CN111621474A - 间充质干细胞膜片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种在无血清培养体系中培养和制备的间充质干细胞膜片例如脐带间充质干细胞膜片以及相应制备方法。本公开还提供了间充质干细胞膜片在受损组织的损伤修复中的用途。

Description

间充质干细胞膜片及其制备方法
本申请要求于2019年02月28日递交的申请号为201910148322.3的中国专利申请的优先权，在此全文引用上述中国专利申请公开的内容以作为本申请的一部分。
发明领域
本发明涉及组织工程与再生医学领域，尤其涉及一种间充质干细胞膜片，其制备方法，以及间充质干细胞膜片的用途。
技术背景
间充质干细胞广泛存在于人体的组织中，具有体外扩增能力，多项分化潜能和免疫调节作用，目前已经被应用于自身组织修复和免疫相关疾病的治疗中。
目前在间充质干细胞用于自身组织修复的基础研究和临床应用中，大部分方法采用了细胞直接注射或者细胞与组织工程支架材料结合后移植的方法，这两者均具有一定的局限性。细胞直接注射会导致大量细胞丢失，治疗效率低，干细胞发挥组织修复的功能有限；而细胞与组织工程支架结合后进行移植尽管解决了细胞丢失的问题，但是支架材料在生物体内可能会引起不同程度的炎症反应，且支架材料的降解过程及降解产物可能使局部组织发生病变。因此，对于间充质干细胞的新的应用方式以及相关产品，本领域中仍然存在需要。
此外，目前广泛使用的间充质细胞培养体系中均含有血清成分。异体甚至异种来源的血清具有潜在的免疫风险，并且是病原微生物等的潜在载体，而且批次之间的均一性难以保证。自体来源的血清虽然避免了免疫风险，但是来源有限，批次之间质量难以控制，不利于培养体系的稳定。因此，需要解决上述与血清的使用相关的问题。
发明内容
本发明人通过在无血清培养体系中培养间充质干细胞，并制备细胞膜片的方式，获得了间充质干细胞膜片。上述细胞膜片具有生物安全性高，其中的活细胞率很高，且细胞状态良好，具备高效分化潜能和分泌各种促进血管生成和免疫调节相关因子的能力，从而完成了本发明。
相应的，在一个方面，本发明涉及一种间充质干细胞膜片，所述膜片不含有支架材料并且不含有血清组分，其中所述膜片中间充质干细胞的细胞比例为至少90％。在一些方案中，所述膜片中间充质干细胞的比例为至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％。
在一些实施方案中，用于制备所述间充质干细胞膜片的间充质干细胞可以来源于选自以下的组织：羊水、羊膜、绒毛膜、绒毛膜绒毛、蜕膜、胎盘、脐带血、华通氏胶、脐带、成人骨髓、成人外周血和成人脂肪组织。
在一些实施方案中，用于制备所述间充质干细胞膜片的间充质干细胞可以选自脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞，以及本领域已知的其它来源的间充质干细胞。在优选的实施方案中，所述间充质干细胞是脐带间充质干细胞。
本发明的间充质干细胞膜片可以使用不同传代数的间充质干细胞来制备。在一些实施方案中，使用传代数为P0-P20的间充质干细胞来制备细胞膜片。例如，可以使用传代数为P2-P15或P2-P10的间充质干细胞来制备细胞膜片。
在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞膜片具有10-300μm的厚度。在一些实施方案中，所述间充质干细胞膜片具有15-250μm的厚度。此外，本发明的间充质干细胞膜片可以具有不同的细胞层数。在一些实施方案中，所述间充质干细胞膜片具有1-15层细胞。
