CN115414310B - 间充质干细胞面膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了间充质干细胞面膜及其制备方法。该间充质干细胞包括：基体；间充质干细胞薄膜，所述间充质干细胞薄膜形成在所述基体的一侧表面，所述间充质干细胞薄膜包括层叠的多个单层间充质干细胞薄膜。该间充质干细胞面膜中，间充质干细胞可通过分化作用、旁分泌作用、促进胶原蛋白合成、抗炎作用等机制起到抗衰老作用，并实现面部整体修复、消除面部色斑、面部美白等方面效果；而且，间充质干细胞可以与皮肤表皮细胞之间形成细胞间隙连接，从而被皮肤吸收。另一方面，本发明的间充质干细胞面膜中的间充质干细胞薄膜为多个单层间充质干细胞薄膜叠加，由此，可以有效提高间充质干细胞薄膜的韧性和坚固性，从而进一步有利于其效果的发挥。
Description
技术领域
本发明涉及护肤品技术领域，具体而言，本发明涉及间充质干细胞面膜及其制备方法。
背景技术
目前市面上的许多抗衰老药物和化妆品的作用是加快细胞分裂和增殖、加快表皮细胞脱落速度，刺激基底细胞分裂，在短期内改善皮肤的外观，但由于细胞有一定寿命和分裂次数，加速细胞分裂使每次细胞周期变短，结果使细胞寿命变短，反而加速衰老。更有些不良商家为了让面膜看起来效果好，添加了汞、荧光增白剂等不安全成分。而且，面部表皮细胞表面是由脂质双分子层构成，严格控制细胞内外的物质交换，离子和蛋白等大分子无法自由通过。目前市场宣称干细胞外泌体面膜，其主要成分外泌体大部分都无法自由通过表皮细胞的表面脂质双分子层，无法进入表皮细胞内。
另一方面，关于制备细胞薄膜的方法，目前制备细胞薄膜的技术主要基于TeruoOkano等人研制的温感高聚物非粘附细胞培养器皿。然而，这种制备方法具有显著的缺点：如温度改变引起培养皿表面化学性质变化不均一、制备细胞薄膜耗时长、制备方法困难等；而其他制备方法如超声刺激法、电刺激法、紫外照射法等均存在缺点。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出间充质干细胞面膜及其制备方法。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种间充质干细胞面膜。根据本发明的实施例，该间充质干细胞面膜包括：基体；间充质干细胞薄膜，所述间充质干细胞薄膜形成在所述基体的一侧表面，所述间充质干细胞薄膜包括层叠的多个单层间充质干细胞薄膜。
根据本发明上述实施例的间充质干细胞面膜中，间充质干细胞可通过分化作用、旁分泌作用、促进胶原蛋白合成、抗炎作用等机制起到抗衰老作用，并实现面部整体修复、消除面部色斑、面部美白等方面效果；而且，间充质干细胞可以与皮肤表皮细胞之间形成细胞间隙连接，从而被皮肤吸收。另一方面，本发明的间充质干细胞面膜中的间充质干细胞薄膜为多个单层间充质干细胞薄膜叠加，由此，可以有效提高间充质干细胞薄膜的韧性和坚固性，从而进一步有利于其效果的发挥。
另外，根据本发明上述实施例的间充质干细胞面膜还可以具有如下附加的技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述间充质干细胞薄膜包括层叠的2～3个单层间充质干细胞薄膜。由此，可以进一步提高细胞薄膜的韧性和坚固性。
在本发明的一些实施例中，所述间充质干细胞薄膜覆盖所述基体的一侧表面不低于70％的面积。
在本发明的一些实施例中，所述间充质干细胞薄膜由选自骨髓来源的间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、脐带来源的间充质干细胞、胎盘来源的间充质干细胞中的至少之一形成。由此，可以进一步提高间充质干细胞面膜的抗衰老效果。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备上述实施例的间充质干细胞面膜的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
(a)提供基体；
(b)制备间充质干细胞薄膜：
利用液体培养基在培养皿中对间充质干细胞进行培养，以便形成单层细胞薄膜；所述培养皿包括本体和涂层，所述本体内限定有培养空间，所述涂层设置在所述培养空间的底部，其中，所述涂层的表面自由能不超过90mJ/m2；
使所述单层细胞薄膜处于剥离液中，所述剥离液中阳离子浓度低于所述液态培养基，所述阳离子包括钙离子和/或镁离子的至少之一；
从所述剥离液中，收集所述单层细胞薄膜；和
将多个所述单层细胞薄膜进行叠加，得到复合细胞薄膜；
(c)将所述复合细胞薄膜设置在所述基体的一侧表面，得到所述间充质干细胞面膜。
采用上述培养皿培养间充质干细胞时，尤其是采用液体培养基进行培养时，细胞在扩增过程中能够贴附在培养空间底部的涂层上，并且能够在该涂层上进行贴壁增殖。另外，鉴于该涂层的表面自由能不超过90mJ/m2，通过调整细胞液体培养基中的钙离子和/或镁离子浓度，可以使涂层与细胞之间的结合力降低，从而使贴壁培养的细胞能够从培养皿底部的涂层上以细胞薄膜的形式脱落，有效地获得单层细胞薄膜。发明人意外地发现，采用该方法能够快速地完成细胞薄膜与培养皿底部的脱离，通常在改变离子浓度后不超过1小时，例如不超过30分钟，诸如不超过20分钟，例如15分钟，就能够使得细胞薄膜与培养皿底部脱离。究其原因，可能是因为通过改变培养基中的离子浓度例如钙离子和/或镁离子的浓度，细胞黏着斑复合物跨膜受体的构型会随之改变，涂层与细胞之间的结合力会降低，从而可以实现在不经胰蛋白酶水解细胞间蛋白的情况下，就能够促使细胞从培养皿的底部表面脱离，得到完整的单层细胞薄膜。
