CN109321520A - 一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法及其产物应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，包括以下步骤：a）分离、提取和培养健康人脐带间充质干细胞；b）通过无血清重层化培养基对脐带间充质干细胞进行重层化培养。利用脐带间充质干细胞重层化培养的方法产物制备生物活性膜的方法，所述的产物包括培养上清及重层化细胞层，培养上清通过特殊的低温真空冻干技术制成活性因子；重层化细胞层与洁净膜组合制成生物活性膜。还公开了生物活性膜在制备生物学活性功能的产品的应用。本发明的有益效果是：可以获得高水平的活性因子和重层化细胞层。并且此方法通过特殊的低温真空冻干技术，获得活性因子纯度、稳定性更高，通过重层化细胞层与洁净膜结合可以制成生物活性膜。

Description

一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法及其产物应用
技术领域
本发明涉及一种细胞培养技术领域，特别涉及一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法及其产物应用。
背景技术
脐带间充质干细胞是一种分离自健康婴儿胎盘的成体干细胞。脐带间充质干细胞能够分泌许多细胞因子如EGF、bFGF、TGF-β、TGF-α、HGF、IGF、VEGF、KGF等及许多干细胞外泌体，还能分泌collagenⅠ和collagenⅢ。脐带间充质干细胞及其分泌活性因子在再生医学领域已经得到广泛的研究和应用。
脐带间充质干细胞是一种贴壁依赖性细胞，而且由于接触抑制，只能单层培养，传统的贴壁培养的制备工艺复杂，需要不断地进行传代，分泌的活性因子水平也较低。大大影响了脐带间充质干细胞及其活性因子的产品开发，而且传统的制备工艺均是在含血清、含抗生素的条件下进行，会引入许多风险因素，影响活性因子的纯度，给产品开发带来一系列的困难。
综上，现有技术存在如下技术问题：
一是细胞培养中获取的活性因子水平较低；
二是细胞培养过程中存在许多风险因素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，此方法在于通过特殊的无血清重层化培养基来培养脐带间充质干细胞，此方法培养的细胞能够分泌更高水平的活性因子，并且能够获得重层化的细胞层，大大提高使用率。
本发明的另一个目的在于提供一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，此方法为无血清和无抗生素培养，风险因素大大减小。
本发明的另一个目的在于一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，此方法通过特殊的低温真空冻干技术，获得活性因子纯度、稳定性更高，且重层化细胞层与洁净膜组合可以制成生物活性膜。
本发明的另一个目的在于一种脐带间充质干细胞重层化培养的产物在具有生物学活性功能的产品，如化妆品或保健品中应用，具有极高的社会及经济效益。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，包括以下步骤：
a)分离、提取和培养健康人脐带间充质干细胞；
b)通过无血清重层化培养基对脐带间充质干细胞进行重层化培养；
所述的步骤b)中，无血清重层化培养基由以下成分组成：DMEM/F12、PDGF-BB、bFGF、TGF-β1、EGF、转铁蛋白Transferrin和抗坏血酸；其中，PDGF-BB含量为50～100ng/mL；bFGF含量为0～50ng/mL；TGF-β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30ng/mL；转铁蛋白Transferrin含量为2.0～4.5mg/mL、抗坏血酸含量为10～100ng/mL；