在一些实施方案中，本发明的间充质干细胞膜片具有1×105至1×107/cm2的细胞密度。在一些实施方案中，所述间充质干细胞膜片具有3×105至5×106/cm2的细胞密度。
本发明的间充质干细胞膜片的表面积和形状没有任何限制，并且其表面积和形状可以根据应用的场景和培养的方法而变化。
在本发明的间充质干细胞膜片中，间充质干细胞之间通过其分泌的细胞外基质彼此连接，所述细胞外基质富含整合蛋白和黏连蛋白，例如纤连蛋白和整联蛋白-β1。
根据制备方法，本发明的间充质干细胞膜片可以具有表面和基底面。其中，基底面是与培养基接触的一面，并且富含细胞连接蛋白。
本发明的间充质干细胞膜片中的间充质干细胞很好地保留了其分化潜能，能够高效分化成多种类型的细胞，包括骨、软骨和脂肪细胞等。并且，上述间充质干细胞能够高效分泌多种血管生成因子和免疫调节因子，例如白细胞介素-6(IL-6)、转化生长因子-β(TGF-β)、前列腺素E2(PGE2)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素生长因子、基质细胞衍生生长因子-1、色氨酸代谢酶(IDO)和一氧化氮合酶(iNOS)等的一种或多种。
在另一方面，本发明涉及一种制备间充质干细胞膜片的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供间充质干细胞；
b.在无血清培养体系中培养和传代所述间充质干细胞；
c.将所述间充质干细胞转移到粘附基质预包被的温敏培养皿中；
d.待间充质干细胞附着于所述培养皿并生长一段时间后，通过降低温度使间充质干细胞从所述温敏培养皿脱离，
其中所述间充质干细胞通过其分泌的细胞外基质彼此连接，从而获得间充质干细胞膜片。
本文所用的术语“温敏培养皿”是指表面涂覆了一层温度敏感性高分子物质的培养皿，该高分子物质在不同温度下分子链段的伸展情况不同，从而表现出亲水性或疏水性，使得该高分子物质的亲疏水性能够随外部温度变化而变化。当温敏培养皿表面呈现亲水性时，与细胞及其分泌的细胞外基质粘合性变差，细胞将成层状脱落。在具体应用中，当将温度降低至该高分子物质的低临界溶解温度之下，该温敏培养皿表面呈现亲水性，从而使得细胞将成层状脱落。
在上述方法的一些实施方案中，所述间充质干细胞可以来源于选自以下的组织：羊水、羊膜、绒毛膜、绒毛膜绒毛、蜕膜、胎盘、脐带血、华通氏胶、脐带、成人骨髓、成人外周血和成人脂肪组织。
在上述方法的一些实施方案中，所述充质干细胞可以选自脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞，以及本领域已知的其它来源的间充质干细胞。在优选的实施方案中，所述充质干细胞是脐带间充质干细胞。
在一些实施方案中，所述间充质干细胞是脐带间充质干细胞，并且所述方法的步骤a包括从脐带获得间充质干细胞的步骤。
在一些实施方案中，从脐带获得脐带间间充质干细胞包括以下步骤：
a1.从脐带分离华通氏胶；
a2.将华通氏胶剪碎成小组织块，并在无血清培养体系中培养所述组织块足够的时间段，使得间充质干细胞从组织块爬出；
a3.待所述间充质干细胞生长至50％-100％汇合，例如70％-100％汇合或80％-100％汇合时，移除组织块，从而获得脐带间充质干细胞。
在一些实施方案中，所述方法还包括测定脐带间充质干细胞的生长曲线的步骤。例如，可以使用MTT法、WST法、DNA含量检测法、ATP检测法等测定脐带间充质干细胞的生长曲线。