进一步地，通过将多个单层细胞薄膜叠加得到复合细胞薄膜，并将其设置在基体的一侧表面，即可获得上述实施例间充质干细胞面膜。
另外，根据本发明上述实施例的制备间充质干细胞面膜的方法还可以具有如下附加的技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述涂层的表面自由能不超过60mJ/m2。由此，细胞薄膜从培养皿脱离的效果更佳。
在本发明的一些实施例中，所述涂层的厚度不低于2nm，但不超过100nm，优选不超过50nm，更优选不超过30nm，最优选不超过10nm。由此，细胞薄膜从培养皿脱离的效果更佳。另外，发明人发现，如果涂层的厚度超过300nm，细胞的生长会受到不利的影响。
在本发明的一些实施例中，所述涂层是由聚(2-乙烯吡啶-co-苯乙烯)嵌段共聚物形成的。由此，细胞薄膜从培养皿脱离的效果更佳。
在本发明的一些实施例中，所述涂层是通过对2-乙烯吡啶和苯乙烯进行固相沉积而形成的。
在本发明的一些实施例中，所述剥离液为不含钙离子和镁离子的缓冲液。
在本发明的一些实施例中，所述剥离液为DPBS。
在本发明的一些实施例中，采用PVDF膜进行收集所述单层细胞薄膜。
在本发明的一些实施例中，所述PVDF膜为星形-聚丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物亲水改性的PVDF膜。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明一个实施例的间充质干细胞面膜的结构示意图；
图2是根据本发明再一个实施例的间充质干细胞面膜的结构示意图；
图3是根据本发明一个实施例的星形-聚丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物的核磁共振氢谱；
图4是根据本发明一个实施例的星形-聚丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物的SEM图谱；
图5～8是根据本发明一个实施例的间充质干细胞面膜的面部整体修复作用测试结果；
图9～12是根据本发明一个实施例的间充质干细胞面膜的面部色斑消除作用测试结果；
图13～16是根据本发明一个实施例的间充质干细胞面膜的面部美白作用测试结果。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种间充质干细胞面膜。参考图1和2，根据本发明的实施例，该间充质干细胞面膜包括：基体1和间充质干细胞薄膜2。间充质干细胞薄膜2形成在基体1的一侧表面，间充质干细胞薄膜2包括层叠的多个单层间充质干细胞薄膜。
根据本发明的实施例，基体1的具体种类并不受特别限制，本领域技术人员可以根据实际需要，选择常用的面膜基体。
根据本发明的实施例，间充质干细胞薄膜包括层叠的2～3个单层间充质干细胞薄膜。由此，可以进一步提高细胞薄膜的韧性和坚固性。
根据本发明的实施例，间充质干细胞薄膜覆盖基体的一侧表面不低于70％的面积，具体的覆盖面积百分比例如可以为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％等。由此，可以保证间充质干细胞薄膜充分地覆盖面部，与皮肤充分接触。
根据本发明的实施例，间充质干细胞薄膜由选自骨髓来源的间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、脐带来源的间充质干细胞、胎盘来源的间充质干细胞中的至少之一形成。由此，可以进一步提高间充质干细胞面膜的抗衰老效果。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备上述实施例的间充质干细胞面膜的方法。总得来说，该方法包括提供基体、以及在基体的一侧表面设置间充质干细胞薄膜。如前所述，基体的具体种类并不受特别限制，可以选择常用的面膜基体。下面进一步对制备间充质干细胞薄膜的方法进行详细描述。
根据本发明的实施例，制备间充质干细胞薄膜的方法包括：利用液体培养基在培养皿中对间充质干细胞进行培养，以便形成单层细胞薄膜；培养皿包括本体和涂层，本体内限定有培养空间，涂层设置在培养空间的底部，其中，涂层的表面自由能不超过90mJ/m2；使单层细胞薄膜处于剥离液中，剥离液中阳离子浓度低于液态培养基，阳离子包括钙离子和/或镁离子的至少之一；从剥离液中，收集单层细胞薄膜；和将多个单层细胞薄膜进行叠加，得到复合细胞薄膜。
根据本发明的实施例，涂层的表面自由能优选不超过60mJ/m2。由此，细胞薄膜从培养皿脱离的效果更佳。
