ng/ml～40ng/ml；ITS-X添加剂0.5×～1×；氢化可的松2.5～10μg/L。
3.根据权利要求1所述的上皮类器官培养基，其特征是，所述组分的浓度为：青霉素-链霉素溶液100U/ml、Glutamax添加剂1×、重组脊椎蛋白10ng/ml、重组头蛋白10ng/ml、Y-27632 10μmol/L、表皮生长因子50ng/ml、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸缓冲溶液10mmol/L、N-乙酰基-L-半胱氨酸1mmol/L、尼克酰胺10mmol/L、A83-01 1μmol/L、CHIR990210.5μmol/L、Wnt-3A 10-40ng/ml、ITS-X添加剂0.5×-2×、氢化可的松2.5-10μg/L。
4.一种上皮类器官的培养方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)上皮层组织的分离：收集的上皮组织块，保存于含有青霉素-链霉素双抗的DMEM/F12培养基中，上皮组织块经中性蛋白酶II消化，分离获得上皮层组织；
(2)原代上皮干细胞的获取：将所述步骤(1)获得的上皮层组织分割为组织块；采用胶原酶I型与透明质酸酶混合消化液消化；
(3)上皮干细胞接种基质胶：使用含有胎牛血清DMEM培养基终止消化，使用移液枪反复吹打，离心后，弃去上清液，使用液态基质胶重悬，接种于孔板中，接种完毕后，孔板倒置于孵箱中；
(4)培养体系的构建：向孔板中加入上皮类器官培养基，培养板放置培养箱；接种于孔板的类器官定时更换培养基，培养成熟。
5.根据权利要求4所述的上皮类器官的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述中性蛋白酶II的配制采用无血清DMEM培养基+Rock抑制剂Y-27632作为溶剂；取中性蛋白酶II，溶解于溶剂中，混匀后采用细菌过滤膜过滤。
6.根据权利要求4所述的上皮类器官的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述基质胶提前从冰箱中取出，存放于冰箱，使之从固态转化为液态；吸取基质胶重悬细胞沉淀使用的枪头，提前放入冰箱预冷；离心后弃去上清的离心管，插入冰中，并在冰上进行重悬操作，避免基质胶发生不可逆凝固。
7.根据权利要求4所述的上皮类器官的培养方法，其特征在于，还包括如下步骤：(5)类器官生长速率表征：光镜下观察类器官的数量和直径，进而对其生长速率做定性评估。
8.根据权利要求4所述的上皮类器官的培养方法，其特征在于，还包括如下步骤：(6)类器官基因表达谱表征：提取类器官总RNA以及保存的上皮层组织总RNA进行转录组测序，转录组测序采用illumina二代测序方法。
9.根据要求8所述的上皮类器官的培养方法，其特征在于，所述步骤(6)中，将上皮层组织、基质胶内的类器官充分磨碎，而后采用Trizol裂解法，提取类器官内细胞的总RNA。
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