在一些实施方案中，所述方法还包括对脐带间充质干细胞进行鉴定的步骤。例如，可以使用流式细胞术检测细胞表面标记蛋白、PCR法检测细胞表达基因和脐带间充质干细胞的三向分化实验等进行脐带间充质干细胞的鉴定。在一些实施方案中，使用流式细胞术检测细胞表面标记蛋白来鉴定脐带间充质干细胞，所述标记蛋白可以包括选自下组标记蛋白：CD73、CD90、CD105、CD34、CD11B、CD19、CD45和HLA-DR的一种或多种。其中CD73、CD90和CD105为阳性标记蛋白，而并且CD34、CD11B、CD19、CD45和HLA-DR为阴性标记蛋白。
在本发明的制备间充质干细胞膜片的方法的一些实施方案中，所述无血清培养体系包括使用选自以下的基础培养基：1640、DMEM、α-MEM、DMEM/F12和F12无血清培养基，并且所述培养基使用选自一些的一种或多种添加剂补充：维生素C、硒酸钠、氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、人血清白蛋白(植物表达)、孕酮、腐胺、生物素、丙酮酸钠、乙醇胺、肉毒碱、氨基酸、维生素、谷胱甘肽、亚油酸、亚麻酸。
在另一些实施方案中，所述无血清培养体系包括使用选自以下的商业化培养基：CTSTM Stem ProTM MSC SFM、MesenCultTM-ACF培养基、MesenCultTM-ACF Plus培养基和MesenCultTM-XF培养基。
在一些实施方案中，所述无血清培养体系还包括使用基质包被的培养皿，以使得间充质干细胞能够附着于所述培养皿。在一些实施方案中，所述基质选自胶原、明胶、纤连蛋白、黏连蛋白和玻连蛋白。
在本发明的方法中，可以使用不同传代数的间充质干细胞来制备间充质干细胞膜片。在一些实施方案中，使用传代数为P2-P20的间充质干细胞来制备细胞膜片。例如，可以使用传代数为P2-P15或P2-P10的间充质干细胞来制备细胞膜片。
在一些实施方案中，在步骤c中使用的温敏培养皿中用选自下组的粘附基质预包被：胶原、明胶、纤连蛋白，玻连蛋白，层粘连蛋白，多聚鸟氨酸和多聚赖氨酸。
在一些实施方案中，所述温敏培养皿的预包被时间为1小时以上，例如1-36小时，例如2-18小时。
在本发明的方法中，在间充质干细胞附着于温敏培养皿，使其生长一定的时间段，以进行增殖和分泌细胞外基质用于细胞连接。根据细胞种植的密度不同，在将间充质干细胞接种于所述温敏培养皿后进行培养的时间可以变化。例如，在使用高细胞接种密度的情况下(约1x105-5x106个细胞/cm2，例如约5x105-2x106个细胞/cm2)的情况下，接种后可以将温敏培养皿中的细胞培养约4-24小时，随后进行细胞膜片的制备。在以正常传代密度接种细胞的情况下，接种后可以将温敏培养皿中的细胞培养约1-7天。因此，在一些实施方案中，使所述间充质干细胞附着于所述培养皿并生长4小时至7天，例如4-24小时或1-7天。
在本发明的方法中，通过降低温度使得间充质干细胞从温敏培养皿脱离，从而形成间充质干细胞膜片。例如，在培养温度为约37℃的情况下，通过将温度降低至4-32℃从而使间充质干细胞从所述温敏培养皿脱离。
本发明还涉及通过本发明的方法制备的间充质干细胞膜片。
在一个方面，本发明涉及本发明的间充质干细胞膜片用于在受试者中进行受损组织的损伤修复中的用途。
在另一个方面，本发明涉及本发明的间充质干细胞膜片在制备用于在受试者中进行受损组织的损伤修复的药物组合物中的用途。
在再一个方面，本发明涉及一种在有需要的受试者中进行受损组织的损伤修复的方法，所述方法包括将本发明的间充质干细胞膜片应用于所述受损组织的步骤。
在一些实施方案中，所述受损组织可以选自心脏、肝脏、胰脏和子宫的组织，以及其他组织。
附图说明
图1是显示了通过本发明的方法在无血清体系中分离和培养的间充质干细胞的形态的图。图1A显示了P0的脐带间充质干细胞的形态图。图1B和图1C分别显示了传代数为P3和P5的脐带间充质干细胞的形态图。