所述的步骤b)中，重层化培养方法如下：将步骤a)中培养的融合度达到P2代脐带间充质干细胞更换成无血清重层化培养基进行培养，每隔2天换液，并收集上清，培养至第14～15天获取重层化培养细胞层。
优选地，
所述的步骤b)中，无血清重层化培养基由以下成分组成：DMEM/F12、80ng/mLPDGF-BB、20ng/mL bFGF、10ng/mL TGF-β1、10ng/mL EGF、3.0mg/mL转铁蛋白和100ng/mL抗坏血酸。
利用上述方法制得的产物制备活性因子和/或生物活性膜的方法，所述的产物包括培养上清及重层化细胞层，
所述的活性因子的制备方法如下：将获取的重层化培养细胞层的培养上清通过45μm的滤网过滤后，通过3kD的滤膜进行超浓缩至原上清体积的1/20，得到浓缩液，然后通过0.22μm滤网过滤后加入冻干赋型剂，通过1℃/min程序降温至-80℃凝固备用；将凝固样本进行抽真空，升华干燥，除去冰晶，最后制得冻干活性因子，-20℃保存；
所述的生物活性膜的制备方法如下：将获取的重层化培养细胞层用镊子掀起，防止蜷曲，平铺至洁净膜上，加入PBS，4℃保存，即得生物活性膜。
所述步骤b)中，冻干赋型剂为甘露醇、葡萄糖、海藻糖、蔗糖或乳糖中的至少一种，加入量为浓缩液的15～20％w/w，优选15％w/w。
所述的洁净膜是无纺布、蚕丝膜、天丝膜、生物纤维膜和超导膜中的一种。
所述的生产过程中不添加任何的血清和抗生素。
上述方法制备的活性因子在制备生物学活性功能的产品的应用。如化妆品或保健品中应用。
上述方法制备的生物活性膜在制备生物学活性功能的产品的应用。如化妆品或保健品中应用。
本发明中，
“活性因子”的定义为：具有生物学活性的因子，如EGF、bFGF、IGF、VEGF、HGF、TGF-β、PGE2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等细胞因子及干细胞分泌的外泌体等。
“具有生物学活性功能产品”的定义为：含有EGF、bFGF、IGF、VEGF、HGF、TGF-β、PGE2、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ等细胞因子及干细胞分泌的外泌体等生物活性因子且具备抗衰、护肤等功能的产品，如精华液、面膜等化妆品和保健品。
本发明通过独创的重层化培养体系，解决了现有技术存在的技术问题，并且带来如下技术效果：
1)通过特殊无血清重层化培养基培养脐带间充质干细胞，获得高水平的活性因子和重层化细胞层。
2)通过特殊的低温真空冻干技术，获得活性因子纯度、稳定性更高，通过重层化细胞层与洁净膜结合可以制成生物活性膜。
3)通过此方法生产的脐带间充质干细胞重层化培养在具有生物学活性功能的产品，如化妆品或保健品中应用，具有更高的社会及经济效益。
附图说明
图1为脐带间充质干细胞培养图。
图2为脐带间充质干细胞流式结果图；(左侧4个图为阳性指标流式峰图，第一个为CD90，第二个为CD73，第三个为CD105，第四个为CD29；右侧5个图为阴性指标流式峰图，第一个为CD45，第二个为CD34，第三个为CD79a，第四个为CD14，第五个为HLA-DR)。
图3为脐带间充质干细胞分化结果图；(最左侧上下两图为脐带间充质干细胞成骨分化图，上图为成骨分化，明显有骨生成，下图为对照图，明显无骨生成；中间上下两图为脐带间充质干细胞成脂分化图，上图为成脂分化，明显有脂肪颗粒生成，下图为对照组，明显无脂肪颗粒生成；最右侧上下两图为脐带间充质干细胞成软骨分化，上图为成软骨分化图，明显有软骨组织生成，下图为对照组，明显无软骨组织生成)。
图4为脐带间充质干细胞重层化培养图；(左侧图为重层化培养诱导Day0的脐带间充质干细胞状态；中间图为重层化培养诱导Day14的脐带间充质干细胞状态，明显可见有细胞重叠；右侧图为重层化培养后剥离出来的细胞层)。