根据本发明的实施例，上述涂层的厚度不超过300nm。发明人在研究中意外地发现，涂层的厚度过大，并不利于其上细胞的生长。进一步地，涂层的厚度不低于2nm，但不超过100nm，优选不超过50nm，更优选不超过30nm，最优选不超过10nm。由此，细胞薄膜从培养皿脱离的效果更佳。
优选地，涂层由聚(2-乙烯吡啶-co-苯乙烯)嵌段共聚物形成。另外，涂层优选通过对2-乙烯吡啶和苯乙烯进行固相沉积而形成的。
根据本发明的实施例，上述剥离液为不含钙离子和镁离子的缓冲液。由此，剥离液降低细胞薄膜与培养皿之间结合力的效果更佳。更优选地，该不含钙离子和镁离子的缓冲液的pH为6.9～7.4，例如可采用市售DPBS缓冲液。
根据本发明的实施例，可以采用PVDF膜收集单层细胞薄膜。具体的，单层细胞薄膜从培养皿脱离后，可以采用PVDF膜将单层细胞薄膜吸附至表面，并根据实际需要，以生理盐水冲洗数遍。优选地，该PVDF膜为星形-聚丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物亲水改性的PVDF膜。由此，其对单层细胞薄膜的吸附效果更佳。
为便于理解，下面对上述星形-聚丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物亲水改性的PVDF膜进行详细描述。
星形-聚丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物(star-shaped PDMAEA)具有如式I所示的结构
式I中，R为n为15～105的正整数。该星形-聚丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物的聚合度在100～400之间，分子量在10,000～60,000道尔顿之间。发明人发现，星形-聚丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物中的长烷基链具有疏水性，与PVDF具有良好的相容性；而丙烯酸二甲氨基乙酯链段具有较高的亲水性，星形结构也有助于星形-聚丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物更牢固地固定在基质膜上，在改善亲水性的同时也增加了改性剂与PVDF膜结合的稳定性。由此，星形-聚丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物亲水改性的PVDF膜具有更高的亲水性、渗透性以及抗污性，在多次、长时间使用后仍具有较高的恢复性能。
根据本发明的一个具体实施例，星形-聚丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物的制备方法如下：
取适量引发剂偶氮二异丁腈与摩尔比为(60～420):1的丙烯酸二甲氨基乙酯和星形链转移试剂四支链2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(其结构如式II)溶解于50mL 2-丁酮中，采用冷冻-除气-解冻法除去反应容器内的氧气，并注入氮气或者氩气作为保护气，置于70～120℃的金属浴中搅拌反应4～20h；将所得聚合物溶液滴入己烷中，通过析出-沉淀法收集产物，所得到的产物经过旋蒸、真空干燥等步骤除杂并干燥至恒重，得到星形-聚丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物，其核磁共振氢谱如图3，SEM图谱如图4。
其中，R’为/>
后续，将制备得到的星形-聚丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物作为添加剂加入到PVDF铸膜液中，采用刮涂法制备的星形-聚丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物亲水改性的PVDF膜。具体方法包括：取50g PVDF、2g PVP、2.7g星形-聚丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物和适量DMF加入反应容器中，在70℃的金属浴中搅拌反应10～15h，然后置于60℃的真空烘箱中脱气8h，得到铸膜液。采用溶剂致相分离法制备PVDF平板膜，以水作为凝固浴，温度为室温，将铸膜液倒在干净的玻璃板上，使用自动刮膜机进行刮膜，刮刀厚150μm。将刮好的膜在空气中暴露30s后，放入凝固浴中直到其在玻璃板上脱落，将制好的膜(M-0、M-1、M-2、M-3和M-4)放入蒸馏水中浸泡，每12h换一次水，以除去膜中残留的溶剂和致孔剂，得到星形-聚丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物亲水改性的PVDF膜产品。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1
用于制备细胞薄膜的培养皿底部具有真空蒸发法制得的厚度为8nm的聚(2-乙烯吡啶-co-苯乙烯)嵌段共聚物涂层。