图2是显示了通过本发明的方法在无血清体系中分离和培养的间充质干细胞的生长曲线图。使用WST法在7天的时间范围内检测细胞的活性，从而反映细胞数量的变化。
图3是显示了通过本发明的方法在无血清体系中分离和培养的间充质干细胞的三向分化结果的荧光染色图。使用荧光标记的相应抗体，分别对骨、软骨和脂肪细胞的分子标志物进行染色。DAPI用于对细胞核进行染色，以对细胞进行定位。
图4是显示了本发明的间充质干细胞的宏观形貌的照片。
图5是显示了本发明的间充质干细胞的培养上清中分泌的HGF、IL-6和VEGF的浓度的柱状图。通过ELISA测定，使用相应抗体进行所示因子的浓度测定。
图6是显示了使用荧光素标记的抗纤连蛋白和整联蛋白-β1抗体对间充质干细胞膜片进行染色的结果照片。DAPI用于对细胞核进行染色，以对细胞进行定位。
图7A和图7B显示了本发明的间充质干细胞膜片的扫描电子显微镜照片。图7A显示了细胞膜片接触智能培养皿的一面(基底面)的照片；图7B显示了细胞膜片不接触智能培养皿的一面(表面)的照片。
具体实施方式
实施例1.间充质干细胞的分离和培养
将得到的新生儿脐带用与人体体液渗透压相等的生理溶液洗净后去除动脉、静脉、外膜，分离出华通氏胶，使用手术剪剪碎成约0.1-2cm的小组织块。将组织块均匀铺在包被有基质的培养容器中，组织块之间的间距为约2-30mm。将培养容器置于细胞培养箱中，2-7天后加入适量无血清培养基覆盖组织块。如图1A所示，脐带间充质干细胞(P0)在3-21天从组织块爬出。爬出细胞贴壁生长，呈成纤维状，形态均一。待爬出细胞长至约70-100％汇合时，移除组织块，对细胞进行传代操作。
间充质干细胞传代
待细胞长至70～100％汇合时，对细胞进行传代操作。通过胰酶及类似物质消化和细胞刮等方式将细胞与培养容器分离。将细胞分散和重悬于培养基中，通过细胞计数计算悬液中的细胞浓度，并按照500～100000个细胞/cm2的密度将细胞接种于培养容器中。加入适量无血清培养基(CTSTM StemProTM MSC SFM，Life Technology公司，货号A1033201)进行培养。根据细胞生长状态，每1-5天更换适量新鲜的无血清培养基。待细胞长至70～100％汇合时，重复传代操作。进行培养的脐带间充质干细胞贴壁生长，呈成纤维状，形态均一。图1B和1C显示了传代数为P3和P5的间充质干细胞的示例性照片。
间充质干细胞生长曲线
随后，测定脐带间充质干细胞的生长曲线。使用WST法在7天的时间范围内检测细胞的活性，其反映了细胞数量的变化。具体而言，按照制造商的说明，将WST试剂按照推荐比例加入培养中的细胞孔板中。在细胞培养箱内孵育固定时间后用酶标仪或紫外分光光度计检测对应孔中的液体在450nm波长处的吸光度值，该值与细胞数量成正相关。如图2所示的结果可见，随着培养时间延长，孔中的细胞活性增加，表明细胞数量随培养时间延长而显著增加。
实施例2.间充质干细胞的鉴定
间充质干细胞表面标志物鉴定
通过流式细胞术的方法，使用对应抗体检测细胞表面的间充质干细胞表面标志物。表1显示了传代数为P5的间充质干细胞的示例性检测结果，其中脐带间充质干细胞阳性标志物CD73、CD90和CD105达到了95％以上，并且脐带间充质干细胞阴性标志物CD34、CD11b、CD19、CD45和HLA-DR均低于1％。上述结果显示了培养的脐带间充质干细胞具有高纯度。
表1：脐带间充质干细胞细胞表面标志物的表达情况
Figure BDA0002139053970000081
Figure BDA0002139053970000091
间充质干细胞的三向诱导分化