图5a和图5b为脐带间充质干细胞重层化培养α‐SMA表达图；(图5a为重层化诱导指标流式检测的同型对照，排除抗体非特异性结合；图5b为重层化诱导的指标α‐SMA流式检测图，如图显示为高表达)。
图6a和图6b为活性因子分泌比较图；(图6a和图6b为脐带间充质干细胞重层化培养培养上清中细胞因子含量与传统单层培养比较；图6a为EGF、bFGF、IGF、VEGF、PGE2、CollagenⅠ、CollagenⅡ比较，如图显示，黑色柱子为传统贴壁方法培养的，白色柱子为重层化培养，重层化培养的上清细胞因子含量明显高于传统贴壁方法；图6b为HGF、KGF、TGF‐β较，如图显示，黑色柱子为传统贴壁方法培养的，白色柱子为重层化培养，重层化培养的上清细胞因子含量明显高于传统贴壁方法)。
图7a和图7b为HDF增殖实验结构图；(图7a为脐带间充质干细胞重层化培养后提取的干细胞活性因子对HDF细胞增殖的生长曲线，A组为重层化培养，B组为传统贴壁方法培养，C组为对照组，如图可见，A组对HDF的生长刺激作用最好；图7b为脐带间充质干细胞重层化培养后提取的细胞层对HDF细胞增殖的生长曲线，D组为重层化培养，E组为传统贴壁方法培养，F组为对照组，如图可见，A组对HDF的生长刺激作用最好)。
图8为实验前、实验后症状评分统计分析图。
图9a和图9b为皮肤肌理检测结果。(图9a为脐带间充质干细胞重层化培养后用细胞层制备的生物活性膜对受试者皮肤肌理的作用，左手为对照组，右手为实验组，如图可见，实验组皮肤肌理的VC值有明显的下调，皮肤肌理明显改善；图9b为脐带间充质干细胞重层化培养制备的活性因子对受试者皮肤肌理的作用，左手为对照组，右手为实验组，如图可见，实验组皮肤肌理的VC值有明显的下调，皮肤肌理明显改善)。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
实施例1
(一)脐带间充质干细胞分离培养及鉴定
“脐带间充质干细胞”分离培养的方法和培养基均参考中国专利，专利号为CN201010528733.4，公告号为CN101974484B，专利名称为“一种人脐带间充质干细胞的制备方法”。
按照此方法进行传代培养至P2代，取样进行流式及成骨、成脂、成软骨鉴定。
脐带间充质干细胞如图1所示，贴壁成梭状生长，状态良好。
流式分析项目有：CD73、CD90、CD105、CD29、CD14、CD34、CD45、CD79-α、HLA-DR。检测结果如图2所示，可以看出多次传代后细胞表面标记表达维持稳定，符合MSC检测标准。
将脐带间充质干细胞培养至融合度达到70～80％，分别换液成成骨诱导培养基、成脂诱导培养基、成软骨诱导培养基，进行培养。2～4周后，视细胞生长状态进行对成骨诱导的细胞进行茜素红染色；10～20天后，视细胞生长状态对成脂诱导的细胞进行油红O染色；21～28天后，视细胞生长状态对成软骨诱导的细胞进行固定，进行阿利辛蓝染色。
以上所用的诱导培养基及染色鉴定试剂盒均购自赛业生物科技有限公司，并按照成品说明书进行操作。
如图3所示，分离培养的脐带间充质干细胞均可以进行成脂、成骨、成软骨分化，具备间充质干细胞的特性。
(二)脐带间充质干细胞悬重层化培养
将P2代的脐带间充质干细胞按1*104/cm2的密度接种至10cm的培养皿中，用无血清培养基培养至细胞融合度达到90％以上。然后将培养基换成无血清重层化培养培养基，每隔2天换一次液，并收集旧培养上清液-20℃保存待处理，按以上方法培养至14-15天。
过程中无血清重层化培养培养基成分如下：DMEM/F12(invitrogen)、80ng/mLPDGF-BB(gibco)、20ng/mL bFGF(invitrogen)、10ng/mL TGF-β1(Peprotech)、10ng/mL EGF(gibco)、3.0mg/mL转铁蛋白(sigma)和100ng/mL抗坏血酸。