将该培养皿以辐照灭菌法进行充分灭菌后，用于体外细胞培养制备细胞薄膜。取P5以内的间充质干细胞，以含有10％胎牛血清，1％盘尼西林/链霉素，1％谷氨酰胺，1％非必须氨基酸的DMEM培养基在37℃，5％二氧化碳的环境下培养。待细胞培养至融合度达90％以上时，用胰蛋白酶将细胞消化后，以10,000个细胞/培养皿的密度接种于培养皿上，并以相同培养基以及条件继续培养细胞、待细胞生长增殖至融合度达95％以上时，移除培养基并以PBS清洗细胞薄膜，并加入DPBS使其完全覆盖细胞薄膜后，于室温下放置，待细胞薄膜自行脱落。将培养基替换为DPBS后的15min，细胞薄膜完全脱离细胞培养皿，并以完整单层薄膜的形式漂浮于DPBS溶液中，采用星形-聚丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物亲水改性的PVDF膜产品收集制备得到的单层细胞薄膜，并将三层单层细胞薄膜叠加后，设置在面膜基体上，得到间充质干细胞面膜。
测试例
(1)
对实施例1制备得到的间充质干细胞面膜进行面部整体修复作用测试。结果图5～8所示。结果表明，相对于对照组，随着受试者使用间充质干细胞面膜周数的增加，受试者面部的斑点、纹理、皱纹、毛孔均得到明显改善。(图5～8中，纵坐标为改善效果，图5～16中，横坐标均为使用周数)。
(2)
对实施例1制备得到的间充质干细胞面膜进行面部色斑消除作用测试。结果图9～12所示。结果表明，相对于对照组，随着受试者使用间充质干细胞面膜周数的增加，受试者面部的色斑、黄斑、紫外斑、红色区域均得到明显减少。
(3)
对实施例1制备得到的间充质干细胞面膜进行美白作用测试。结果图13～16所示。结果表明，相对于对照组，随着受试者使用间充质干细胞面膜周数的增加，受试者面部的美白效果明显。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (12)
1.一种制备间充质干细胞面膜的方法，其特征在于，包括：
(a)提供基体；
(b)制备间充质干细胞薄膜：
利用液体培养基在培养皿中对间充质干细胞进行培养，以便形成单层细胞薄膜；所述培养皿包括本体和涂层，所述本体内限定有培养空间，所述涂层设置在所述培养空间的底部，其中，所述涂层的表面自由能不超过90mJ/m2；
使所述单层细胞薄膜处于剥离液中，所述剥离液中阳离子浓度低于所述液体培养基，所述阳离子包括钙离子和/或镁离子的至少之一；
从所述剥离液中，收集所述单层细胞薄膜；和
将多个所述单层细胞薄膜进行叠加，得到复合细胞薄膜；
(c)将所述复合细胞薄膜设置在所述基体的一侧表面，得到所述间充质干细胞面膜；
其中，所述涂层的厚度不低于2nm，但不超过100nm；
所述涂层是由聚(2-乙烯吡啶-co-苯乙烯)嵌段共聚物形成的；
所述剥离液为不含钙离子和镁离子的缓冲液；
PVDF膜为星形-聚丙烯酸二甲氨基乙酯聚合物亲水改性的PVDF膜。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞面膜包括：
基体；
间充质干细胞薄膜，所述间充质干细胞薄膜形成在所述基体的一侧表面，所述间充质干细胞薄膜包括层叠的多个单层间充质干细胞薄膜。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞薄膜包括层叠的2～3个单层间充质干细胞薄膜。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞薄膜覆盖所述基体的一侧表面不低于70％的面积。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞薄膜由选自骨髓来源的间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、脐带来源的间充质干细胞、胎盘来源的间充质干细胞中的至少之一形成。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述涂层的表面自由能不超过60mJ/m2。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述涂层的厚度不超过50nm。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述涂层的厚度不超过30nm。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述涂层的厚度不超过10nm。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述涂层是通过对2-乙烯吡啶和苯乙烯进行固相沉积而形成的。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述剥离液为DPBS。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用PVDF膜进行收集所述单层细胞薄膜。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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