检测了脐带间充质干细胞向骨、软骨、脂肪细胞方向分化的能力。具体而言，对于成骨和成脂肪分化的检测，根据制造商的说明将脐带间充质干细胞按照特定的比例接种于合适的培养皿中。对于成骨诱导检测，待细胞生长至约50-90％汇合，且对于成脂肪诱导检测待细胞生长至90％以上汇合时，分别加入成骨和成脂肪诱导培养基。对于成软骨检测，将一定数量的细胞离心至管底，随后加入成软骨诱导培养基。待细胞团成小球后，使细胞小球离开管底，保证与诱导培养基完全接触，
诱导培养7天或更长时间后对细胞进行检测。对于成骨诱导，可以使用茜素红或抗骨钙蛋白抗体进行染色；对于成脂肪诱导，可以使用油红O或抗FABP4抗体进行染色；对于成软骨诱导，可以使用阿尔新蓝、番红O或抗聚集蛋白聚糖抗体进行染色。
图3显示了使用荧光显微镜照片传代数为P5的间充质干细胞进行三向分化的荧光显微镜照片。如图所示，脐带间充质干细胞在经过成脂肪诱导分化后可以被抗FABP4抗体染色、经过成骨诱导分化后可以被抗骨钙蛋白抗体染色，经过成软骨诱导分化后可以被抗聚集蛋白聚糖抗体染色。上述结果表明本发明的脐带间充质干细胞具备分化潜能，能够高效分化为骨、软骨以及脂肪细胞。
实施例3：间充质干细胞膜片制备
在制备脐带间充质干细胞膜片前，首先在温敏培养皿表面包被一层有利于间充质干细胞贴附的基质。使用的基质包括但不限于胶原、明胶、纤连蛋白，玻连蛋白，层粘连蛋白，多聚鸟氨酸，多聚赖氨酸等。
将所述温敏培养皿包被2小时。而后弃去包被液，随后将将间充质干细胞的单细胞悬液加入智能培养皿中。
采用了两种细胞接种方案。在第一种方案中，以约5x105-2x106个细胞/cm2的高细胞密度接种细胞，并将温敏培养皿置于培养箱中过夜培养(约18小时)。在第二种方案中，将细胞以约2x104-3x104个细胞/cm2的密度进行接种，并在培养箱中培养3天后。随后，将温度降低至室温(约25℃)，细胞成片层状从温敏培养皿底部脱离，形成由细胞外基质连结的完整细胞膜片。
图4显示了本发明的间充质干细胞膜片的宏观形貌。其中，膜片呈灰白色，结构致密，表面光滑平整。制备的细胞膜片中的活细胞率很高，且细胞状态良好，具备高效分化潜能。
实施例4：间充质干细胞膜片的表征
酶联免疫法检测细胞膜片分泌因子
间充质干细胞对于自身组织修复和免疫相关疾病的治疗效果主要通过分泌和表达免疫抑制因子、细胞因子、生长因子等调控炎症和组织稳态来实现，这些因子主要包括白细胞介素-6(IL-6)、转化生长因子-β(TGF-β)、前列腺素E2(PGE2)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素生长因子、基质细胞衍生生长因子-1、色氨酸代谢酶(IDO)和一氧化氮合酶(iNOS)等。
在本实施例中，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，根据制造商的说明对间充质干细胞细胞膜片的上清液中分泌的各因子进行检测。图5显示了检测了上清液中白细胞介素-6(IL-6)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子(VEGF)的含量。该结果表明，本发明的间充质干细胞膜片能够高效分泌多种血管生成因子和免疫调节因子，适合用于受损组织的损伤修复。
间充质干细胞膜片的组织切片观察
将上述得到的间充质干细胞膜片用多聚甲醛或福尔马林固定液固定，随后通过石蜡切片法或冰冻切片法将细胞膜片制成厚度为4-10μm的组织切片进行染色，以观察细胞膜片中细胞外基质所含蛋白情况，同时使用DAPI染料对细胞核进行染色，用于辅助定位。图6显示了使用荧光素标记的抗纤连蛋白和整联蛋白-β1抗体对间充质干细胞膜片染色的结果。该结果表明，得到的间充质干细胞膜片中含有大量的纤连蛋白和整联蛋白-β1，其作为膜片中的细胞外基质以连接间充质干细胞。
间充质干细胞膜片的扫描电子显微镜观察