如图4所示，在重层化培养的第0天和第14天进行拍照，重层化培养的细胞呈多层细胞，并形成一个可以掀起的细胞层。
用流式方法检测重层化培养细胞的α-SMA的表达，如图5a和图5b所示，经过重层化培养的脐带间充质干细胞高表达α-SMA。
(三)制得活性因子并浓缩冻干
取重层化培养细胞层的培养上清液，用0.22μm的滤网过滤，然后用3kD的滤器进行超浓缩，将上清液浓缩至原体积的1/20，加入15％w/w的甘露醇。将此时的浓缩液通过程序降温设备进行程序降温，体系为1℃/min下降至-80℃。将凝固的浓缩液进行抽真空，升华干燥，除去冰晶，最后制得冻干活性因子，-20℃保存。
(四)制备生物活性膜
将重层化培养的细胞层用镊子轻轻掀起，平铺至直径10cm的洁净无纺布上，至于PBS中4℃保存待用。
(五)检测脐带间充质干细胞细胞因子分泌
对照组：取P3代的膜间充质干细胞用无血清培养基培养，待达到90％的融合度，将细胞破解，收集细胞裂解物及上清，离心去沉淀。
实验组：取重层化培养的细胞，用无血清重层化培养培养基培养3天，将细胞破解，收集细胞裂解物及上清，离心去沉淀。
检测项目：通过Elisa法检测对照组和实验组上清EGF、bFGF、IGF、VEGF、HGF、TGF-β、PGE2、KGF、collagenⅠ和collagenⅢ含量。
如图6a和图6b结果所示，脐带间充质干细胞重层化培养比传统培养方法活性因子分泌水平大大提高。
以下为脐带间充质干细胞重层化培养产物的生物学特性及安全性检测
(1)HDF增殖活力实验
HDF为人皮肤成纤维细胞，本实验意在验证利用本发明的脐带间充质干细胞重层化培养产物制成的活性因子和生物活性膜对HDF体外培养的刺激，间接反映其对皮肤的可能的毒性及激活效果。
传统培养的脐带间充质干细胞上清和重层化培养上清均按实施例1步骤(三)进行冻干操作获得活性因子。
A组(活性因子HDF增殖活力实验)：取HDF细胞分成三组：实验组A、实验组B、阴性对照组C，每组分0H、6H、12H、24H四个96孔板，同时接种相同细胞量的HDF细胞每孔200μL，用DMEM/F12加上10％的FBS进行培养。实验组A加入50μg/mL的重层化培养细胞活性因子，实验组B加入等量的传统培养脐带间充质干细胞活性因子，阴性对照组C则加入等体积的生理盐水。分别分0H、6H、12H、24H四个时间点取样检测，每到时间点，则取相应的培养板出来，加入20μL WST1，37℃孵育4H，然后在450nm波长下测定吸光值，最后将数据收集分析。
B组(生物活性膜HDF增殖活力实验)：取HDF细胞分成三组：分实验组D、实验组E、阴性对照组F，每组分0H、6H、12H、24H四个96孔板，实验组D铺上重层化培养制成的生物活性膜，实验组E接种P2代的脐带间充质干细胞，培养至细胞融合度达到90％以上，然后与阴性对照组F同时接种等量的HDF细胞，分别分0H、6H、12H、24H四个时间点取样检测，每到时间点，则取相应的培养板出来，加入20μL WST1，37℃孵育4H，然后在450nm波长下测定吸光值，最后将数据收集分析。
如图7a和图7b结果所示，通过脐带间充质干细胞活性因子及脐带间充质干细胞、生物活性膜对HDF无毒性，甚至能够刺激其增殖，重层化培养获得的活性因子及生物活性膜对HDF增殖刺激的能力更强。
(2)脐带间充质干细胞重层化培养产物急性经口毒性实验
采用一次限量法证实其对生物体的经口安全性。选取50只体重一致(25+5g)的昆明鼠，用1mg实施例1步骤(三)制得的重层化培养活性因子及1mg生物活性膜进行灌胃处理，观察其毒性，观察周期为14天。
观察结果：14天内没有观察到动物异常反应或死亡，说明脐带间充质干细胞重层化培养产物无经口毒性。
(3)脐带间充质干细胞重层化培养产物急性经皮毒性实验
采用一次限量法证实其对生物体的经皮安全性。用50只裸鼠，体重为20+1g，其中25只涂抹5mg/kg体重剂量的实施例1步骤(三)制得的重层化培养活性因子水溶液，另外25只在背部敷上4cm2的生物活性膜，并给裸鼠戴上适合的头套，不影响进食的情况下，防止其破环生物活性膜，分别进行14天的毒性观察。