将上述得到的间充质干细胞膜片用2.5％的戊二醛固定液固定，随后通过梯度乙醇进行脱水。将自然晾干后得到干燥的细胞膜片用于扫描电子显微镜分析。具体而言，将干燥的细胞膜片用导电双面胶粘贴在样品台表面，随后使用真空磁控溅射法进行表面喷金处理，使被观察样品表面导电。将样品台放入扫描电子显微镜(Hitachi S-4800)内进行观察。本发明的间充质干细胞膜片的代表性形貌图片如图7A和图7B所示。
其中，图7A为细胞膜片接触智能培养皿的一面(基底面)，表面形貌较平整，图片中圆形凸起为间充质干细胞，也可见细胞间蛋白连接。图7B为细胞膜片不接触智能培养皿的一面(表面)，可见细胞的堆叠。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (36)

1.一种间充质干细胞膜片，所述膜片不含有支架材料并且不含有血清组分，其中所述膜片中间充质干细胞的细胞比例为至少90％。
2.如权利要求1所述的间充质干细胞膜片，其中所述膜片中充质干细胞的比例为至少95％。
3.如权利要求1或2所述的间充质干细胞膜片，其中所述间充质干细胞来源于选自以下的组织：羊水、羊膜、绒毛膜、绒毛膜绒毛、蜕膜、胎盘、脐带血、华通氏胶、脐带、成人骨髓、成人外周血和成人脂肪组织。
4.如权利要求1或2所述的间充质干细胞膜片，其中所述充质干细胞选自脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞。
5.如权利要求4所述的间充质干细胞膜片，其中所述间充质干细胞是脐带间充质干细胞。
6.如权利要求1-5中任一项所述的间充质干细胞膜片，其中所述膜片使用传代数为P0-P20的间充质干细胞制备。
7.如权利要求6所述的间充质干细胞膜片，其中所述膜片使用传代数为P2-P10的间充质干细胞制备。
8.如权利要求1-7中任一项所述的间充质干细胞膜片，其中所述膜片的厚度为10-300μm。
9.如权利要求1-8中任一项所述的间充质干细胞膜片，其中所述膜片中的细胞密度为1×105至1×107/cm2。
10.如权利要求9所述的间充质干细胞膜片，其中所述膜片中的细胞密度为3×105至5×106/cm2。
11.如权利要求1-10中任一项所述的间充质干细胞膜片，其中所述膜片中的间充质干细胞通过其分泌的细胞外基质彼此连接。
12.如权利要求11所述的间充质干细胞膜片，其中所述细胞外基质富含整合蛋白和黏连蛋白，例如纤连蛋白和整联蛋白-β1。
13.如权利要求1-12中任一项所述的间充质干细胞膜片，其中所述膜片具有表面和基底面，所述基底面富含细胞连接蛋白。
14.如权利要求1-13中任一项所述的间充质干细胞膜片，其中所述间充质干细胞具有分化潜能，能够高效分化为骨、软骨和脂肪细胞。
15.如权利要求1-14中任一项所述的间充质干细胞膜片，其中所述间充质干细胞能够高效分泌多种血管生成因子和免疫调节因子。
16.如权利要求15所述的间充质干细胞膜片，其中所述血管生成因子和免疫调节因子包括白细胞介素-6(IL-6)、转化生长因子-β(TGF-β)、前列腺素E2(PGE2)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素生长因子、基质细胞衍生生长因子-1、色氨酸代谢酶(IDO)和一氧化氮合酶(iNOS)的一种或多种。
17.一种制备间充质干细胞膜片的方法，所述方法包括：
a.提供间充质干细胞；
b.在无血清培养体系中培养和传代所述间充质干细胞；
c.将所述间充质干细胞转移到粘附基质预包被的温敏培养皿中；
d.待间充质干细胞附着于所述培养皿并生长一段时间后，通过降低温度使间充质干细胞从所述温敏培养皿脱离，
其中所述间充质干细胞通过其分泌的细胞外基质彼此连接，从而获得间充质干细胞膜片。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述间充质干细胞来源于选自以下的组织：羊水、羊膜、绒毛膜、绒毛膜绒毛、蜕膜、胎盘、脐带血、华通氏胶、脐带、成人骨髓、成人外周血和成人脂肪组织。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述充质干细胞选自脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述间充质干细胞是脐带间充质干细胞。
21.如权利要求20所述的方法，其中步骤a包括从脐带获得脐带间充质干细胞的步骤。
22.如权利要求21所述的方法，其中从脐带获得脐带间充质干细胞包括以下步骤：
a1.从脐带分离华通氏胶；
a2.将华通氏胶剪碎成小组织块，并在无血清培养体系中培养所述组织块足够的时间段，使得间充质干细胞从组织块爬出；
a3.待所述间充质干细胞生长至50％-100％汇合时，移除组织块，从而获得脐带间充质干细胞。
23.如权利要求17-22中任一项所述的方法，其中所述无血清培养体系包括使用选自1640、DMEM、α-MEM、DMEM/F12和F12的无血清培养基，所述培养基使用选自下组的一种或多种添加剂补充：维生素C、硒酸钠、氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、人血清白蛋白(植物表达)、孕酮、腐胺、生物素、丙酮酸钠、乙醇胺、肉毒碱、氨基酸、维生素、谷胱甘肽、亚油酸、亚麻酸。
24.如权利要求17-22中任一项所述的方法，其中所述无血清培养体系包括使用选自下组的培养基：CTSTM Stem ProTM MSC SFM、MesenCultTM-ACF培养基、MesenCultTM-ACF Plus培养基和MesenCultTM-XF培养基。
25.如权利要求17-24中任一项所述的方法，其中所述无血清培养体系包括使用基质包被的培养皿，所述基质选自胶原、明胶、纤连蛋白、黏连蛋白和玻连蛋白。
26.如权利要求17-25中任一项所述的方法，其中在步骤b中将细胞培养和传代至传代数为P0-P20。
27.如权利要求26所述的方法，其中在步骤b中将细胞培养和传代至传代数为P2-P10。
28.如权利要求17-27中任一项所述的方法，其中所述粘附基质选自胶原、明胶、纤连蛋白，玻连蛋白，层粘连蛋白，多聚鸟氨酸和多聚赖氨酸。
29.如权利要求17-28中任一项所述的方法，其中在步骤d中，所述间充质干细胞附着于所述培养皿并生长4小时至7天。
30.如权利要求17-29中任一项所述的方法，其中在步骤d中将温度降低至4-32℃从而使间充质干细胞从所述温敏培养皿脱离。
31.通过如权利要求17-30中任一项所述的方法获得的间充质干细胞膜片。
32.如权利要求1-16和31中任一项所述的间充质干细胞膜片用于在受试者中进行受损组织的损伤修复中的用途。
33.如权利要求1-16和31中任一项所述的间充质干细胞膜片在制备用于在受试者中进行受损组织的损伤修复的药物组合物中的用途。
34.如权利要求32或33所述的用途，其中所述受损组织选自心脏、肝脏、胰脏和子宫的组织。
35.一种在有需要的受试者中进行受损组织的损伤修复的方法，所述方法包括将如权利要求1-16和31中任一项所述的间充质干细胞膜片应用于所述受损组织的步骤。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述受损组织选自心脏、肝脏、胰脏和子宫的组织。
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