观察结果：无发现动物有异常反应或死亡，说明脐带间充质干细胞重层化培养产物无经皮毒性。
实施例2
(1)重层化来源脐带间充质干细胞活性因子对面部脂溢性皮炎症的作用
招募20名患有面部脂溢性皮炎症的志愿者，先按照评分表(见表2)给症状评分。然后给每人分发7份实验套装，每份套装包括7支50μg脐带间充质干细胞活性因子(实施例1步骤(三)制得的)，7瓶20mL去离子水，7片干面膜(无添加)。套装使用方法为：用20mL去离子水在干净容器里溶解50μg脐带间充质干细胞活性因子，将干面膜浸泡在其中，放置5分钟后在脸上敷30分钟，脸部不做清水洗涤之外的任何处理。让10名志愿者连续7个晚上按照实验方案敷面膜，7天后重新给志愿者脸部症状评分。通过评分分析来研究重层化来源脐带间充质干细胞活性因子对面部脂溢性皮炎症的作用。
表2：脸部症状评分表
症状 评分
毛孔：细致 0
毛孔放大 1
毛孔堵塞 2
粉刺 3
油脂：少量 0
用吸油纸测试有油印 1
油脂分泌多，用吸油纸测试有深油印 2
痤疮：无 0
偶尔会出现少量，恢复快 1
有持续出现的烦恼 2
大面积出现，恢复慢 3
红疹：无 0
少量，自行消退 1
成片，难以自行消退 2
痂屑：无 0
少量痂屑 1
大量痂屑 2
如图8结果所示，经过7天的使用，总体评分都下降，说明重层化来源的脐带间充质干细胞活性因子对面部脂溢性皮炎症具有明显的改善作用。
(2)活性因子和生物活性膜的皮肤肌理实验
取实施例1制成的脐带间充质干细胞活性因子(实施例1步骤(三)制得的)按100μg溶解于10mL去离子水中的比例进行配置，制成实验试剂。
招募20名志愿者，在受试者的左右手手臂划定一块3cm*3cm大小的区域。将受试者右手区域作为实验组，左右区域为对照组。实验组：每天早晚对实验区域进行简单清洗后，均匀涂抹实验试剂；对照组：每天早晚对实验区域进行简单清洗后，均匀涂抹去离子水。两组均进行30天操作，在第0天(未处理)、第2天、第5天、第10天、第12天、第15天、第18天、第20天、第25天、第30天进行检测。在以上时间点用硅橡胶对实验区域取样进行肌理分析，用激光对复制表面的凹凸进行精密的三维测量。再用图像分析法对试验区域的皮沟的异向性(VC1)。
在以上志愿者左右手手臂划定另一块3cm*3cm大小的区域，右手区域作为实验组，左右区域为对照组。实验分8个取样点，分别为第0天(未处理)、第1天、第5天、第10天、第15天、第20天、第25天、第30天。在第二个取样点开始，每个取样点实验前14天开始制备重层化细胞层，获得的细胞层铺在无纺布上制3cm*3cm的膜块。到取样点前一天晚上睡觉前将细胞层敷在实验组右手臂的划定区域内，敷30min。对照组用去离子纯净水代替细胞层敷于左手臂划定区域内。在以上时间点用硅橡胶对实验区域取样进行肌理分析，用激光对复制表面的凹凸进行精密的三维测量。再用图像分析法对试验区域的皮沟的异向性(VC1)。
图9a和图9b为皮肤肌理检测结果，如图所示，使用30天后皮肤的异向性明显下降，皮肤纹理更平滑，说明此发明的方法制成的脐带间充质干细胞活性因子及生物活性膜对皮肤肌理有明显的改善作用。
实施例3
(一)脐带间充质干细胞活性因子精华乳液配方如下：
制备方法如下：
1)将脐带间充质干细胞活性因子100μg溶解于10mL溶液中，所述的溶液中的成分及成分含量如下：海藻糖2％w/v，酯化左旋维生素C 7.5％w/v，酯化维生素E 7.5％w/v，维A酸1％W/V，荷荷巴油1％，三乙醇胺5％w/v，卡波姆4％，去离子水70％w/v，羟基苯甲酸酯1％w/v，透明质酸钠0.2％w/v，玫瑰精油1％w/v，薄荷乳酸酯1％w/v。
2)在8～10℃环境下乳化36h，静置12h后制得终产品，转移至洁净的10mL按压瓶中。
(2)生物活性面膜制作方法如下：
按照实施例1制备重层化的细胞层，平铺至蚕丝面膜上，加入精华液20mL，真空密封包装，4℃保存。
上述精华液的配方如下：
综上所述，用所述方法制备的脐带间充质干细胞重层化培养产物在生物活性上具有比传统工艺更好的结果，而且通过各种毒性测试，可以看出脐带间充质干细胞重层化培养产物对口服、皮肤均无毒性。且对面部脂溢性皮炎症和皮肤肌理均有明显的改善作用。使用此发明的方法制成的重层化脐带间充质干细胞活性因子和细胞层制成一种精华液和面膜，具有显著的补水、保水和修复皮肤的作用。
以上所述仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限于上述实施方式，凡是属于本发明原理的技术方案，均属于本发明的保护范围。对于本领域的技术人员而言，再不脱离本发明的原理的前提下进行的若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a）分离、提取和培养健康人脐带间充质干细胞；
b）通过无血清重层化培养基对脐带间充质干细胞进行重层化培养；
所述的步骤b）中，无血清重层化培养基由以下成分组成：DMEM/F12、PDGF-BB、 bFGF、TGF-β1、EGF、转铁蛋白Transferrin和抗坏血酸；其中，PDGF-BB含量为50～100 ng/mL；bFGF含量为0～50 ng/mL；TGF-β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30 ng/mL；转铁蛋白Transferrin含量为2.0～4.5 mg/mL、抗坏血酸含量为10~100 ng/mL；
所述的步骤b）中，重层化培养方法如下：将步骤a）中培养的融合度达到P2代脐带间充质干细胞更换成无血清重层化培养基进行培养，每隔2天换液，并收集上清，培养至第14~15天获取重层化培养细胞层。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤b）中，无血清重层化培养基由以下成分组成：DMEM/F12、80ng/mL PDGF-BB、20ng/mL bFGF、10ng/mL TGF-β1、10ng/mLEGF、3.0mg/mL转铁蛋白和100 ng/mL抗坏血酸。
3.利用权利要求1或2所述方法制得的产物制备活性因子和/或生物活性膜的方法，所述的产物包括培养上清及重层化细胞层，
所述的活性因子的制备方法如下：将获取的重层化培养细胞层的培养上清通过45μm的滤网过滤后，通过3kD的滤膜进行超浓缩至原上清体积的1/20，得到浓缩液，然后通过0.22μm滤网过滤后加入冻干赋型剂，通过1℃/min程序降温至-80℃凝固备用；将凝固样本进行抽真空，升华干燥，除去冰晶，最后制得冻干活性因子，-20℃保存；
所述的生物活性膜的制备方法如下：将获取的重层化培养细胞层用镊子掀起，防止蜷曲，平铺至洁净膜上，加入PBS，4℃保存，即得生物活性膜。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤b）中，冻干赋型剂为甘露醇、葡萄糖、海藻糖、蔗糖或乳糖中的至少一种，加入量为浓缩液的15~20% w/w。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的洁净膜是无纺布、蚕丝膜、天丝膜、生物纤维膜和超导膜中的一种。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的生产过程中不添加任何的血清和抗生素。
7.根据权利要求3-6任意一种方法制备的活性因子在制备生物学活性功能的产品的应用。
8.根据权利要求3-6任意一种方法制备的生物活性膜在制备生物学活性功能的产品的应用。
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